核型多角體病毒生活周期及宿主抗病毒反應(yīng)的研究進展

況文東，占智高，王金昌，關(guān)麗梅，李江懷，靳 亮

(江西省科學(xué)院微生物研究所，330096，南昌)

0 引言

核型多角體病毒屬于桿狀病毒科 (Baculoviridae)，絕大多數(shù)核型多角體病毒屬于 alpha桿狀病毒屬 (Baculovirus)，該病毒屬可分為2組(group I、group II)(圖 1)[1]，是無脊椎動物的致病性病毒，廣泛分布于環(huán)境中[2]。核型多角體病毒是一類有囊膜的病毒，基因組為雙鏈環(huán)狀 DNA 病毒，大小為80～180 kb，大多數(shù)NPV的包涵體(occlusion body, OB)大約0.6～3 μm[2]。核型多角體病毒的主要宿主為鱗翅目昆蟲幼蟲，隨著日齡增大而抵抗力增強。此外，少數(shù)NPV也感染雙翅目和膜翅目昆蟲幼蟲。

圖1 桿狀病毒進化樹分析，基于37個桿狀病毒核心基因的氨基酸序列

在核型多角體病毒感染周期中，產(chǎn)生2種不同表型的子代病毒，芽生型病毒(budded virion，BV)和包涵體來源的病毒(occlusion-derived virion，ODV)(圖2)。BV和ODV基因組相同，但是核衣殼以及囊膜有所不同。BV可導(dǎo)致昆蟲組織間(氣管上皮、血細胞、中腸上皮、脂肪體等)病毒的傳播，昆蟲間的傳播主要通過未感染昆蟲食用被ODV污染的食物所致[3]。BV病毒在細胞培養(yǎng)中早在12～18 hpi就大量產(chǎn)生[4]。在感染后期，許多核衣殼被保留在核內(nèi)，隨后被核膜衍生膜包裹[5]。這些新包被的ODV病毒在細胞核被包裹在多角體蛋白中，并結(jié)晶形成包涵體(Occlusion Bodies，OB)。每個苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicamulticapsid nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)ODV病毒通常含有多個(約5～25)核衣殼[6]。因此，一個 AcMNPV OB 可能攜帶數(shù)百個核衣殼。在昆蟲感染后期，細胞溶解后，昆蟲尸體發(fā)生液化，被感染的細胞釋放出OBs。昆蟲尸體液化是一個至少由2種病毒編碼的酶(幾丁質(zhì)酶和組織蛋白酶)介導(dǎo)的過程，該酶催化昆蟲外骨骼的分解和OBs釋放到環(huán)境中[7-8]，被昆蟲食用后，開始一個新的感染循環(huán)。在利用昆蟲細胞培養(yǎng)時，BV和ODV都可以產(chǎn)生，但由于ODV病毒在細胞系中的感染能力有限，所以細胞間的感染是由BV病毒引起的[9]。目前還沒有合適的模擬體內(nèi)中腸細胞感染的培養(yǎng)系統(tǒng)，因此ODV的感染實驗通常是在昆蟲體內(nèi)進行的[10]。

圖2 NPV包涵體(OB)、包涵體病毒(ODV)和芽生型(BV)結(jié)構(gòu)示意圖

ODV嵌入蛋白質(zhì)晶體基質(zhì)中形成OB；ODV和BV包膜及其核衣殼含有許多蛋白質(zhì)。主要核衣殼蛋白VP39構(gòu)成核衣殼，存在于整個核衣殼中。VP78/83位于核衣殼的一端。融合蛋白GP64(NPV I組)或F蛋白(NPV II組)在整個BV包膜中都有發(fā)現(xiàn)，但在一端(可能是錐形端)可發(fā)生聚集[11]。

NPV在農(nóng)業(yè)和林業(yè)生產(chǎn)中，主要用作生物殺蟲劑，在國內(nèi)作為生物農(nóng)藥登記的數(shù)量有64種，分別是：甜菜夜蛾核型多角體病毒(10種)、斜紋夜蛾核型多角體病毒(12種)、棉鈴蟲核型多角體病毒(29種)、甘藍夜蛾核型多角體病毒(6種)、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(7種)；在基因工程研究中，NPV還可以作為蛋白表達載體(Bacmid 系統(tǒng))，可以有效地表達干擾素、抗原等外源蛋白[12]。此外，NPV還有一個非常重要的特性：它可以將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到哺乳動物細胞中，但本身并不復(fù)制[13-16]。這使得NPV在基因治療及哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的構(gòu)建中具有重要的應(yīng)用前景。但在實際應(yīng)用過程中，還存在許多的問題，比如：絕大多數(shù)NPV病毒的宿主譜比較窄，拓寬NPV的宿主譜可以使NPV成為更加有效的生物殺蟲劑；此外，NPV感染哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率有待進一步的提高。這些問題的解決都有賴于對NPV生物學(xué)特性的詳細了解，比如：細胞(吸附和)入侵等生活周期的詳細機制。本文對NPV生活周期(入胞、入核、復(fù)制、表達、組裝和出芽)的不同階段逐一進行討論，并介紹宿主抗病毒反應(yīng)的最新研究進展；最后，提出一些在未來的研究過程中需要解決的一些問題。

1 核型多角體病毒的生活周期

1.1 侵入細胞過程

1.1.1 ODV入侵 ODV病毒特異性結(jié)合昆蟲中腸上皮細胞，多角體蛋白是ODV在環(huán)境中(紫外，干燥)保持穩(wěn)定的主要原因。OB的表面覆蓋一層由碳水化合物和蛋白質(zhì)組成的外層，OB在昆蟲中腸堿性環(huán)境中發(fā)生降解釋放ODV，OB中含有一種金屬蛋白酶VEF，它可以破壞昆蟲腸道周圍營養(yǎng)基質(zhì)形成的生理屏障并提高感染效率[17-18]。ODV病毒通過直接與微絨毛膜融合進入中腸上皮細胞[19-20]。ODV包膜含有至少13種完整的膜蛋白。其中9個膜蛋白與病毒入胞有關(guān)，這些蛋白統(tǒng)稱為經(jīng)口感染因子(perosinfectivity factor, PIF)。目前認為，病毒的PIF參與ODV與中腸微絨毛膜結(jié)合和融合。第一個發(fā)現(xiàn)對口腔感染和可能的受體相互作用重要的ODV包膜蛋白是 p74 (ac138)，PIF 的缺失會導(dǎo)致病毒無法經(jīng)口感染，但是不影響ODV病毒的裝配或?qū)DV病毒組裝成OB，且不影響B(tài)V的產(chǎn)生或傳染性，多種PIF蛋白可以形成穩(wěn)定的復(fù)合物，并具有蛋白酶抗性，使其在富含蛋白酶的腸道環(huán)境中發(fā)揮作用[21-25]。但是關(guān)于PIF蛋白介導(dǎo)病毒侵入宿主細胞的具體機制還有待進一步的研究。

1.1.2 BV入侵 BV和ODV囊膜脂質(zhì)體成分差異非常大，這提示這2種類型病毒獲得囊膜和入胞途徑有所不同。ODV侵入中腸上皮細胞以后，出芽產(chǎn)生BV病毒，進入昆蟲的血淋巴循環(huán)，感染其它細胞。不同的NPV BV可以通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(clathrin-mediated endocytosis (CME))、膜融合(direct membrane fusion (DMF))、胞飲作用中的一種或者多種方法入胞[26]。AcMNPV主要通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用感染昆蟲，在這個過程中肌動蛋白介導(dǎo)病毒內(nèi)化，微管負責包裹病毒早期內(nèi)體的移動[12]。在感染過程中還有少部分(約10%)AcMNPV的囊膜可以直接和細胞質(zhì)膜融合，而后侵入細胞[27]。家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus, BmNPV)BV病毒進入細胞質(zhì)后，在內(nèi)體的病毒可能通過內(nèi)體分選復(fù)合物(the endosomal sorting complex required for Transport，ESCRT)[28]和N-乙基馬來酰亞胺敏感因子蛋白(N-ethylmaleimide sensitive factor protein，NSF)[29]，進一步深入細胞質(zhì)中，隨后包含病毒的內(nèi)體發(fā)生酸化，內(nèi)吞的病毒囊膜和細胞膜發(fā)生融合，釋放核衣殼至細胞質(zhì)中[30]。細胞OB的包膜與ODV的包膜有所不同，BV特異性包膜糖蛋白是GP64或F蛋白。GP64是病毒進入細胞的必要條件[31]，另外2種BV包膜蛋白(ODV-e25(Ac94)和ODV-e18(Ac143))對BV的感染性也非常重要[32]。GP64是一種III類病毒膜融合蛋白，在NPV中高度保守，只存在于alpha桿狀病毒group I中(AcMNPV、CfMNPV和OpMNPV)。GP64通過二硫鍵形成三聚體，與宿主細的胞磷脂雙分子層細胞膜相互作用，介導(dǎo)病毒入胞。其他的BV包膜蛋白(F樣蛋白、v-ubi、gp37和BV/ODV-e26)可能影響B(tài)V的產(chǎn)生水平，但對于BV的感染性不是必須的。F蛋白主要發(fā)現(xiàn)于alpha桿狀病毒group II NPV (SEMNPV、HzSNPV和 LdMNPV)，它的功能與GP64類似，但在結(jié)構(gòu)上有顯著差異。在group I中也發(fā)現(xiàn)F蛋白編碼基因，但通常認為它不再作為這些病毒的融合蛋白發(fā)揮作用。在AcMNPV中敲除AcMNPV F-like蛋白基因 (ac23)對BV的產(chǎn)生或BV的感染性存在爭議[33-34]，但會影響ODV的包涵體形成和致病性[35]。在group II NPV中，F(xiàn)基因敲除會導(dǎo)致病毒感染性的喪失。BV入胞需要GP64和F蛋白，但是它們結(jié)合的受體還是未知的。有一部分研究證明BV的入胞過程不需要蛋白質(zhì)受體，因為研究發(fā)現(xiàn) NPV 可以結(jié)合不含蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體[2]。

1.2 入核過程

NPV 核衣殼在肌動蛋白的幫助下到達核孔，與核孔復(fù)合物發(fā)生相互作用，并通過核孔。BmNPV核衣殼從內(nèi)體釋放后，核衣殼結(jié)構(gòu)蛋白P78/83 (Ac9)在BV/ODV-c42 (orf101; c42)的介導(dǎo)下入核，募集細胞Arp2/3，促進肌動蛋白聚合，隨后肌動蛋白細胞骨架發(fā)生變化，推動核衣殼[36-37]。Fang的工作提示病毒蛋白Ac132的NEBU結(jié)構(gòu)域可穩(wěn)定F-肌動蛋白，這可能附著在核衣殼上，然后將核衣殼推入細胞核[3]。此外，研究表明宿主蛋白importin-β也參與了該過程。ODV中多個核衣殼釋放到細胞質(zhì)中以后，在肌動蛋白引導(dǎo)下，將核衣殼運輸?shù)郊毎烁浇黐38]。ODV和BV核殼體與核孔復(fù)合物 (NPC) 的相互作用及穿過核孔的過程類似[11, 39]。ODV進入細胞的多個核衣殼，一部分還可以快速中腸上皮細胞的基底膜，與GP64組裝形成BV，進入血腔，感染其它細胞。這一過程顯著縮短了BV的產(chǎn)生時間，提高了病毒感染效率[40]。NPV是研究大分子入核的理想模型，對該過程的解析將有助于了解NPC的轉(zhuǎn)運機制，同時對于NPV的防治及作為殺蟲劑的利用都將奠定重要的理論基礎(chǔ)[41]。

1.3 病毒基因組復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程

病毒DNA入細胞核后，病毒復(fù)制開始于細胞核中心附近形成病毒性基質(zhì)。這是病毒DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制以及核衣殼裝配的位點。NPV基因表達主要受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄過程可以分為：早期、晚期和極晚期轉(zhuǎn)錄。每個階段基因復(fù)制和表達依賴于前一階段基因的表達，早期基因擁有能被宿主RNA聚合酶II識別的啟動子功能序列，其表達產(chǎn)物(RNA聚合酶)參與或調(diào)控病毒基因的復(fù)制和晚期基因的表達[42]。早期基因的表達對于病毒DNA復(fù)制和晚期基因的表達是必須的，而晚期基因主要表達病毒結(jié)構(gòu)蛋白[43]。DNA復(fù)制后期(感染后6-18 h)，核衣殼開始組裝。NPV單鏈DNA結(jié)合蛋白LEF-3含有一個介導(dǎo)其核輸入的NLS，在該過程中，LEF-3可以促進蛋白p143入核，使p143發(fā)揮解螺旋作用促進DNA復(fù)制。AcMNPV DNA聚合酶在病毒DNA復(fù)制過程中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用，其N端(氨基酸位點1-186)motif在桿狀病毒科中非常保守，對于DNA聚合酶發(fā)揮功能是必須的[44]。包膜蛋白BV/ODV-e26的缺失可以導(dǎo)致DNA復(fù)制水平的降低[45]。

NPV的DNA結(jié)合蛋白DBP對于病毒基因轉(zhuǎn)錄也非常重要[46]。研究發(fā)現(xiàn)orf61缺失使病毒早期基因lef-3、晚期基因vp39及極晚期基因p10的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降[47]。Fang等發(fā)現(xiàn)，AcMNPVac124缺失會導(dǎo)致病毒幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)錄水平的顯著降低[48]。在體外翻譯系統(tǒng)證明，極晚期基因p10 5′UTR對于翻譯起始非常關(guān)鍵。利用帽類似物不抑制p10 5′UTR驅(qū)動的翻譯，表明極晚期的NPV mRNA以不依賴帽的方式翻譯[49]。此外，Ranjan等對AcMNPV mRNA起始翻譯的序列進行分析，發(fā)現(xiàn)該病毒mRNA翻譯起始位點附近的序列為 aag/ta/tat/aa/cAAaATGaa/ct/ag/aAan，同經(jīng)典的Kozak (GCC)GCCA/GCCATGG差異非常大[50]。

1.4 病毒組裝和出芽過程

1.4.1 ODV組裝和出芽過程 NPV 基因組入核后，在核中進行DNA復(fù)制和表達，核衣殼在細胞核的病毒發(fā)生基質(zhì)中進行組裝，然后轉(zhuǎn)運到核周邊的電子發(fā)光區(qū)，轉(zhuǎn)運過程需要核肌動蛋白和核衣殼蛋白 AC102、VP80 (Ac104)、P78/83 (Ac9)、VP1054 (Ac54)和BV/ODV-C42 (Ac101)的參與[51-53]。在該區(qū)核衣殼組裝成BV或者ODV，具體的機制未知。據(jù)估計，97%的基因組DNA組裝成ODV或者保留在細胞核，另一部分DNA則出芽后形成BV。AcMNPVac83基因上的順式作用原件對核衣殼組裝至關(guān)重要[25]。ODV在病毒蛋白Ac76、Ac75和Ac93等的介導(dǎo)下披上內(nèi)核膜或者外核膜[5, 54]，而后運送到核中指定位置，在多角體蛋白的包裝下，形成包涵體。病毒蛋白質(zhì)Ac76、Ac75和Ac93也是核衣殼從核中穿梭至細胞質(zhì)中最終形成BV所必需的。ODV中核衣殼的數(shù)量受到病毒基因型及宿主細胞類型的影響。ODV與多角體蛋白結(jié)合后，隨后在病毒周圍結(jié)晶[2]。NPV的OB大小及ODV數(shù)量是受病毒種類影響的。成熟的OB外層由碳水化合物和Ac131組成，最外層的形成，有賴于功能性p10蛋白和細胞核纖維結(jié)構(gòu)。如果Ac131或者p10缺失，將導(dǎo)致OB失去最外層結(jié)構(gòu)，OB會變得不規(guī)則，且易碎[55-56]。從AcMNPV基因組中敲除GP41 (ac80)，病毒不再形成BV并且不再組裝ODV，這表明該基因在桿狀病毒病毒體形態(tài)發(fā)生中也發(fā)揮重要作用[57]。關(guān)于包涵體的形成過程，還有很多未解之謎：1)ODV的數(shù)量受什么調(diào)控；2)多角體蛋白結(jié)晶的觸發(fā)機制；3)結(jié)晶過程的調(diào)控機制。這些問題的解決使我們對NPV的生活周期有更加深刻的了解，同時豐富的病毒學(xué)領(lǐng)域關(guān)于病毒生活周期的理解，也為NPV的防治及利用提供大量理論基礎(chǔ)。

1.4.2 BV組裝和出芽過程 在核中組裝的核衣殼，大部分組裝成ODV，少部分出核形成BV。盡管核衣殼選擇性形成ODV或BV的具體機制不詳，但是推測可能與ODV和BV核衣殼上特異性的蛋白質(zhì)有關(guān)。研究表明NPV核心基因38K(Aac98)編碼的鹵酸脫鹵素酶同源物通過介導(dǎo)P6.9 (Ac100) 的C末端的5個特定位點的去磷酸化參與核衣殼裝配[58]。研究表明，BV核衣殼的泛素化水平高于ODV的核衣殼，推測，泛素化是一個出核信號。泛素化位點可能主要存在于Ac66蛋白中。缺失Ac66和病毒的E3泛素連接酶Ac141，病毒無法出核。orf61基因敲除后將會導(dǎo)致病毒核衣殼不能從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中，導(dǎo)致病毒粒子(BV)不能裝配[47]。Li等報道Hsp90可以通過促進核肌動蛋白聚合來幫助BV從細胞核穿梭到細胞質(zhì)中[59]。AcMNPV BV 核衣殼蛋白Ac51缺失不會中斷核衣殼組裝和包涵體來源的病毒 (ODV) 形成，但是會阻礙核衣殼的出核，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染細胞上清液中的BV產(chǎn)生顯著降低[60]。透射電鏡的觀察結(jié)果顯示，BV離開細胞核主要是通過出芽方式。BV出芽獲得雙層核膜后，進入細胞質(zhì)以后，BV核衣殼脫去核膜，在肌動蛋白的推動下，向質(zhì)膜方向移動。通過ESCRT途徑[28]，BV到達出芽位點，病毒囊膜蛋白GP64和ME53 (Ac140)等蛋白的作用下發(fā)生出芽，出芽后，游離的BV可以進行下一輪細胞感染。

2 宿主抗病毒反應(yīng)

昆蟲對NPV的免疫反應(yīng)可分為2個階段：一是消化道對ODV的防御；二是脂肪體、氣管和血細胞等其他組織對BV的防御。在感染初期，家蠶中腸內(nèi)合成抗病毒蛋白脂肪酶 Bmlipase-1，并分泌到腸道液中，抑制BMNPV復(fù)制，具體機制尚不清楚[61]。在昆蟲，RNAi 通路通常被認為是一種抗病毒天然免疫。在轉(zhuǎn)基因RNAi家蠶中表達病毒基因dsRNA可以抑制BmNPV的復(fù)制[62]。Ponnuvel等報道AcMNPV可以通過降低Sf9細胞內(nèi)豐富的miRNAs 促進自身的復(fù)制，并推測該過程是通過下調(diào)宿主蛋白Ran介導(dǎo)的[63]。此外，過表達家蠶 miRNA bmo-miR-2819可以下調(diào)BmNPV IE-1水平從而抑制病毒感染，病毒感染后可以通過未知機制下調(diào)以bmo-miR-2819，從而拮抗宿主的抗病毒反應(yīng)[64]。家蠶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶通過增加ATGs表達來抑制BmNPV的增殖，BmNPV拮抗這條抗病毒的機制尚不明確[65]。BmNPV感染后可以導(dǎo)致cGAMP水平的上升，促進干擾素基因刺激因子(STING)介導(dǎo)的 NF-κB活性的增強，促進抗病毒基因的表達[66]。Liu等用脂多糖、肽聚糖、葡聚糖和NPV刺激家蠶，發(fā)現(xiàn)中腸和脂肪體中小休克蛋白sHSP21 mRNA水平明顯上升，提示該蛋白可能參與家蠶抗病毒天然免疫[67]。最近日本科研人員發(fā)現(xiàn)，在中國家蠶中發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因p53 的同源基因Bm-p53，并且發(fā)現(xiàn)該基因可以通過促進家蠶的凋亡而參與抗NPV過程中[68]。家蠶ser/thr蛋白磷酸酶2A (PP2A)被報道具有抗BmNPV的活性[69]。受體酪氨酸激酶 (RTK) 拮抗蛋白Spry可以負調(diào)控ERK信號通路，Guo等發(fā)現(xiàn)家蠶中Spry也具有抗病毒活性，BmNPV 感染家蠶后，會導(dǎo)致BmSpry表達水平下降p-ERK水平上升，從而拮抗該蛋白的抗病毒活性[70]。此外，JAK/STAT信號通路對于果蠅的抗病毒反應(yīng)也是非常重要的，BmNPV感染家蠶后可以引起該信號通路的激活，具體的抗病毒機制還有待進一步的研究[71-72]。

上述抗病毒研究為家蠶抗病毒藥物的研發(fā)提供潛在靶點。Li等用NPC1拮抗劑(丙咪嗪或U18666A)預(yù)處理家蠶胚胎細胞，可以顯著下調(diào)家蠶細胞NPC1的表達，可以有效阻止病毒進入細胞[73]。以PI3K-Akt為靶點的商業(yè)化合物，并選擇以下7種口服藥物進行進一步分析：afuresertib、AZD8835、AMG319、HS173、AS605240、GDC0941和BEZ235。這些候選藥物可以有效抑制BmNPV在BmE細胞中病毒基因的表達。其中，AMG319和AZD8835能有效抑制病毒在家蠶幼蟲中的復(fù)制，提示這2種藥物在家蠶的抗病毒反應(yīng)中具有一定的應(yīng)用潛力[74]。

3 結(jié)束語

近幾年隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和高通量分析技術(shù)手段的不斷涌現(xiàn)，人們對于NPV與宿主的相互作用有了更深、更廣的認識，使得人們在NPV的病毒學(xué)研究、免疫學(xué)研究、細胞生物學(xué)研究等領(lǐng)域取得了豐碩的成果。為了更好地防治和利用NPV，圍繞該病毒的生活周期，仍需對以下幾個方面進行更加深入的研究：1)NPV 配體及細胞受體的鑒定；2)NPV DNA包裝成ODV或BV的分選機制；3)NPV在胞質(zhì)中的病毒蛋白是如何返回細胞核組裝成病毒粒子的；4)建立模擬ODV感染中腸組織的體外培養(yǎng)系統(tǒng)；5)與普通病毒相比，NPV作為一個大的病毒粒子是如何逃避宿主的免疫系統(tǒng)的。在這些研究的基礎(chǔ)上，可以開發(fā)新的NPV治療藥物，豐富人們關(guān)于病毒宿主和組織嗜性、病毒組裝以及病毒與宿主免疫相互作用的認識。