石菖蒲乙醇提取物對15 種病原真菌抑菌活性研究

李少華，谷曉杰，安麗，何曉婷，曹揮*

（1.太原學院，山西太原030001；2.山西農業(yè)大學農學院，山西太谷030801）

隨著人們對食品、環(huán)境安全的關注，農業(yè)安全生產及農產品安全成為當前最重要的熱點問題。因缺乏有效的綠色防控方案和綠色安全農藥，化學防治仍是當前作物病蟲害防治的重要手段，制約了農業(yè)產業(yè)的安全健康發(fā)展。從植物中尋找高效安全的新型農藥，一直是植保領域的研究重點。

石菖蒲（Acorus gramineus），屬天南星科，別名九節(jié)菖蒲、菖蒲、菖草等［1］，生長于海拔 20～2 600 m 的地區(qū)，主要分布于亞洲，以根部入藥，其味辛性溫，具有保護神經細胞、抗癌、抗驚厥、抗心律失常、抗病蟲害等作用［2］，其化學成分可分為揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分［3］。揮發(fā)油是石菖蒲的主要有效成分，主要有β-細辛醚、α-細辛醚、甲基異丁香酚欖香素等［4］；非揮發(fā)性成分主要包括生物堿類，茲醇類，醌和酮類，醛和酸類，氨基酸類及糖類等［5］。其中β-細辛醚的藥理研究揭示，具有抗腫瘤、抗炎，保護心肌組織、保護呼吸和消化系統(tǒng)，殺蟲滅菌等作用［6～9］，在中樞神經系統(tǒng)影響方面，具有良好的抗老年癡呆、抗癲癇、抗抑郁作用［10］。

在殺蟲抑菌方面，石菖蒲乙醇提取物對番茄灰霉孢子萌發(fā)的抑制效果顯著［11］，且溫室防效良好。黃衍章等［12］發(fā)現菖蒲烯酮對玉米象和谷蠢具有很好的熏蒸活性。謝紅英等［13］研究發(fā)現石菖蒲的甲醇提取物對粘蟲具有極強的拒食和生長發(fā)育抑制作用，兼具一定觸殺活性。

本試驗研究了石菖蒲提取物對15 種植物病原菌的抑菌活性，旨在為植物病害的安全防治提供新的依據，同時為充分利用我國豐富的植物資源為植物源農藥的開發(fā)提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物

供試植物為石菖蒲根，購自河北省安國藥材市場，產地為江西吉安市泰和縣。

1.1.2 供試菌種

梨黑斑病菌（Alternaria kikuchiana）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria）、核桃枯梢病菌（Phomopsis macrospora）、甜瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、蘭花枯萎病菌（Fusarium oxysporium）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、番茄枯萎病病原菌（Phomopsis macrospora）、三七根腐病菌（Cylindrocaipon destructans）、蘋果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidies）、葡萄根腐病菌（Fusarium oxysporum）、茄子 枯萎病 菌（Fusarium oxysporum）、棗炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidies）、番茄灰霉病病原菌（Botrytis cinerea）、番茄早疫病病原菌（Alternaria solani）、番茄黑斑病病原菌（Pseudomonas syringae）均由山西農業(yè)大學農學院植物病理實驗室提供。

1.1.3 儀器和試劑

試劑：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，95%乙醇。

儀器：1702-MP8 型電子天平（上海拓衡實業(yè)有限公司）、SW-CJ-1D 型單人凈化工作臺（蘇州普愛德凈化設備科技有限公司）、100～1000 μL移液槍（濟南鑫貝西生物技術有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海皓莊儀器有限公司）、立式自動壓力蒸汽滅菌器（立德泰勀科學儀器有限公司）、成像顯微鏡（深圳長欣自動化設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 植物粗提物的制備

將石菖蒲根烘干粉碎，過60 目篩，按提取物干粉和 95% 乙醇=1∶5（m∶v）裝入廣口瓶，浸泡 24 h后，30 ℃超聲波萃取1 h，用循環(huán)水式真空泵抽濾；將抽濾液減壓濃縮至一定濃度，室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抑菌活性測定

抑菌活性采用菌絲生長速率法［14］測定。

取1 mL 濃度為40 g·L-1石菖蒲乙醇提取物加入 19 mL 的 PDA 培養(yǎng)基中，配制成濃度為 2 g·L-1的加藥培養(yǎng)基，以加入等體積的無菌水作為空白對照，每個處理重復3 次。用直徑為0.7 cm 的打孔器在培養(yǎng)4d 的生長旺盛的供試菌株上打取菌餅，將菌餅接種在加藥培養(yǎng)基與空白對照的培養(yǎng)基中，置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用十字交叉法測定菌落直徑，并在96 h 拍照觀察石菖蒲提取物處理不同病菌后菌落的形態(tài)變化。

1.2.3 石菖蒲乙醇提取物對蘋果炭疽病的毒力測定

采用二倍稀釋法將石菖蒲乙醇提取物配制成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 g·L-16 個濃度梯度，測定其對蘋果炭疽病的抑制作用，并計算EC50。

1.2.4 石菖蒲乙醇提取物對菌絲形態(tài)的影響

參照沈曉強等［15］的方法，將石菖蒲提取物配制成濃度為1 g·L-1的含藥培養(yǎng)基，接種振蕩培養(yǎng)（150 r·min-1，28 ℃）96 h 后觀察菌絲形態(tài)。

1.3 數據分析

將收集的數據利用Excel 2013 和DPS 軟件分別計算抑菌率及進行毒力分析。

2 結果與分析

2.1 石菖蒲乙醇提取物對15 種病原菌的抑菌活性

試驗測定了質量濃度為2 g·L-1的石菖蒲乙醇提取物對梨黑斑病菌、三七根腐病菌、和蘋果炭疽病菌等15 種病原菌的抑菌活性，在96 h 石菖蒲乙醇提取物對15 種病原菌的菌絲抑制率達到80%的有5 種。其中以對蘋果炭疽病菌的抑制效果最好，可達到94%；對核桃枯梢病菌次之，抑制率為92%，抑菌效果穩(wěn)定（表1，圖1）。

2.2 石菖蒲乙醇提取物對蘋果炭疽病原菌的毒力作用

石菖蒲對蘋果炭疽病菌的抑制效果隨著石菖蒲濃度的減少而降低（表2）。選取96 h 的抑菌數據運用DPS 軟件進行統(tǒng)計分析可得，毒力方程為y=6.054 3+1.934 7x。 其 中 EC50為 0.29 g·L-1，相關系數是0.980 6。

2.3 石菖蒲提取物對菌絲形態(tài)的影響

將培養(yǎng)好的菌絲在成像顯微鏡下觀察（圖2）。無處理的蘋果炭疽病菌菌絲生長正常，菌絲體飽滿，無色，無隔膜，且分枝較長；而石菖蒲處理過的菌絲明顯受到了抑制，生長緩慢，分叉增多，并且分枝很短，菌絲生長雜亂。

3 討論與結論

從植物中尋找綠色安全的植物源農藥一直是當前研究的熱點，石菖蒲為我國傳統(tǒng)中藥，本研究發(fā)現其提取物對15 種病原菌的均有不同程度的抑制作用，其中，對蘋果炭疽病菌的效果極為顯著，96 h 抑制率達到94%，抑制中濃度 EC50值為0.29g·L-1。此外，從用提取物處理后菌絲的形態(tài)顯微觀察，也可以明顯地看到石菖蒲提取物處理過的蘋果炭疽病菌菌絲生長緩慢，分叉增多，分枝變短，這也進一步證明了石菖蒲提取物的抑菌效果。

表1 石菖蒲乙醇提取物對15 種病菌菌絲生長的抑制作用Table1 Inhibitory effect of ethanol extract of A.tatarinowii against 15 species of pathogens

圖1 15 種病原菌在96 h 的菌絲生長圖Fig.1 Hyphal growth diagram of 15 pathogens at 96 h

從試驗結果來看，石菖蒲提取物中含有廣譜性的抑菌活性成分，Lee 等研究表明，石菖蒲中對白粉菌等病原起抑制作用的活性成分主要是α-細辛醚和細辛醛［16］，但白粉菌為子囊菌亞門的真菌，而本試驗所用真菌基本為半知菌亞門真菌，是否為同一成分在起作用，需要進一步驗證。

表2 不同濃度石菖蒲對蘋果炭疽病菌菌絲的抑制作用Table2 Inhibitory effect of ethanol extract of A.tatarinowii against growth of C.Gloeosporioidies

圖2 石菖蒲提取物對菌絲形態(tài)的影響（40×）Fig.2 Effect of A.tatarinowii extract on mycelium morphology（40×）

殺菌劑對細胞壁的作用大多是響細胞壁的形成，達抑制或殺滅真菌的目的［17］。因此大多藥物處理真菌菌絲后，菌絲會發(fā)生破裂，原生質滲漏，如從心黎等曾報道過YX 擬青霉菌發(fā)酵濃縮物引起馬鈴薯晚疫病菌菌絲扭曲、破裂、分枝增多、菌絲膨大［17］。而本研究中，石菖蒲提取物處理蘋果炭疽病菌菌絲后，并無明顯的菌絲破裂，只是表現明顯的生長受抑和菌絲變短、分枝增多。真菌菌絲絲狀生長是高度專一性的頂端生長，其中幾丁質扮演了重要角色。幾丁質是真菌細胞壁的主要成分，在真菌菌絲體頂端細胞中含有其合成酶體，它會源源不斷的運送幾丁質合成酶到菌絲尖端細胞壁表面，使該處不斷合成幾丁質微纖維，從而保證菌絲不斷向前延伸［18］。本研究中菌絲的生長受阻，不能向前延伸，分枝增多，可能是抑制了幾丁質合成酶的產生，導致細胞壁上纖維原的結構發(fā)生變形所致，相關結果需進一步研究。

與化學農藥相比，植物源農藥來源于自然，具有對生態(tài)環(huán)境友好、無污染、不易產生抗藥性、且生產原料廣泛等特點和優(yōu)點，應用前景廣闊。本研究結果證明了石菖蒲提取物有很好的室內抑菌活性，有待進一步田間試驗和農藥的開發(fā)。