烤后健康煙葉和霉?fàn)€煙葉真菌群落結(jié)構(gòu)分析

陳乾麗，汪漢成，梁永進(jìn)，蔡劉體，黃 宇，周 浩，李 忠，韓 潔

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州 貴陽(yáng) 550081； 3.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，廣西 南寧530001； 4.長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025； 5.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

煙葉烘烤是烤煙生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)之一，采收的鮮煙葉需經(jīng)烘烤才能體現(xiàn)和固定其優(yōu)良品質(zhì)，成為商品煙葉[1]。隨著密集烘烤烤房的發(fā)展，貴州大部分煙區(qū)烘烤煙葉出現(xiàn)霉?fàn)€現(xiàn)象，嚴(yán)重影響烤煙品質(zhì)和產(chǎn)量。目前對(duì)于烤后煙葉微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性的研究大多集中于倉(cāng)儲(chǔ)期和醇化過(guò)程中，且多采用傳統(tǒng)分離方法。高通量測(cè)序作為新興技術(shù)獨(dú)具優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)可研究烘烤霉變與健康煙葉的真菌群落組成差異，為烤房煙葉霉?fàn)€病防治提供科學(xué)依據(jù)。煙葉面上存在細(xì)菌、真菌、放線菌等大量的微生物群落，它們?cè)跓熑~烘烤過(guò)程中對(duì)煙葉品質(zhì)有較大影響[2]?？緣臒熓呛婵菊{(diào)制過(guò)程中的主要問(wèn)題，烤壞煙葉的類型有烤青煙葉、青痕煙葉、掛灰煙葉等，烤壞煙葉的原因包括煙葉品質(zhì)差、采收技術(shù)不規(guī)范、編煙和烤房裝煙密度不當(dāng)、烘烤期溫度和濕度控制不當(dāng)?shù)取熑~發(fā)生霉?fàn)€是烘烤期常見(jiàn)的現(xiàn)象，有關(guān)烘烤期煙葉霉?fàn)€的研究多有報(bào)道，烘烤過(guò)程中煙葉霉?fàn)€與煙葉自由水含量、主脈硬度、還原糖、可溶性總糖含量密切相關(guān)[3]。煙葉吸濕性強(qiáng)，在環(huán)境適宜情況下，各類霉菌攝取其糖類蛋白質(zhì)和水分等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，分解煙草成分，破壞其組織結(jié)構(gòu)，其產(chǎn)生的青、綠、黑色素和霉腐臭氣，致使煙葉霉?fàn)€變質(zhì)[4]。陳二龍等[5]研究發(fā)現(xiàn)，烘烤過(guò)程中煙葉主脈組織結(jié)構(gòu)的損傷為霉菌的生長(zhǎng)繁殖提供了環(huán)境。彭清云等[6]研究發(fā)現(xiàn)，引起煙葉霉變的真菌包括青霉屬、曲霉屬、根霉屬、毛霉屬，細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬和乳桿菌屬。顧鋼等[7]認(rèn)為，烤房煙葉霉?fàn)€病可分為葉基霉?fàn)€型和葉片霉?fàn)€型2種。蘇家恩等[8]研究發(fā)現(xiàn)，如果不及時(shí)處理烘烤過(guò)程中霉變煙葉的霉菌孢子，將導(dǎo)致儲(chǔ)存期間煙葉發(fā)霉，造成煙葉質(zhì)量和品種的損失。

高通量測(cè)序技術(shù)在土壤[9-10]、水體[11-12]、腸道[13-14]、空氣[15-16]等微生態(tài)系統(tǒng)的微生物多樣性研究中得到廣泛應(yīng)用，具有測(cè)序通量高、準(zhǔn)確度高、性價(jià)比高等特點(diǎn)[17-18]。如今高通量測(cè)序技術(shù)在煙草上的應(yīng)用也十分常見(jiàn)，常安然等[19]運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)煙草根際土壤細(xì)菌群落組成進(jìn)行了分析；李珊輝[20]基于高通量測(cè)序技術(shù)研究了卷煙加工和儲(chǔ)存過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)與其品質(zhì)關(guān)系；龔俊等[21]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)準(zhǔn)確反映煙葉表面微生物群落結(jié)構(gòu)。本文通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)掘烤后健康與霉?fàn)€煙葉樣品真菌群落組成和結(jié)構(gòu)差異，以期為今后指導(dǎo)煙葉霉?fàn)€病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

DNA抽提試劑盒(FastDNA?Sin kit for Soil，MP Biomedicals)；TransGen AP221-02(貨號(hào)，AXYGEN)；TransStart Fastpfu DNA Polymerase(貨號(hào)，AXYGEN)；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(貨號(hào)，AXYGEN)。PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測(cè)定量；Miseq PE300高通量測(cè)序系統(tǒng)由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)樣本采集

于貴州省黔西南州興義市煙草公司(24°57′8″N，104°53′9″E)，選取煙葉霉?fàn)€病暴發(fā)嚴(yán)重的烤房，煙葉品種為云煙87。隨機(jī)采集烤房中健康煙葉(MJ1、MJ2、MJ3)和霉?fàn)€煙葉(MB1、MB2、MB3)樣品放置于無(wú)菌采樣袋中，-80 ℃條件保存。

1.3 樣品DNA提取

采后稱取各樣品0.5 g研磨樣，采用FastDNA?Sin kit for Soil提取樣品DNA，按說(shuō)明書操作程序進(jìn)行總DNA的提取。完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。

1.4 目的片段擴(kuò)增與Illumina HiSeq高通量測(cè)序

以樣品DNA為模板，采用正向引物ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′(5 μmol·L-1)和反向引物ITS2：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′(5 μmol·L-1)對(duì)樣品的ITS1-ITS2區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為20 μL：5×FastPfu 緩沖液(4 μL)，2.5 mmol·L-1dNTPs(2 μL)，正向引物(5 μmol·L-1)0.8 μL，反向引物(5 μmol·L-1)0.8 μL，F(xiàn)astPfu 聚合酶 0.4 μg，BSA 0.2 μL，模板DNA 10 ng，ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序參數(shù)：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)其擴(kuò)增質(zhì)量，使用GeneJET膠回收試劑盒純化產(chǎn)物。將合格的純化樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，并于I-Sanger 生物信息分析云平臺(tái)(http://www.i-sanger.com/)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和生物多樣性分析。

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

1.5.1 原始數(shù)據(jù)處理

原始測(cè)序序列使用Trimmomatic軟件進(jìn)行質(zhì)控，首先過(guò)濾reads尾部質(zhì)量值在20以下的堿基，設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開(kāi)始截去后端堿基，過(guò)濾質(zhì)控后50 bp以下的reads，去除含N堿基的reads；然后根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)reads拼接(merge)成一條序列，最小overlap長(zhǎng)度為10 bp；拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2，篩選不符合序列；最后根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，barcode允許的錯(cuò)配數(shù)為0，最大引物錯(cuò)配數(shù)為2。使用FLASH軟件進(jìn)行拼接。

1.5.2 OTU聚類及注釋

使用UPARSE軟件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/)，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類，并在聚類的過(guò)程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Unite(Release 6.0 http://unite.ut.ee/index.php)真菌數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行Alpha多樣性分析，Alpha多樣性指數(shù)采用軟件mothur (version v.1.30.1)計(jì)算物種組成分析、樣品比較分析、物種差異分析等評(píng)估健康煙葉組與霉?fàn)€煙葉組真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性。LEfSe(LDA EFFECT SIZe)多級(jí)物種差異判別分析首先使用非參數(shù)因子克魯斯卡爾-沃利斯秩和驗(yàn)檢(non-parametric factorial Kruskal-Wallis sum-rank test)檢測(cè)具有顯著豐度差異特征，并找到與豐度有顯著性差異的類群，然后采用線性判別分析(LDA)來(lái)估算每個(gè)物種豐度對(duì)差異效果影響的大小，最終確定組間差異存在顯著影響的真菌類群。

1.5.3 FUNGuild功能預(yù)測(cè)

通過(guò)FUNGuild數(shù)據(jù)庫(kù)分析烘烤煙葉的真菌的營(yíng)養(yǎng)方式(trophic mode)和對(duì)環(huán)境資源的吸收利用的方式(guild)。置信度(confidence)選?。骸皹O可能”(highly probable)、“很可能”(probable)和“可能”(possible)3個(gè)等級(jí)。以上分析均在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的I-Sanger生信云網(wǎng)站平臺(tái)(http://www.i-sanger.com/project/index.html)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控

烘烤結(jié)束后共取了2類煙葉樣品：健康煙葉組(MJ)包含的樣本為MJ1、MJ2和MJ3；霉?fàn)€煙葉組(MB)包含的樣本為MB1、MB2和MB3。

原始序列經(jīng)優(yōu)化處理后，健康煙葉組(MJ)和霉?fàn)€煙葉組(MB)6個(gè)樣本共得到207 134條高質(zhì)量序列片段，59 106 670個(gè)堿基，單一樣本序列數(shù)在203～349條，序列平均長(zhǎng)度為286 bp；健康煙葉組(MJ)樣品共得到100 774條高質(zhì)量序列片段，29 489 959個(gè)堿基，單一樣品序列數(shù)在205～349條，序列平均長(zhǎng)度為292 bp；霉?fàn)€煙葉組(MB)樣品共得到106 360條高質(zhì)量序列片段，29 616 711個(gè)堿基，單一樣品序列數(shù)在232～346條，序列平均長(zhǎng)度為278 bp。

2.2 測(cè)序深度分析

稀釋曲線(rarefaction curve)既反映了不同測(cè)序數(shù)據(jù)量下各樣品中物種的豐富度，又可表示測(cè)序深度是否覆蓋了一個(gè)環(huán)境樣品中的所有測(cè)序?qū)ο?。由圖1稀釋曲線可知，本次測(cè)序樣品的稀釋曲線在測(cè)序深度為5 000時(shí)就趨于平緩，曲線趨于平坦表明測(cè)序已趨于飽和，增加測(cè)序數(shù)據(jù)無(wú)法再找到更多的OTU。因此，可以認(rèn)為測(cè)序深度已經(jīng)覆蓋到樣品中所有的物種，測(cè)序數(shù)據(jù)量足以反映樣品中的物種多樣性。

2.3 真菌多樣性指數(shù)分析

豐富度指數(shù)(richness index)：Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)，用于表示樣品中真菌群落豐富度，數(shù)值越大，說(shuō)明其相應(yīng)的群落豐富度越高。豐富度指數(shù)結(jié)果表明，健康煙葉組(MJ)檢測(cè)到的真菌OTU數(shù)量均高于霉?fàn)€煙葉組(MB)。多樣性指數(shù)(diversity index)，如Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)，用于表示樣品中真菌群落多樣性，其中，Shannon指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越高,Simpson指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越低。多樣性指數(shù)結(jié)果表明，健康煙葉組(MJ)真菌群落多樣性均高于霉?fàn)€煙葉組(MB)。覆蓋度指數(shù)用于表示樣品測(cè)序的覆蓋度，Alpha多樣性指數(shù)表中，健康煙葉樣品與霉?fàn)€煙葉樣品中各部位樣品的覆蓋度指數(shù)均到達(dá)了0.999，表明測(cè)序結(jié)果合理(表1)。

圖1 稀釋曲線(OTU水平Sobs指數(shù))Fig.1 Rarefaction curve (Sobs index of OTU level)

2.4 OTU聚類分析

為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并分別在各個(gè)分類學(xué)水平對(duì)樣品序列進(jìn)行OTU聚類，在健康煙葉組(MJ)3個(gè)樣品中共鑒定出真菌6個(gè)門，25個(gè)綱，58個(gè)目，111個(gè)科，182個(gè)屬，253個(gè)種，383個(gè)OTU；霉?fàn)€煙葉組(MB)3個(gè)樣品中共鑒定得出真菌的4個(gè)門，15個(gè)綱，22個(gè)目，33個(gè)科，54個(gè)屬，69個(gè)種，82個(gè)OTU(表2)。

2.5 真菌群落基本組成和結(jié)構(gòu)分析

結(jié)果表明，在門水平上，健康煙葉組(MJ)優(yōu)勢(shì)菌門為子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)；霉?fàn)€煙葉組(MB)優(yōu)勢(shì)菌門為子囊菌門(Ascomycota)；其中子囊菌門(Ascomycota)在健康煙葉組(MJ)中相對(duì)豐度為57.13%，在霉?fàn)€煙葉組(MB)中相對(duì)豐度為99.11%；擔(dān)子菌門(Basidiomycota)在健康煙葉組(MJ)中相對(duì)豐度為3.08%，在霉?fàn)€煙葉組(MB)中相對(duì)豐度為0.10%，接合菌門(Zygomycota)在兩組樣本中豐富度均低于0.10%(圖2)。

在屬水平上(圖3)，健康煙葉組(MJ)優(yōu)勢(shì)真菌為鏈格孢屬(Alternaria)，相對(duì)豐度為31.65%；其次為曲霉屬(Aspergillus)，相對(duì)豐度為9.95%；新凸輪孢菌屬(Neocamarosporium)，相對(duì)豐度為1.34%；支頂孢屬(Acremonium)，相對(duì)豐度為1.32%；赤霉屬(Gibberella)，相對(duì)豐度為0.95%。霉?fàn)€煙葉組(MB)優(yōu)勢(shì)真菌為曲霉屬(Aspergillus)，相對(duì)豐度為94.18%；其次為青霉屬(Penicillium)，相對(duì)豐度為2.35%；根霉屬(Rhizopus)，相對(duì)豐度為0.77%；鏈格孢屬(Alternaria)，相對(duì)豐度為0.42%。非優(yōu)勢(shì)真菌所占比例不到總真菌數(shù)量的0.1%，其在各樣品間的含量不存在差異。

表1 不同組別真菌群落Alpha多樣性指數(shù)(OTU level)

Table 1 Alpha diversity index between different groups (OTU level)

樣品Sample豐富度指數(shù)Richness indexSobsAceChao多樣性指數(shù)Diversity indexShannonSimpson覆蓋度指數(shù)Coverage indexMJ11121131131.950.310.999MJ21201231222.060.250.999MJ31071101101.660.320.999合計(jì)Total113±7115±7115±61.89±0.200.29±0.040.999MB13449450.520.80.999MB22967590.230.920.999MB32123220.170.950.999合計(jì)Total28±746±2242±190.30±1.90.89±0.80.999

表2 健康煙株與霉?fàn)€煙葉各真菌群落不同分類水平下的總量

Table 2 Total amount of fungus communities of healthy and rotten tobacco leaves were at different taxonomic levels

樣本Sample界Kindom門Phylum綱Class目Order科Family屬Genus種SpeciesOTUMJ115193973112149192MJ216234881120157240MJ315224267107146199MB113101521344755MB214131721293741MB314101214213338

在健康煙葉組(MJ)中獨(dú)有屬為節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia)、光蓋傘屬(Psilocybe)、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)、尾梗霉屬(Cercophora)等133個(gè)；在霉?fàn)€煙葉組(MB)中獨(dú)有屬為木霉屬(Trichoderma)、異莖點(diǎn)霉屬(Paraphoma)、Meyerozyma、Symbiotaphrina、絲衣霉屬(Byssochlamys)；兩者共有菌屬有曲霉屬(Aspergillus)、鏈格孢屬(Alternaria)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)、支頂孢屬(Acremonium)等49個(gè)。

樣品聚類根據(jù)每個(gè)樣品屬的組成情況聚類分析，展示各個(gè)樣品之間的關(guān)系，組成越相似，樣品聚類的關(guān)系越近。各樣品前30個(gè)屬的相對(duì)豐度熱圖如圖4所示，通過(guò)顏色的變化直觀表示出屬相對(duì)豐度的高低。熱圖上部樣品層級(jí)聚類樹表明，健康煙葉樣品與霉?fàn)€煙葉樣品組間的真菌菌群的相似性較低，群落組成存在明顯差異，其中健康煙葉樣品MJ1、MJ2和MJ3的3個(gè)樣品群落結(jié)構(gòu)較相似聚為一類，MB1、MB2、MB3聚集為一大類。結(jié)果表明，健康煙葉樣品與霉?fàn)€煙葉樣品在組內(nèi)屬水平相似，因此，烘烤期煙葉霉?fàn)€病的發(fā)生對(duì)煙葉真菌群落結(jié)構(gòu)存在較大影響。

2.6 LEfSe多級(jí)物種差異判別分析

運(yùn)用LEfSe分析健康煙葉和霉變煙葉組間顯

圖2 不同組別樣品門水平上的相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of different samples at phylum level

著性差異菌群，其中分值大于4.0中共有18個(gè)不同分類水平的真菌存在顯著性差異(圖5)。其中霉變煙葉組曲霉屬、散囊菌綱Eurotiomycetes、散囊菌目Eurotiales、發(fā)菌科Trichocomaceae、子囊菌門，健康煙葉組座囊菌綱Dothideomycetes、座囊菌目Pleosporales、鏈格孢屬、擔(dān)子菌門、肉座菌目Hypocreales等是導(dǎo)致健康煙葉與霉變煙葉真菌群落差異的主要類群。

圖4 樣品屬水平的相對(duì)豐度熱圖Fig.4 Heatmap of the relative abundance of genera identified in each sample

A， 多級(jí)物種層級(jí)樹；B，LDA判別結(jié)果。A， Multistage species hierarchical tree map; B， LDA discriminant results.圖5 LEfSe 物種差異分析Fig.5 LEfSe species difference analysis

2.7 FUNGuild功能類群預(yù)測(cè)

利用FUNGuild對(duì)烘烤期煙葉真菌群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，在394個(gè)OTU中，有280個(gè)OTU被劃分為8個(gè)真菌功能類群，約占總OTU數(shù)量的71.06%，分別為共生菌群(Symbiotroph)、腐生菌群(Saprotroph)、腐生-共生過(guò)渡型(Saprotroph-Symbiotroph)、病理寄生-共生菌群(Pathotroph-Symbiotroph)、病原菌/腐生/共生菌群(Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph)、病理寄生-腐生菌群(Pathotroph-Saprotroph)、病理寄生菌群(Pathotroph)、病原-腐生-共生菌群(Pathogen-Saprotroph-Symbiotroph)。其中霉變煙葉組腐生菌群(Saprotroph)顯著高于健康煙葉組。

根據(jù)對(duì)環(huán)境資源的吸收利用的方式烘烤煙葉真菌可分為46個(gè)共位群，其中在健康煙葉組中Animal pathogen-dung saprotroph-endophyte-epiphyte-plant saprotroph-wood saprotroph豐富度最高，其次為Undefined saprotroph和Fungal parasite-Litter saprotroph。霉變煙葉組中Undefined Saprotroph的豐富度最高，其次為Plant pathogen(圖6)。

圖6 基于OTU水平注釋表的真菌功能群相對(duì)豐度Fig.6 Relative abundance of fungal functional groups (guilds) based on OTU annotation table with distribution frequency level

3 結(jié)論與討論

煙草烘烤期微生物的活動(dòng)影響著煙葉品質(zhì)[22]。早期對(duì)煙葉烘烤過(guò)程中微生物群落多樣性通常是平板分離并培養(yǎng)可培養(yǎng)微生物來(lái)確定，雖該方法能獲得部分可培養(yǎng)微生物種類和豐度，但該技術(shù)受環(huán)境變化的影響，并且不同微生物的增殖有差異，僅有1%的微生物能在實(shí)驗(yàn)室條件下分離培養(yǎng)[23-24]。本文基于Illumina高通量測(cè)序技術(shù)，選取烤后健康煙葉與霉?fàn)€煙葉樣品為研究對(duì)象，分析健康和霉?fàn)€煙葉的真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性差異。

本文通過(guò)OTU數(shù)量、Chao、Ace等指數(shù)反映了烘烤期健康煙葉和霉?fàn)€煙葉的真菌群落和多樣性。Alpha多樣性分析結(jié)果表明，健康煙葉各部位樣品真菌豐富度、均勻度和多樣性均高于霉?fàn)€煙葉樣品。煙葉霉?fàn)€病害的發(fā)生，導(dǎo)致煙葉真菌種類和真菌群落豐富度降低。

物種群落組成結(jié)果表明，健康煙葉組與霉?fàn)€煙葉組真菌物種組成豐富，二者在種群結(jié)構(gòu)上有一定的差異。在門水平上，健康煙葉組為子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，霉?fàn)€煙葉組的優(yōu)勢(shì)菌門為子囊菌門(Ascomycota)。子囊菌門(Ascomycota)為植物中常見(jiàn)的內(nèi)生菌群[25]，陳善義等[26]通過(guò)對(duì)煙葉真菌群落組成研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，子囊菌門(Ascomycota)為不同產(chǎn)地和不同部位的煙葉的共有的優(yōu)勢(shì)菌門；陳乾麗等[27]研究指出，子囊菌門、擔(dān)子菌門、接合菌門是霉變煙葉中的優(yōu)勢(shì)菌門。以上研究結(jié)論與本研究結(jié)果相似。

在屬水平上，健康煙葉組和霉?fàn)€煙葉組共有的優(yōu)勢(shì)菌屬主要為鏈格孢屬(Alternaria)和曲霉屬(Aspergillus)，其中霉?fàn)€煙葉組中的曲霉屬(Aspergillus)占比明顯高于健康煙葉組；健康煙葉組的鏈格孢屬(Alternaria)顯著高于霉?fàn)€煙葉組，在霉?fàn)€煙葉組中曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)的豐富度較高。本文結(jié)果與吳闊等[28]所報(bào)道的霉?fàn)€煙葉中引起霉?fàn)€的真菌類群結(jié)論相似。在本研究中霉?fàn)€煙葉組中存在大量青霉屬(Penicillium)，趙文姬[29]研究表明青霉屬(Penicillium)是霉變煙葉的優(yōu)勢(shì)菌屬；朱桂寧[30]明確曲霉屬(Aspergillus)是引起煙葉霉變的主要微生物類群；曾婷英等[31-32]研究表明，根霉屬(Rhizopus)能引起烘烤期烤房煙葉霉?fàn)€病。本研究表明，在健康煙葉與霉?fàn)€煙葉中都存在大量的根霉屬(Rhizopus)，但霉?fàn)€煙葉(0.77%)中所占比例明顯高于健康煙葉(<0.01%)。煙葉烘烤過(guò)程中葉表存在大量的微生物，它們?cè)邗r煙葉調(diào)制過(guò)程中對(duì)煙葉產(chǎn)品的形成及其品質(zhì)產(chǎn)生了不同的作用[33]。煙葉烘烤變黃期，烤房溫度與濕度迅速升高，為青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)和曲霉屬(Aspergillus)等腐生真菌提供了適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，加快微生物分解煙葉蛋白質(zhì)的速度，引發(fā)煙葉發(fā)生霉?fàn)€，嚴(yán)重影響煙葉品質(zhì)。在本研究中，霉變煙葉組腐生菌群(Saprotroph)高于健康煙葉組，可能是由于煙葉霉變引起的。Pythiumaphanidermatum和Erwiniacarotovora能在烤房?jī)?nèi)引起煙葉腐爛霉?fàn)€，因此烘烤期的細(xì)菌也是影響煙葉發(fā)生霉變的重要原因，下一步可對(duì)烘烤期健康煙葉和霉變煙葉的細(xì)菌群落組成與結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，研究煙葉烘烤中與煙葉霉變有關(guān)的細(xì)菌類群。

本研究的結(jié)果顯示，烘烤期健康煙葉與霉?fàn)€煙葉樣品間真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性差異較大，樣品組內(nèi)差異較小，能夠反映烘烤期煙葉真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的差異情況。煙草霉?fàn)€是由環(huán)境、微生物等多因素共同作用所導(dǎo)致的，各類真菌隨環(huán)境變化與煙葉代謝作用的關(guān)系也有待于進(jìn)一步研究。對(duì)烤后健康煙葉和霉?fàn)€煙葉真菌群落組成分析，將有助于根據(jù)真菌群落結(jié)構(gòu)的組成和差異制定防霉方案和措施，減少烘烤期煙葉霉?fàn)€的發(fā)生概率。