蛹蟲草種子液的培養(yǎng)條件篩選

牛曉娟　方正　馮曉英

摘 要：通過對蛹蟲草種子液培養(yǎng)的碳源、氮源、培養(yǎng)溫度、初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速等指標(biāo)進行考察，篩選利于蛹蟲草種子液菌絲體生長的條件。實驗結(jié)果表明：培養(yǎng)蛹蟲草種子液最適碳源為葡萄糖，最適氮源為蛋白胨，最適初始pH為6.0，最適搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，最適培養(yǎng)溫度為26℃左右。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草;種子液;培養(yǎng)條件

中圖分類號：S-3

文獻標(biāo)識碼：A

蛹蟲草（Cordyceps militaris），又稱北蟲草，與野生冬蟲夏草同屬肉座菌目[1]。在蟲草屬中，唯有冬蟲夏草和蛹蟲草是我國最常見的分布較廣的藥用價值極高的2種蟲草菌[2]。有研究表明，蛹蟲草含有蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、氨基酸、SOD、無機元素等多種有效成分，與冬蟲夏草的化學(xué)成分基本相同，某些氨基酸和蟲草素含量甚至高于冬蟲夏草[3，4]。這使得蛹蟲草可作為冬蟲夏草的良好代替品進行生產(chǎn)和消費，尤其在功能食品和醫(yī)藥等方面具有很好的實用價值。

在蛹蟲草子實體培養(yǎng)前需要對其種子液進行活化，而在大規(guī)模生產(chǎn)中種子液的需求是十分巨大的，所以種子液的培養(yǎng)條件優(yōu)化是十分重要的一環(huán)。文章旨在通過對碳源、氮源、培養(yǎng)溫度、初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速等指標(biāo)進行考察，篩選利于蛹蟲草液體菌絲生長的條件，以期為批量制備蛹蟲草種子液提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

供試蛹蟲草菌株（Cordyceps militaris）為本實驗室保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基配方

1.2.1 固體培養(yǎng)基（PDA）

[JP2]馬鈴薯汁200g/L，葡萄糖20g/L，酵母膏1.0g/L，蛋白胨2.0g/L，[JP]KH2PO4 1.0g/L，MgSO4 0.5g/L，VBl 0.02g/L，瓊脂20g/L，pH6.7，121℃ 0.1MPa蒸汽滅菌30min，用于菌種活化培養(yǎng)[5]。

1.2.2 種子液體培養(yǎng)基

KH2PO4 3.0g/L，MgSO4 1.5g/L，氮源10g/L，碳源20g/L，設(shè)定pH，高壓蒸汽滅菌30min。

1.3 培養(yǎng)基培養(yǎng)方法

1.3.1 斜面菌種擴培

將固體平板培養(yǎng)基常規(guī)滅菌，冷卻后，在無菌室內(nèi)將活化好的供試菌種分別接入固體平板中，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中暗室培養(yǎng)7d。

1.3.2 種子液培養(yǎng)

在裝有100mL高壓滅菌冷卻后的液體培養(yǎng)基中接入平板活化好的約0.5cm2的3塊菌種，在設(shè)定溫度、pH、轉(zhuǎn)速、碳源、氮源的條件下暗培養(yǎng)5d。

1.4 種子液培養(yǎng)條件篩選

1.4.1 種子液碳源條件篩選

在裝有100mL高壓滅菌冷卻后的液體培養(yǎng)基中接入平板活化好的約0.5cm2的3塊菌種，在溫度為25℃、pH 6.0、轉(zhuǎn)速150r/min、氮源為蛋白胨、暗培養(yǎng)5d的條件下考察不同碳源（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖）的影響。

1.4.2 種子液氮源條件篩選

在裝有100mL高壓滅菌冷卻后的液體培養(yǎng)基中接入平板活化好的約0.5cm2的3塊菌種，在溫度為25℃、pH 6.0、轉(zhuǎn)速150r/min、碳源為葡萄糖、暗培養(yǎng)5d的條件下考察不同氮源（蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硝酸銨、氯化銨）的影響。

1.4.3 種子液初始pH篩選

在裝有100mL高壓滅菌冷卻后的液體培養(yǎng)基中接入平板活化好的約0.5cm2的3塊菌種，在溫度為25℃、轉(zhuǎn)速150r/min、碳源為葡萄糖、氮源為蛋白胨、暗培養(yǎng)5d的條件下考察不同初始pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的影響。

1.4.4 種子液搖床培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的篩選

在裝有100mL高壓滅菌冷卻后的液體培養(yǎng)基中接入平板活化好的約0.5cm2的3塊菌種，在溫度為25℃、pH6.0、碳源為葡萄糖、氮源為蛋白胨、暗培養(yǎng)5d的條件下考察不同搖床轉(zhuǎn)速（50r/min、100r/min、150r/min、200r/min、250r/min）的影響。

1.4.5 種子液培養(yǎng)溫度的篩選

在裝有100mL高壓滅菌冷卻后的液體培養(yǎng)基中接入平板活化好的約0.5cm2的3塊菌種，在初始pH 6.0、搖床轉(zhuǎn)速為150r/min、碳源為葡萄糖、氮源為蛋白胨、暗培養(yǎng)5d的條件下考察不同培養(yǎng)溫度（20℃、22℃、24℃、26℃、28℃）的影響。

1.5 菌絲測定方法

按1.3中所述方法培養(yǎng)液體菌種，培養(yǎng)結(jié)束以1500r/min離心10min，收集菌絲體，用蒸餾水沖洗2～3次，將菌絲球放至已烘干稱重的培養(yǎng)皿中，在80℃下烘干至恒重。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源對蛹蟲草液體菌絲生長的影響

結(jié)果如圖1所示，在相同的培養(yǎng)條件下，葡萄糖作為蛹蟲草液體培養(yǎng)的碳源時菌絲體的產(chǎn)量最高，菌絲球密度最大，菌絲體干重為0.41g/100mL，其次為蔗糖。以麥芽糖為碳源時菌絲體產(chǎn)量最差，菌絲體干重為0.15g/100mL。原因可能是葡萄糖為單糖更容易被微生物所利用。

2.2 不同氮源對蛹蟲草液體菌絲生長的影響

從圖2中可以看出，在5種氮源中，蛋白胨、酵母膏、牛肉膏都有利于菌絲的生長，菌絲球密度都比較大，菌絲體干重分別達0.44g/100mL、0.37g/100mL和0.41g/100mL;硝酸銨和氯化銨在液體培養(yǎng)中產(chǎn)生的菌絲球少，菌絲體干重只有0.14g/100mL和0.17g/100mL。原因可能是蛋白胨、酵母膏、牛肉膏都屬于有機氮源，除含有蛹蟲草生長所需的蛋白質(zhì)、多肽和游離氨基酸直接作為微生物的氮素營養(yǎng)被吸收利用外，還含有少量的糖類、脂肪、無機鹽和生長素等其它營養(yǎng)物質(zhì)，更有利于菌絲體的生長發(fā)育;硝酸銨和氯化銨屬于無機氮源，對蛹蟲草菌絲的生長發(fā)育來說不是優(yōu)勢氮源。

2.3 搖床轉(zhuǎn)速對蛹蟲草液體菌絲生長的影響

從圖3中可以看出，搖床轉(zhuǎn)速在150r/min時，有利于菌絲生長，產(chǎn)生的菌絲球個體均勻且數(shù)量多，菌絲體干重達0.43mg/100mL;轉(zhuǎn)速為50r/min時，菌絲體干重達0.23mg/100mL。轉(zhuǎn)速為250r/min時，菌絲體干重為0.28mg/100mL，原因可能是轉(zhuǎn)速小，液體的溶氧量小，菌體生長緩慢不利于菌絲球形成;轉(zhuǎn)速大，溶氧量增大，菌絲生長增多，導(dǎo)致菌絲體扭結(jié)在一起，也不利于菌絲體正常生長。

2.4 初始pH對蛹蟲草液體菌絲生長的影響

通過調(diào)節(jié)液體初始pH，對蛹蟲草菌種的液體發(fā)酵能力進行了考查，結(jié)果如圖4所示。可以看出菌絲體干重隨著pH增大而增大，pH值為6.0時，菌絲體干重達4.0g/L;而趨于堿性時，菌體量下降，所以蛹蟲草適合生長在弱酸性培養(yǎng)液中。

2.5 培養(yǎng)溫度對蛹蟲草液體菌絲生長的影響

通過調(diào)節(jié)種子液培養(yǎng)溫度，對蛹蟲草菌種的液體發(fā)酵能力進行了考查，結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯鼍z體干重隨著溫度增高而增大，在培養(yǎng)溫度為26℃時，菌絲體干重為0.41g/100mL，但當(dāng)溫度超過30℃時，菌絲體量則下降，即溫度過低或過高，均會影響菌體的生長。

3 小結(jié)

本實驗結(jié)果表明，培養(yǎng)蛹蟲草種子液最適碳源為葡萄糖，最適氮源為蛋白胨，最適搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，最適初始pH為6.0，最適培養(yǎng)溫度為26℃左右。

參考文獻

[1]梁宗琦，劉愛英，劉作易.中國真菌志（蟲草屬）[M].北京：科學(xué)出版社，2007：137-152.

[2]李軍，陳廣生，方清茂，李洪水.人工培養(yǎng)蛹蟲草與冬蟲夏草的比較研究[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，33（3）：82-84.

[3]馬冰如，何玲，張甲生，等.蠶蛹蟲草與冬蟲夏草化學(xué)成分的比較[J].中國食用菌，1994，13（1）：34-37.

[4]李楠，宋健國，劉金云，張宏.蛹蟲草與冬蟲夏草化學(xué)成分比較[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995，17（增刊）：50-53.

[5]鄒湘月，羅巍，吳鄭武，劉東波，謝紅旗.北蟲草液體培養(yǎng)基配方的優(yōu)化[J].食用菌，2012（4）：10-12，31.

（責(zé)任編輯 李媛媛）