王小蓓 王秀靜 李麗霞

關(guān)鍵詞：小珊瑚藻;雙向電泳;蛋白質(zhì);提取方法

蛋白質(zhì)組學是以細胞內(nèi)存在的全部蛋白質(zhì)及其活動規(guī)律為研究對象，是繼基因組學之后在分子水平上了解生命過程邏輯性的第2步，是后基因組時代生命科學研究的核心內(nèi)容之一。蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)主要包括雙向電泳技術(shù)、質(zhì)譜分析技術(shù)和生物信息學技術(shù)等，其中，雙向電泳技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組學研究的有效技術(shù)[1-2]。與陸地高等植物相比，有關(guān)海洋藻類的蛋白質(zhì)組學研究相對滯后，但近年來該方面的研究日益興起。程華民等探討了2種不同方法提取珊瑚總蛋白質(zhì)的差異[3];王會芳等研究了龍須菜的蛋白質(zhì)提取條件及雙向電泳的優(yōu)化方案[4];Zou等研究了羊棲菜在重金屬銅脅迫條件下差異蛋白的變化特征等[5]。小珊瑚藻（Corallina pilulifera），隸屬于紅藻門小珊瑚藻科，藻體直立叢生，具鈣化特征，生活于中潮帶巖礁上或石沼內(nèi)，全藻可供藥用。目前對其作用于赤潮微藻克生效應影響[6]、化學組成成分鑒定[7]、光合及鈣化作用等已有一些研究報道[8]，但迄今對于小珊瑚藻的蛋白質(zhì)組學研究尚未見到相關(guān)報道。小珊瑚藻因其屬鈣化藻類，對海洋酸化有高敏感度，對小珊瑚藻蛋白質(zhì)的研究必將會為海藻蛋白質(zhì)的綜合開發(fā)利用提供更多的選擇[9]。

海藻蛋白有多種不同提取方式，不同的藻類所適合的蛋白提取方式不同。本研究以具有代表性的潮間帶鈣化海藻小珊瑚藻為試驗材料，對常用的蛋白質(zhì)提取方法，包括飽和酚抽提法、三氯乙酸（TCA）-丙酮沉淀法、Trizol提取蛋白法、Biozol提取蛋白法、飽和硫酸銨沉淀法進行全面比較及探索優(yōu)化，篩選出蛋白質(zhì)提取的最優(yōu)方法，并從膠條pH值和分離膠濃度研究探討雙向電泳系統(tǒng)的優(yōu)化方案，以期為潮間帶大型海藻小珊瑚藻逆境蛋白質(zhì)組學分析提供技術(shù)支撐，并為研究海洋紅藻門其他海藻尤其是珊瑚藻目海藻的蛋白質(zhì)組學研究提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小珊瑚藻采集于山東省煙臺市月亮灣潮間帶，采樣后立刻用消毒海水反復沖洗以去除可見的附生物及沉積物。約30 g小珊瑚藻（鮮質(zhì)量）作為1個處理，培養(yǎng)于盛有3.5 L滅菌海水的玻璃缸中，玻璃缸直徑為20 cm。海水持續(xù)充氣并每日更換。經(jīng)過3 d的預培養(yǎng)后，取材進行蛋白質(zhì)的提取試驗。

1.2 蛋白提取方法

取小珊瑚藻適量，加入液氮研磨成粉狀，-80 ℃ 保存?zhèn)溆?。采用如?種方法來提取蛋白質(zhì)。

1.2.1 飽和酚抽提法 飽和酚法基本參照Wang等的方法[10]并進行部分改進。

向適宜小珊瑚藻細粉中加入8 mL 10% TCA丙酮提取液，4 ℃，15 000 r/min離心20 min，去除上清液;加入10 mL預冷丙酮重復上一步驟1次;冰上干燥。加入4 mL酚抽提液[30%蔗糖，0.25 mol/L 三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl），pH值為8.0，0.05 mol/L 乙二胺四乙酸二鈉，0.10 mol/L KCl，2%十二烷基硫酸鈉（SDS），0.02 mol/L二硫蘇糖醇（DTT）]，混勻;加入4 mL Tris-丙酮-酚，在4 ℃條件下混勻1 h;4 ℃條件下，15 000 r/min離心 20 min，取上層酚層溶液于另一支15 mL離心管中，加入3倍體積的0.1 mol/L醋酸銨甲醇溶液，-20 ℃ 沉淀1 h;4 ℃ 下，15 000 r/min離心20 min取沉淀，加入 1 mL 丙酮（含0.02 mol/L DTT），4 ℃條件下，15 000 r/min 離心10 min，重復2次，收集沉淀;冷凍干燥，-20 ℃或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 TCA-丙酮沉淀法提取蛋白質(zhì) TCA-丙酮沉淀法基本參照Giavalisco等的方法[11]進行。

取適量海藻細粉在15 mL離心管中，加入3～4倍預先配好的提取液A（10% TCA 5 g+0.07%巰基乙醇35 μL+丙酮50 mL），搖勻后，放入-20 ℃冰箱中靜置2 h，中間搖勻1次;4 ℃，12 000 r/min 離心30 min;棄上清液，加入提取液B（0.07% 巰基乙醇35 μL+丙酮50 mL），混勻，置于 -20 ℃ 冰箱中靜置2 h，中間搖勻1次，4 ℃，12 000 r/min離心，30 min;重復1～2次;棄上清，冷凍干燥，置于 -20 ℃ 或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 Trizol提取蛋白法 Trizol法參照Lee等的方法[12]并進行部分改進。

向小珊瑚藻細粉中加入3 mL Trizol試劑，充分振蕩使其反應完全，超聲破碎5 min;在細胞勻漿中加入0.6 mL三氯甲烷，充分混勻;室溫放置2～3 min;4 ℃條件下，12 000 r/min離心10 min;小心吸取并丟棄上層液體，保留中間層及有機相，加入0.9 mL無水乙醇，顛倒充分混勻;4 ℃條件下，3 200 r/min 離心5 min;小心吸取上層有機相，加入4.5 mL異丙醇，輕輕振蕩后室溫放置10 min;4 ℃條件下，12 000 r/min離心10 min;棄上清液，取沉淀，用清洗液（乙醇）清洗沉淀2～3次，4 ℃ 條件下，7 500 r/min 離心5 min;冷凍干燥，置于 -20 ℃ 或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Biozol提取蛋白法 將Trizol提取蛋白法中的Trizol試劑替換成Biozol試劑，其他步驟同Trizol提取蛋白法。

1.2.5 飽和硫酸銨沉淀法 飽和硫酸銨沉淀法基本參照葉翠芳等的方法[13]進行。

取適量海藻細粉至4.5 mL離心管中，加入 2 mL 蛋白提取液（8 mol/L尿素，50 mmol/L維生素C，0.1 mol/L Tris，1 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），1% β-巰基乙醇，0.5 mmol/L苯甲基磺酰氟，pH值為7.8），混合均勻后在4 ℃條件下存放過夜。4 ℃條件下，10 000 r/min離心20 min，去除沉淀，在冰浴條件下少量多次加入硫酸銨至飽和，4 ℃ 條件下存放12 h;4 ℃條件下，10 000 r/min離心20 min，棄上清液，取沉淀。向沉淀中加入 1.5 mL 裂解液，裂解液包含8 mol/L尿素、0.06 mol/L DTT、4% 3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS）、0.04 mol/L Tris-HCl，pH值為8.8，并且使沉淀懸浮。4 ℃條件下，10 000 r/min 離心 20 min，去除沉淀，保留上清液。

1.3 蛋白質(zhì)裂解及濃度測定

將干燥的蛋白質(zhì)干粉溶于樣品裂解液[8 mol/L尿素、60 mmol/L DTT、4% CHAPS、40 mmol/L Tris-HCl、0.1%固相pH值梯度（IPG）緩沖液）]，充分溶解蛋白質(zhì);室溫下12 000 r/min離心15 min，取上清液，并再次離心，充分去除雜質(zhì)。蛋白質(zhì)濃度的測定采用Bradford法[14]。

1.4 雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，簡稱2-DE）

等電聚焦電泳（IEF）過程采用預制IPG膠條（17 cm、pH值為4～7），按照等電聚焦儀器IPGphor等電聚焦系統(tǒng)設定程序進行;蛋白質(zhì)樣品取100 μL左右（根據(jù)濃度及染色方法而定），取220 μL左右制備好的水化上樣緩沖液（取出冷凍保存的水化液，室溫解凍后，加入DTT 0.5 mg/100 μL 及固相pH值梯度緩沖液 0.5 μL/100 μL），吹吸混勻。取出聚焦槽，均勻加入混有樣品的水化液，將膠條膠面朝下放入，被動吸收1 h;在膠條上覆蓋1.5 mL礦物油，將膠條槽轉(zhuǎn)移至IPGphor上，按表1中的參數(shù)進行聚焦。

等電聚焦電泳過程結(jié)束后， 將膠條分別置于含1% DTT和2.5%碘乙酰胺的平衡液（6 mol/L尿素，0.5 mol/L Tris-HCl，pH值為8.8，2% SDS，20%甘油）中分別平衡15 min;轉(zhuǎn)移至分離膠濃度為 12.5%，厚度為1 mm的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）膠上端，進行垂直板電泳;電泳完成后，取下凝膠，采用硝酸銀染色法對凝膠進行染色。

1.5 圖像掃描及分析

凝膠脫色后立即用Image Scanner掃描儀進行掃描，分辨率為300 dpi。圖像采用PDQuest Advanced 8.0.1分析軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種提取方法提取小珊瑚藻藻體總蛋白質(zhì)的電泳圖譜質(zhì)量比較

本研究對常用的5種蛋白質(zhì)提取方法的雙向電泳圖譜效果進行橫向比較及質(zhì)量分析。由圖1可知，飽和硫酸銨沉淀法提取的小珊瑚藻蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜極不理想，有片狀蛋白陰影出現(xiàn)，分離非常不徹底，雙向電泳效果極差（圖1-e）。Biozol提取蛋白法所得圖譜在酸性區(qū)出現(xiàn)大片空白，幾乎無蛋白質(zhì)點出現(xiàn)，堿性區(qū)也只檢測到數(shù)量十分有限的蛋白點（圖1-d）。Trizol提取蛋白法可分離出標志性蛋白斑點，但蛋白質(zhì)點數(shù)較少，在堿性區(qū)有較多橫向條紋，影響蛋白質(zhì)的分布及觀察（圖1-c）。TCA-丙酮沉淀法所得到的圖譜分離效果較好，pH值分布范圍較為合理，較飽和硫酸銨沉淀法、Trizol及Biozol提取蛋白法等3種方法酸性區(qū)蛋白質(zhì)點明顯增多且清晰，但仍有較多縱向、橫向條紋（圖1-b）。飽和酚抽提法圖譜質(zhì)量最高，蛋白純度得到有效提升，在酸性區(qū)及堿性區(qū)聚焦均較好，能檢測到的蛋白質(zhì)點最多，且形狀規(guī)則，無明顯縱向、橫向條紋，可以達到理想的分離效果（圖1-a）。

2.2 5種提取方法所得圖譜蛋白質(zhì)點數(shù)量差異比較

5種提取方法所得小珊瑚藻電泳圖譜蛋白質(zhì)點數(shù)量見圖2-A。由圖可知，飽和硫酸銨沉淀法及Biozol提取蛋白法中損失了大量蛋白質(zhì)，且雜質(zhì)干擾過多，分離出的蛋白質(zhì)點數(shù)量較少;Trizol提取蛋白法略好;TCA-丙酮沉淀法除雜效果較好，能檢測到482個蛋白質(zhì)點;相比上述方法，飽和酚抽提法使蛋白質(zhì)得到最為有效的分離，且蛋白質(zhì)中的雜質(zhì)去除效果較理想，檢測到的蛋白點數(shù)量為458。

2.3 5種提取方法提取小珊瑚藻總蛋白質(zhì)濃度比較

研究表明，用不同的提取蛋白質(zhì)方法所獲得的小珊瑚藻蛋白質(zhì)濃度不同（圖2-B），TCA-丙酮沉淀法提取的蛋白質(zhì)濃度最大，其次為飽和酚抽提法，但其差異并未達到顯著水平（P>0.05），Trizol提取蛋白法、飽和硫酸銨沉淀法提取的蛋白質(zhì)濃度與TCA-丙酮沉淀法、飽和酚抽提法相比均達顯著水平（P<0.05），Biozol提取蛋白法提取的蛋白質(zhì)濃度與TCA-丙酮沉淀法、飽和酚抽提法相比，蛋白質(zhì)濃度差異達極顯著水平（P<0.01）。

2.4 不同膠條pH值對蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)果的影響

試驗設置2種不同pH值的膠條進行2-DE比對分析。膠條pH值為4～7時，蛋白點在圖譜上分布均勻，分離情況良好，結(jié)果見圖3-a;當膠條pH值為5～8時，由于酸性端pH值不足導致等電點較低的部分蛋白質(zhì)并未得到有效分離，蛋白質(zhì)點主要集中在左側(cè)，且存在多點重疊現(xiàn)象，分離效果較差，僅得到189個蛋白質(zhì)點（圖3-b）。

2.5 不同分離膠濃度對蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)果的影響

研究2種不同的分離膠濃度對蛋白質(zhì)分離效果的影響，結(jié)果見圖4。當分離膠濃度為12.5%時，得到289個蛋白質(zhì)點，蛋白質(zhì)點形狀規(guī)則且分布情況良好（圖4-a）;當分離膠濃度為10.5%時，僅得到93個蛋白質(zhì)點，蛋白質(zhì)點分布靠近圖譜邊緣，低分子量蛋白質(zhì)無法分離得到（圖4-b）。

3 討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，海藻蛋白質(zhì)的開發(fā)利用是學者們研究的熱點領(lǐng)域。蛋白質(zhì)樣品的制備是雙向電泳成功的前提[15-17]，采用不同方法提取的蛋白質(zhì)電泳效果會有顯著不同，尤其對于富含色素、多酚、多糖等次生代謝產(chǎn)物的海洋材料來說，其蛋白質(zhì)樣品的高效、高質(zhì)量制備顯得尤為困難。不同種類的海藻，其蛋白質(zhì)含量也有所不同。通常綠藻和紅藻蛋白含量高于褐藻，一般情況下紅藻的蛋白質(zhì)含量范圍為10%～47%[18-19]。

海藻蛋白質(zhì)有多種提取方式，不同的藻類所適合的蛋白質(zhì)提取方式不盡相同，由于本研究的試驗材料小珊瑚藻具有明顯的鈣化特征[20]，且藻紅素色素含量較高等特殊性質(zhì)，因此，不能簡單借鑒其他海藻材料的某一種蛋白質(zhì)提取方法，有必要對常見的幾種蛋白質(zhì)提取方式同時進行綜合比較及改良優(yōu)化。趙宇鵬等比較了硫酸銨沉淀法、TCA/丙酮法及酚提取法對條斑紫菜葉狀體總蛋白的提取效果，發(fā)現(xiàn)酚提取法能有效去除雜質(zhì)，得到最理想的電泳圖譜[21]，本研究的試驗結(jié)果與之相似。

Trizol法和Biozol法是提取植物中RNA的常用方法，也有學者將其創(chuàng)新性地用于蛋白質(zhì)的提取中[4，12]。苯酚、異硫氰酸胍是Trizol的主要成分，可使細胞裂解，蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)快速從細胞釋放。加入三氯甲烷后并離心后，溶液分為含有RNA的水相、含有DNA和蛋白質(zhì)的中間層和有機相。取出水相，用異丙醇可沉淀回收RNA，用乙醇沉淀可回收中間層DNA，用異丙醇沉淀可回收有機相中的蛋白質(zhì)并能夠去除蛋白質(zhì)中的水分。本研究中，Trizol提取蛋白法與Biozol提取蛋白法也可獲得小珊瑚藻蛋白質(zhì)，但所提取的小珊瑚藻蛋白質(zhì)濃度及純度均不理想，且由于Trizol試劑與Biozol試劑價格因素，因此這2種提取方式不提倡使用。

飽和硫酸銨沉淀法提取的小珊瑚藻蛋白質(zhì)測得的濃度雖然較高，但電泳圖譜出現(xiàn)大量蛋白陰影，只能得到個別蛋白斑點，說明所提取的蛋白質(zhì)純度很低，其原因可能是飽和硫酸銨沉淀法提取的小珊瑚藻蛋白質(zhì)所含鹽分及鈣質(zhì)過多，透析無法清除，因此對雙向電泳影響較大，該法不適合提取小珊瑚藻蛋白質(zhì)。

由Bradford法測定的小珊瑚藻蛋白質(zhì)濃度和雙向電泳圖譜可知，飽和酚抽提法提取小珊瑚藻蛋白質(zhì)為最優(yōu)方法，蛋白質(zhì)分離良好，圖譜背景較為清晰，無明顯縱橫條紋，說明此方法提取的蛋白質(zhì)濃度高且純度較高。相比之下，TCA-丙酮沉淀法提取的蛋白質(zhì)圖譜中縱橫條紋稍多，但其具備簡單方便的優(yōu)點，亦可作為小珊瑚藻蛋白質(zhì)提取方法的選擇之一。

膠條pH值及SDS-PAGE分離膠的濃度是影響雙向電泳的結(jié)果的重要因素。膠條pH值范圍對蛋白質(zhì)的雙向電泳的分離效果會產(chǎn)生顯著影響，pH值范圍不合適導致蛋白質(zhì)有部分重疊，甚至會丟失某些蛋白質(zhì)。本研究結(jié)果表明，膠條pH值為4～7時，蛋白質(zhì)點在凝膠上分離情況較好，蛋白質(zhì)點分布均勻，蛋白質(zhì)點之間重疊較少且彼此之間界限明顯，從而可以分離得到更多的蛋白質(zhì)點，電泳分辨率得到較好提升，此結(jié)論與梁文裕等學者的研究結(jié)果[22-23]基本一致。

不同的分離膠濃度使蛋白質(zhì)的分離效果亦有一定差異，須要根據(jù)實際情況選擇較為合適的分離膠濃度。本研究結(jié)果表明，分離膠濃度為12.5%時對小珊瑚藻的蛋白質(zhì)點分離效果優(yōu)于分離膠濃度為 10.5% 時。當分離膠濃度較低時，蛋白質(zhì)點的電泳位置靠近凝膠底端，較多低分子量的蛋白質(zhì)被丟失，從而在凝膠上不能顯示，這與王會芳等的研究結(jié)果[4]較為一致。因此，分離膠濃度為12.5%時更適合小珊瑚藻總蛋白雙向電泳的分離。

綜上所述，本研究對小珊瑚藻總蛋白提取及 2-DE電泳條件進行了一系列優(yōu)化，建立了一套適合小珊瑚藻總蛋白的2-DE體系，為小珊瑚藻蛋白質(zhì)組的研究奠定了有效基礎，同時亦可為其他紅藻門大型海藻蛋白質(zhì)組學研究提供重要的參考依據(jù)。

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