生防地衣芽孢桿菌最佳發(fā)酵條件探究

徐亞英 黃曉梅 謝麗

摘 要 通過單因素試驗對地衣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方及條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，該菌菌株培養(yǎng)基最佳配比為蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯化鈉1%，最佳培養(yǎng)條件是初始pH值8.5、溫度37 ℃、時間36 h、三角瓶裝液量125 mL、接種量4%、轉(zhuǎn)速200 r·min-1。該研究為地衣芽孢桿菌的大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)提供了有益借鑒。

關(guān)鍵詞 地衣芽孢桿菌;發(fā)酵條件優(yōu)化;單因子試驗

微生物制劑是現(xiàn)在各國競相研究開發(fā)的新產(chǎn)品。我國原農(nóng)業(yè)部于2003年就公布了可用于生產(chǎn)微生態(tài)制劑的芽孢桿菌屬菌種有地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等。地衣芽孢桿菌是一種益生菌，是革蘭氏陽性好氧菌，化能異養(yǎng)，在一定條件下能產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子[1-3]。近年來，國內(nèi)外對于地衣芽孢桿菌各方面應(yīng)用的報道日益增多，是芽孢桿菌中具有較大應(yīng)用前景的菌種之一，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、飼料加工等行業(yè)中都取得了較好的研究成果[4-6]。但該桿菌在動物微生態(tài)制劑及植物病蟲害防治方面的應(yīng)用仍處于發(fā)展階段，發(fā)展?jié)摿^大。尤其是在植物微生態(tài)制劑上的應(yīng)用，具有重要的發(fā)展意義。

地衣芽孢桿菌在自然界中分布十分廣泛，是植物及土壤微生態(tài)的優(yōu)勢種群;能分泌抑制或者殺死病原菌的次級代謝產(chǎn)物，對許多植物的病原菌有較好的抑制作用，如對核盤菌、鐮刀菌、水稻紋枯病病菌和稻瘟病病菌等均具有較好的抑菌作用，具有較好的生防潛力，已經(jīng)成功用在植物病害的生物防治方面[7-10]。目前，登記的相關(guān)農(nóng)藥制劑為地衣芽孢桿菌水劑，由廣西金燕子農(nóng)藥有限公司研制，含80億個/mL活芽孢，主要防治黃瓜保護地的霜霉病。但在將地衣芽孢桿菌制成微生態(tài)制劑時，保證含有大量的細(xì)胞、芽孢且成本較低是一個重要前提[11]?；诖?，采用單因素試驗研究不同發(fā)酵培養(yǎng)基及不同培養(yǎng)條件對地衣芽孢桿菌培養(yǎng)的影響，以期為降低地衣芽孢桿菌高密度培養(yǎng)的成本提供一定的理論依據(jù)，使其能夠滿足微生物菌劑的生產(chǎn)要求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

地衣芽孢桿菌由黑龍江農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院分析檢測中心微生物試驗室篩選保存;可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、胰蛋白胨、麥芽糖、酵母提取物、硫酸鎂、牛肉膏、尿素、硫酸銨、氯化銨、氯化鈉、氯化鈣和磷酸二氫鉀等均為分析純試劑。

種子培養(yǎng)基與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基均是LB培養(yǎng)基，即蛋白胨10 g·L-1、酵母浸出物5 g·L-1、氯化鈉10 g·L-1，自然pH。

主要設(shè)備有紫外-可見分光光度計、高壓蒸氣滅菌鍋、生化培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)振蕩器、pH計、精密電子天平、無菌操作臺等。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1菌種活化

將保存菌種轉(zhuǎn)接至LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)至24 h待用。

1.2.1.2種子液制備

挑取已活化的單菌落接種到含50 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，160 r·min-1、37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)16～18 h后待用。

1.2.1.3搖瓶培養(yǎng)

分別取一定量的種子液，按2%的接種量接至含培養(yǎng)基的三角瓶中;在200 r·min-1、37 ℃搖床中培養(yǎng)36 h，進行單因素試驗的發(fā)酵培養(yǎng)研究。

1.2.2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗設(shè)計

1.2.2.1碳源

分別用5 g·L-1的酵母粉、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、麩皮和可溶性淀粉等量取代基礎(chǔ)培養(yǎng)液的碳源。使用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，36 h后通過測定發(fā)酵液的活菌數(shù)來確定最佳碳源。

1.2.2.2氮源

依次用10 g·L-1的豆粉、蛋白胨、硫酸銨、牛肉膏、硝酸銨、尿素和氯化銨替代基礎(chǔ)發(fā)酵液的氮源。使用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，36 h后通過測定發(fā)酵液的活菌數(shù)來確定最佳氮源。

1.2.2.3無機鹽

依次用10 g·L-1的NaCl、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4和KCl等量替代基礎(chǔ)發(fā)酵液的無機鹽。采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，36 h后通過測定發(fā)酵液的活菌數(shù)來確定最佳無機鹽種類。每個處理3次重復(fù)，其他發(fā)酵條件同1.2.1.3。

1.2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化設(shè)計

使用篩選出的最佳培養(yǎng)基配方，先固定搖瓶培養(yǎng)的其他發(fā)酵條件，對初始pH、裝液量、溫度、接菌量、發(fā)酵時間等發(fā)酵條件進行優(yōu)化。初始pH值依次調(diào)為5.5、6.5、7.5、8.5和9.5;接種量分別調(diào)為裝液量的1%、2%、4%、5%、6%和8%;在250 mL三角瓶中分別裝入25 mL、50 mL、75 mL、100 mL、125 mL和150 mL發(fā)酵培養(yǎng)液;發(fā)酵時間分別設(shè)為12 h、24 h、48 h和60 h;溫度分別設(shè)為30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃和45 ℃;轉(zhuǎn)速分別設(shè)為100 r·min-1、150 r·min-1、200 r·min-1、220 r·min-1和250 r·min-1。每處理3次重復(fù)，其他發(fā)酵條件同1.2.1.3。

1.3 測定方法

以空白培養(yǎng)基為對照，菌體發(fā)酵液的測定采用比濁法，即發(fā)酵液10～15 mL在2 000 r·min-1下離心2 min，測定菌液的OD600值（溶液在600 nm波長處的吸光值），pH計測定菌液pH。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 碳源

分別對不同碳源進行篩選，其他組分均相同進行發(fā)酵。通過試驗可知，地衣芽孢桿菌生長的最佳碳源是酵母提取物，其次是麩皮。

2.1.2 氮源

試驗對培養(yǎng)基的氮源進行了優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰蛋白胨作為氮源，能大大促進地衣芽孢桿菌的生長，效果明顯好于其他氮源，牛肉膏對地衣芽孢桿菌的生長影響不大，因此該桿菌生長的最適氮源是胰蛋白胨，這可能與胰蛋白胨含有較多的維生素、氨基酸和未知生長因子等有關(guān)。

2.1.3 無機鹽

在上述最適碳源和氮源的基礎(chǔ)上，分別對不同的無機鹽進行篩選。結(jié)果表明，當(dāng)使用原基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的無機鹽進行培養(yǎng)時，地衣芽孢桿菌的OD600值最大，其次是CaCl2·2H2O。所以，地衣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的最適無機鹽仍為氯化鈉。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 初始pH

試驗在配制了最佳培養(yǎng)基后，分別對不同pH進行測定。由試驗可知，在初始pH值為5.5～8.5時，地衣芽孢桿菌發(fā)酵液OD600值隨pH值的增加而增加，但初始pH值為8.5時的發(fā)酵液的OD600值最大，當(dāng)培養(yǎng)液初始pH值大于8.5時，發(fā)酵液OD600值開始明顯下降，且與初始pH 8.5的OD600值呈現(xiàn)顯著性差異。因此，地衣芽孢桿菌最適初始pH值為8.5左右。

2.2.2 接種量

分別對不同接種量進行篩選，發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌生長的最適接種量為4%。在接種量為1%～4%時，隨著接種量的增加，其發(fā)酵菌液OD600值略有升高，接種量>4%后，發(fā)酵液OD600值開始略有下降。

2.2.3 裝液量

在搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至36 h，用比濁法測定發(fā)酵液OD600值。由試驗可知，125 mL裝液量的培養(yǎng)基內(nèi)OD600值最大，隨著裝液量增大，活菌數(shù)具有下降趨勢。

2.2.4 培養(yǎng)時間

最佳培養(yǎng)基的裝液量為125 mL/250 mL、初始pH值調(diào)至8.5、接種量為4%時，測定不同搖菌時間對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響。由試驗可知，隨著搖菌時間的增加，其OD600值也在增加，至36 h，OD600值為最大;隨著培養(yǎng)時間的延長，36 h后含菌數(shù)逐漸減少，OD600值逐漸變小，地衣芽孢桿菌至生長衰亡期。因此，36 h為較合適的搖菌時間。

2.2.5 溫度

在發(fā)酵培養(yǎng)的條件下培養(yǎng)至36 h，測定OD值。通過試驗可知，該桿菌在37～45 ℃都能良好生長，故地衣芽孢桿菌生長的最適溫度為37 ℃。

2.2.6 轉(zhuǎn)速

分別測定不同轉(zhuǎn)速對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響。由試驗可知，隨著轉(zhuǎn)速的提高，OD600值升高;轉(zhuǎn)速超過200 r·min-1后，其OD600值反而下降。因此地衣芽孢桿菌的最適培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為200 r·min-1。

3 結(jié)論

試驗表明，培養(yǎng)基成分配比與發(fā)酵條件均對地衣芽孢菌株的生長有較大影響。通過單因素試驗確定地衣芽孢桿菌的優(yōu)化培養(yǎng)基為5 g·L-1酵母提取物、胰蛋白胨10 g·L-1、氯化鈉10 g·L-1，最適發(fā)酵條件為初始pH 8.5、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時間36 h、搖床轉(zhuǎn)速200 r·min-1、接種量為4%。該研究為地衣芽孢桿菌的大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)提供了有益借鑒。

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（責(zé)任編輯：劉昀）