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    蘿卜抽薹時間的QTLs定位及分析

    2020-06-23 11:49:08曲麗君張見邢軍李欣屹
    浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:顯性連鎖蘿卜

    曲麗君,張見,邢軍,李欣屹

    (天津天豐澤田生物科技有限公司,天津 300457)

    抽薹是植物從葉叢中抽出花薹的現(xiàn)象,是植株由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時期,是植物在長期的進化過程中形成的特性[1-2]。由于植物物種及其產(chǎn)品器官的多樣性,對于食用花莖、花蕾和角果的作物來說,適當(dāng)促進抽薹開花是重要的。而對于以變態(tài)根和變態(tài)莖為產(chǎn)品器官的作物來說,抽薹會導(dǎo)致產(chǎn)品器官品質(zhì)下降。蘿卜是世界上重要的蔬菜作物,其產(chǎn)品器官為肉質(zhì)根,不僅具有豐富的營養(yǎng)價值,而且具有較高的藥用價值。蘿卜先期抽薹指肉質(zhì)根在完全膨大之前就已抽薹開花[3]。先期抽薹導(dǎo)致植株進入花芽分化狀態(tài),肉質(zhì)根膨大基本停止,且隨著花芽分化、抽薹和開花,肉質(zhì)根由致密變?yōu)槭杷?,品質(zhì)快速下降, 失去商品價值[4]。

    關(guān)于抽薹性狀的遺傳規(guī)律在甘藍、青花菜、大白菜等十字花科蔬菜中已取得重要進展。Kagawa[5]對大白菜的研究認(rèn)為,早抽薹對晚抽薹為顯性。Baggett等[6]研究青花菜和甘藍的雜交組合,發(fā)現(xiàn)抽薹是數(shù)量性狀遺傳。張韜[7]認(rèn)為,抽薹性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀,但是早抽薹性狀對晚抽薹性狀并不是完全顯性,易受環(huán)境的影響且遺傳效力較低。一些控制甘藍和大白菜抽薹性狀的QTLs位點被挖掘。陳書霞等[8]利用F2群體構(gòu)建了甘藍類RAPD標(biāo)記遺傳圖譜,并定位了同抽薹期相關(guān)的3個QTLs,分別位于第1、3和8號連鎖群上。李梅[9]以結(jié)球甘藍品種間雜交獲得的F2群體作為構(gòu)圖群體,構(gòu)建了甘藍分子遺傳圖譜,并對結(jié)球甘藍抽薹時間性狀進行QTLs定位,最終獲得1個與抽薹時間相關(guān)的QTL,可解釋18.7%的表型變異。Kitamoto等[10]在經(jīng)過春化的大白菜F2群體中將控制抽薹時間的QTLs定位于2、3和5號連鎖群,其中位于2號連鎖群的QTL對抽薹性狀的貢獻率達到46.0%,解釋的表型變異最大。目前關(guān)于蘿卜抽薹性狀遺傳規(guī)律的報道較少。Kaneko等[11]在蘿卜異源染色單體中發(fā)現(xiàn)了1個早抽薹基因,它對于控制栽培種晚抽薹性狀的幾個基因均為顯性。趙麗萍[4]利用主基因與多基因混合遺傳模型聯(lián)合分析方法對蘿卜抽薹性狀進行遺傳分析,發(fā)現(xiàn)蘿卜抽薹性狀符合兩對主基因+多基因遺傳模型。這與其他十字花科蔬菜抽薹性狀的遺傳規(guī)律基本一致。

    本研究中以早抽薹材料YS105和晚抽薹材料ZP85為親本構(gòu)建F2群體,同時借助SSR多態(tài)性標(biāo)記構(gòu)建的蘿卜分子遺傳圖譜,進行蘿卜抽薹時間的QTLs定位及分析,可為培育耐抽薹蘿卜新品種及分子輔助育種提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    以蘿卜野生材料YS105為母本,栽培型材料ZP85為父本配制F1,F(xiàn)1嚴(yán)格自交獲得F2群體。其中YS105為早抽薹材料,ZP85為晚抽薹材料。F2群體大小為342株。采取常規(guī)方法進行栽培管理。

    1.2 抽薹性狀調(diào)查及分級

    自播種至花薹伸長至3~5 cm所需的天數(shù)作為抽薹時間。對親本、F1和F2群體分單株進行連續(xù)調(diào)查并記錄抽薹時間,直至栽培型材料ZP85肉質(zhì)根成熟終止調(diào)查(播種后75 d)。根據(jù)各單株抽薹所需天數(shù)參照以下標(biāo)準(zhǔn)對其抽薹性進行分級:1級,抽薹天數(shù)≤45 d;2級,45 d<抽薹天數(shù)≤55 d;3級,55 d<抽薹天數(shù)≤65 d;4級,65 d<抽薹天數(shù)≤75 d;5級,抽薹天數(shù)>75 d。

    1.3 DNA提取和分子標(biāo)記

    DNA的提取采用改良的CTAB法[12]。其中親本和F1的DNA用于多態(tài)性SSR標(biāo)記篩選,F(xiàn)2群體的DNA用于構(gòu)建遺傳圖譜和QTL定位。

    本文所用的SSR分子標(biāo)記來源于蘿卜基因組序列,根據(jù)蘿卜EST序列設(shè)計的SSR引物[13]以及參照 Hashida 等[14]。PCR反應(yīng)體系15 μL:2 μL DNA(40 ng·μL-1),正向、反向引物(10 ng·μL-1)各0.25 μL,Taq酶 0.2 μL(2.5 U·μL-1),dNTP 0.2 μL,Mg2+1.2 μL(25 mmol·L-1),10×Taqbuffer 1.5 μL,ddH2O 9.4 μL。PCR 反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,30個循環(huán);72 ℃保溫8 min。擴增產(chǎn)物用8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠,160 V恒功率電泳分離1 h,銀染顯色后在膠片觀察燈下進行帶型統(tǒng)計分析。SSR引物序列由上海生工生物技術(shù)公司合成。

    1.4 遺傳圖譜的構(gòu)建

    利用親本篩選多態(tài)性SSR分子標(biāo)記對F2群體DNA進行分析。按照J(rèn)oinMap 4.0軟件[15]要求的方法統(tǒng)計條帶:與父本YS105一致的帶型記為a,與母本ZP85一致的帶型記為b,雜合的帶型記為h,未擴增出的或模糊不清的帶型記為u。采用JoinMap 4.0軟件作圖,利用Kosambi作圖將重組交換率轉(zhuǎn)化為centi-Morgans (cM)[16]。

    1.5 QTLs定位

    利用MapQTL4.0軟件[17]進行QTLs分析,首先利用置換測驗1 000 次重復(fù),根據(jù)“Permutation test”進行全基因組掃描,估算基因組范圍內(nèi)α=0.05水平上的LOD閾值。然后,利用區(qū)間作圖法(interval mapping,IM)進行QTL分析,得到大于LOD閾值的QTL位點。對于IM分析得到的QTL,將最高LOD 值所在位置的標(biāo)記或與其緊密連鎖的標(biāo)記作為協(xié)同因子,再對IM檢測到的QTL進行多座位QTL模型(MQM)檢測,作為最終的定位結(jié)果。以連鎖群上LOD值最高的位置作為QTL的位置,同時分析每個QTL對蘿卜抽薹性狀的遺傳參數(shù)和貢獻率。QTL的命名規(guī)則如下:斜體字母“q”+性狀的英文縮寫+連鎖群號+QTL編號[18]。如qbt-1-1即表示位于第1連鎖群上第一個與抽薹時間(bolting time,bt) 相關(guān)的QTL。

    1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

    利用 SPSS13.0 統(tǒng)計軟件對雙親、F1及F2群體各單株的抽薹級數(shù)的調(diào)查結(jié)果進行統(tǒng)計分析并獲得其表型變異及分布。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 蘿卜抽薹時間的表型變異

    通過對植株抽薹時間的數(shù)據(jù)進行分析,發(fā)現(xiàn)母本YS105的平均抽薹時間為42 d,抽薹分級為1級,而父本ZP85在調(diào)查結(jié)束時(75 d)均沒有植株發(fā)生抽薹,抽薹分級為5級。F1的平均抽薹時間為68 d,抽薹分級為4級,介于雙親之間。F2群體在調(diào)查結(jié)束時有119株仍沒有發(fā)生抽薹,抽薹分級為5級,其他224株植株的抽薹時間變化幅度為32~75 d, 抽薹分級為1~4級(圖1)。由此可見,蘿卜抽薹時間性狀在F2群體中的分布基本介于雙親之間,少部分植株在該性狀中出現(xiàn)了超親分離現(xiàn)象。

    圖1 蘿卜F2群體抽薹時間分級的分布

    2.2 SSR 遺傳圖譜構(gòu)建

    利用親本和F1篩選到的114對多態(tài)性SSR標(biāo)記對包含342個單株的F2群體進行鑒定。利用JoinMap 4.0[17]建立了包含9個連鎖群的蘿卜遺傳圖譜。該圖譜覆蓋基因組長度894.9 cM,平均標(biāo)記間距為7.85 cM。連鎖群的長度在50.8~155.4 cM。每個連鎖群的標(biāo)記數(shù)在6~20,其中LG1和LG4包含的標(biāo)記數(shù)最多,為20個,LG5和LG9含有的標(biāo)記數(shù)最少,僅有5個(圖2)。

    圖2 蘿卜抽薹時間遺傳圖譜及QTL定位

    2.3 抽薹時間性狀的QTLs定位

    經(jīng)“Permutation test”對全基因組掃描,估算“Rel.cum.count”為0.950 0時的Interval值為3.3,即設(shè)定當(dāng)LOD值≥3.3時存在QTL。利用區(qū)間作圖法并結(jié)合多座位QTL模型(MQM)檢測,共檢測到4個與蘿卜抽薹時間相關(guān)的QTLs,分布于LG 5、LG 6、LG 8和LG 9上,分別命名為qbt-5-1、qbt-6-1、qbt-8-1和qbt-9-1 (圖2、表1)。LOD值介于10.18~18.11,可解釋8.4%~21.6%的表型變異率。

    qbt-5-1的LOD值為10.18,介于標(biāo)記RSS2108~RS5-3,貢獻率為8.4%,加性效應(yīng)為0.47,顯性效應(yīng)為0.20;qbt-6-1位于89_21540~89_21637,其LOD值為18.11,可解釋14.7%的表性變異率,其加性效應(yīng)為0.67,顯性效應(yīng)為-0.48;qbt-8-1介于41_14295~RS8-2,LOD值為16.69,可解釋21.6%的表型變異率,該位點的加性效應(yīng)為0.81,顯性效應(yīng)為0.06;qbt-9-1位于標(biāo)記9ssr-10~9ssr-14,LOD值為11.57,貢獻率為10.7%,加性效應(yīng)為0.57,顯性效應(yīng)為0.13。

    表1 蘿卜抽薹時間QTLs定位及效應(yīng)分析

    3 討論

    蘿卜抽薹性狀為主基因和多基因控制的數(shù)量性狀,易受環(huán)境條件影響,人為難以控制,且早抽薹對晚抽薹為不完全顯性,因此,給選育耐抽薹品種及新種質(zhì)資源開發(fā)帶來較大困難[4,11]。分子圖譜構(gòu)建及QTLs定位可加速分子標(biāo)記輔助育種的進程。本研究利用 F2群體對控制蘿卜抽薹時間性狀的QTLs進行定位及效應(yīng)分析,最終得到與蘿卜抽薹時間相關(guān)的4個QTLs位點(qbt-5-1、qbt-6-1、qbt-8-1和qbt-9-1),分別位于蘿卜第5、6、8和9連鎖群上。它們的遺傳貢獻率分別為8.4%、14.7%、21.6%和10.7%,加性效應(yīng)分別為0.47、0.67、0.81和0.57,顯性效應(yīng)分別為0.20、-0.48、0.06和0.13。這4個位點均為增效位點,可在低世代育種中快速選擇純合的優(yōu)良性狀。qbt-8-1貢獻率達到21.6%,可能是控制蘿卜抽薹時間的主效位點。

    一些與抽薹性狀相關(guān)的連鎖標(biāo)記的開發(fā)利用可大大加速耐抽薹品種的改良進程。Ajisaka等[19]利用BSA策略獲得了一個與大白菜極晚抽薹性狀緊密連鎖的RAPD標(biāo)記RA1255C,并成功轉(zhuǎn)化為共顯性RFLP標(biāo)記,該QTL可解釋77%的表型變異,為晚抽薹的分子標(biāo)記輔助選擇奠定了重要基礎(chǔ)。目前對蘿卜抽薹分子標(biāo)記的研究還相對較少,存在遺傳距離較大,尚不能較好地用于分子標(biāo)記輔助育種的問題。趙麗萍[4]采用BSA與GRA策略,對抽薹性狀進行多種遺傳標(biāo)記分析,獲得可能與抽薹性主效位點緊密連鎖的8個標(biāo)記。徐文玲等[20]利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù),結(jié)合BSA法,獲得2個與蘿卜耐抽薹基因連鎖的標(biāo)記,其遺傳距離分別為14.6和9.1 cM。在本文中,我們將3個QTLs位點(qbt-5-1、qbt-6-1和qbt-9-1)的遺傳距離控制在11.1 cM以內(nèi),下一步將繼續(xù)在該區(qū)域附近設(shè)計引物進行加密,將蘿卜抽薹性的基因控制在更小的距離范圍內(nèi),力求獲得與蘿卜抽薹性更為連鎖的分子標(biāo)記,用于蘿卜耐抽薹品種選育過程。

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