外源人絨毛膜促性腺激素誘導(dǎo)黑邊石斑魚排卵的研究

徐文剛，唐永政，張建柏，征矢野清，鄒華鋒

（1.煙臺(tái)大學(xué)海洋學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005；2.煙臺(tái)市海洋經(jīng)濟(jì)研究院，山東 煙臺(tái) 264003；3.長(zhǎng)崎大學(xué)中國(guó)東海環(huán)境資源研究所，日本 長(zhǎng)崎 851-2213；4.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心/水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306）

【研究意義】硬骨魚類的成熟以及排卵和排精主要受到以下丘腦-垂體-性腺軸為中心的內(nèi)分泌系統(tǒng)和外界環(huán)境因子的綜合影響［1］。魚類受到光照和水溫等環(huán)境因子的刺激后，在下丘腦合成促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone, GnRH），GnRH誘導(dǎo)垂體合成促性腺激素（gonadotropins, GtHs），GtHs中的促黃體激素（luteinizing hormone, LH）能誘導(dǎo)生殖細(xì)胞合成成熟誘導(dǎo)激素（maturation-inducing hormone,MIH），最終促進(jìn)排卵和排精［1］。因此，GnRH和GtHs對(duì)誘導(dǎo)魚類成熟具有重要作用。但是，由于對(duì)誘導(dǎo)對(duì)象魚種的GnRH和GtHs的精制較為困難，目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)上常用人工合成的促黃體激素釋放激素類似物（Luteinzing hormone releasing hormone analog, LHRHa）或人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin,HCG）作為替代品［2-3］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國(guó)內(nèi)有報(bào)道運(yùn)用HCG誘導(dǎo)雌性花鰻鱺（Anguilla marmorata）性腺成熟［4］以及注射LHRH對(duì)刀鱭（Coilia nasus）催產(chǎn)效果的影響［5］，而有關(guān)石斑魚催產(chǎn)和人工繁殖的研究?jī)H在赤點(diǎn)石斑魚（Epinephelus akaara）［6］、鞍帶石斑魚（E.lanceolatus）［7］和蜂巢石斑魚（E.merra）［8］中有少量報(bào)道。此外，也有少量與石斑魚的胚胎發(fā)育、生長(zhǎng)和疾病相關(guān)的研究報(bào)道［9-11］。黑邊石斑魚（E.fasciatus）廣泛分布在中國(guó)、日本本州中部以南，以及印度洋和太平洋的熱帶和溫帶區(qū)域，是一種最大規(guī)格為50 cm左右的中小型石斑魚類［12］。作為東亞地區(qū)重要的水產(chǎn)資源，其具有很高的市場(chǎng)價(jià)值，且被認(rèn)為高級(jí)魚的代表之一。黑邊石斑魚是一種先雌后雄的海水魚類，一般在孵化后80～120日齡時(shí)性腺分化為雌性，之后在2～3齡時(shí)性腺發(fā)育成熟并排卵，在3～4齡時(shí)性逆轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌裕?2］。此前，有關(guān)黑邊石斑魚的人工繁殖的技術(shù)以及孵化后幼魚的生長(zhǎng)在日本東京小笠原水產(chǎn)研究所有少量研究報(bào)道［13-14］，為其魚苗的大規(guī)模培育提供了有價(jià)值的線索。

【本研究切入點(diǎn)】目前由于黑邊石斑魚的人工繁殖技術(shù)在我國(guó)尚未完全獲得成功，因此其苗種的獲得主要依靠天然捕撈，而過度捕撈和市場(chǎng)上的巨大需求導(dǎo)致其產(chǎn)量快速下降。雖然國(guó)內(nèi)在石斑魚雜交上的人工繁殖技術(shù)已經(jīng)取得巨大突破，其雜交子二代的養(yǎng)殖產(chǎn)量也逐漸提高［15-16］，但尚未見與黑邊石斑魚人工繁殖相關(guān)的報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以在日本長(zhǎng)崎市東海海域所捕獲的成熟黑邊石斑魚為研究對(duì)象，使用不同劑量的HCG在繁殖季節(jié)對(duì)雌魚進(jìn)行催產(chǎn)和成熟誘導(dǎo)，記錄其成熟后的狀態(tài)。此外，比較不同處理劑量下黑邊石斑魚排卵孵化的效應(yīng)時(shí)間以及雌雄交配后受精率和孵化率的差異，優(yōu)化得出雌魚的最佳HCG催產(chǎn)劑量和效應(yīng)時(shí)間，以期為今后黑邊石斑魚魚苗在國(guó)內(nèi)大規(guī)模的人工繁殖和生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年6—7月在日本長(zhǎng)崎市東海海域捕獲到活的黑邊石斑魚約40尾，自然水溫和光照下暫養(yǎng)在5 t 左右的FRP水槽中。5 d后用細(xì)長(zhǎng)的導(dǎo)管插入魚體卵巢內(nèi)，采集小部分卵巢組織后，在顯微鏡下確認(rèn)其卵母細(xì)胞的直徑。挑選腹部柔軟膨大，卵巢輪廓明顯，生殖孔紅潤(rùn)，且卵母細(xì)胞直徑為400 μm以上的雌魚作為試驗(yàn)魚，總數(shù)量18尾。雄魚的選取標(biāo)準(zhǔn)為出現(xiàn)婚姻色，輕壓腹部有乳白色精液流出。為了便于今后識(shí)別，在雌魚背部肌肉內(nèi)插入微型電子芯片（FishID SST-1,Destron Fering）進(jìn)行標(biāo)記。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組 試驗(yàn)設(shè)注射相同劑量生理鹽水的對(duì)照處理和200 IU/kg HCG處理、500 IU/kg HCG處理，各處理隨機(jī)分配6尾雌魚。HCG激素溶液參照Nambu［17］的方法配制。測(cè)量雌魚的體長(zhǎng)（total length, TL）和體質(zhì)量（body weight,BW），計(jì)算肥滿度（condition factor, CF）：CF（%）= TL/BW3×100。各處理中魚的體長(zhǎng)、體質(zhì)量和肥滿度均無(wú)顯著性差異（表1）。

表1 供試黑邊石斑魚的體長(zhǎng)、體質(zhì)量和肥滿度Table 1 Total length, body weight and condition factor of E.fasciatus in the experiment

1.2.2 人工催產(chǎn) 7月29日至8月1日，使用1 mL注射器，將HCG注入魚體側(cè)背部肌肉處后觀察試驗(yàn)魚排卵的變化。注射后，在效應(yīng)時(shí)間內(nèi)，觀察到200 IU/kg HCG處理中的個(gè)體出現(xiàn)排卵現(xiàn)象，故停止注射試驗(yàn)；由于沒有觀察到500 IU/kg HCG處理出現(xiàn)排卵現(xiàn)象，在 8月11—17日，繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行第二次注射試驗(yàn)。對(duì)照處理均在同一時(shí)間進(jìn)行注射。

1.2.3 卵母細(xì)胞的采樣和組織學(xué)觀察 在注射前、注射時(shí)和注射后的各時(shí)段，使用卵細(xì)胞抽取器在試驗(yàn)魚的泄殖孔提取少量卵細(xì)胞用于檢測(cè)該時(shí)段卵母細(xì)胞的發(fā)育情況。采集后立即置于波恩試劑中固定24 h后于70%的乙醇中保存用于組織學(xué)分析。組織學(xué)分析步驟參照Shein等［18］的方法，性腺分期和描述如下：

（1）第三次卵黃球前期（Tertiary yolk1,Ty1）：細(xì)胞質(zhì)中已積累大量卵黃，細(xì)胞核周圍有油球開始聚集，但核移動(dòng)還未開始。

（2）第三次卵黃球后期（Tertiary yolk2,Ty2）：細(xì)胞質(zhì)中已積累大量卵黃，細(xì)胞核周圍有大量油球聚集，核移動(dòng)即將開始。

（3）核移動(dòng)期（Migratory nucleolus, Mn）：細(xì)胞核移動(dòng)到動(dòng)物極一側(cè)。

（4）成熟期（Mature, M）：細(xì)胞核破裂，卵黃球和油球融合且分散在細(xì)胞質(zhì)中。

（5）完熟期（Ripe, R）：卵母細(xì)胞通過吸水達(dá)到透明化的狀態(tài)。

（6）濾泡閉鎖卵母細(xì)胞（Atrefic follicle oocyte, Af）：又稱退行卵母細(xì)胞，濾泡細(xì)胞與未發(fā)育的卵母細(xì)胞結(jié)合形成閉鎖卵泡，并對(duì)卵母細(xì)胞的殘?bào)w和碎片進(jìn)行吞噬和消化。

1.2.4 魚成熟度的確認(rèn) 排卵前，在魚的卵巢內(nèi)插入一根細(xì)長(zhǎng)的導(dǎo)管，采集部分卵巢組織，在顯微鏡下測(cè)量其中15～30粒卵母細(xì)胞的直徑，直徑大于500 μm即可視為其已經(jīng)完熟并具備排卵的條件。200 IU/kg HCG處理插入導(dǎo)管的時(shí)間為注射前24 h，HCG注射時(shí)以及注射后30、36、42、48、54、60 h。500 IU/kg HCG處理插入導(dǎo)管的時(shí)間除了與前述處理一致外，須在第二次注射后30、36、42、48、54、60、66 h后再次對(duì)成熟度進(jìn)行確認(rèn)。

1.2.5 人工授精以及受精率和孵化率的計(jì)算 對(duì)具備排卵條件的個(gè)體，擠壓腹部采集卵子；對(duì)成熟的雄性，擠壓腹部采集精子，并采用婁忠玉等［19］的干導(dǎo)法進(jìn)行人工授精。人工授精后，用海水清洗受精卵，放置在1 L量筒中。靜置后分為上浮卵和下沉卵，將上浮卵回收在500 mL的容器中，并將容器放置在維持自然水溫的水槽中。人工授精后2.5 h取100粒受精卵轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下觀察細(xì)胞分裂的情況，計(jì)算受精率。此外，根據(jù)受精后24 h孵化的魚苗數(shù)量以及死亡卵數(shù)，計(jì)算孵化率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。采用Kolmogorov-Smirnov或 Shapiro-Wilk法進(jìn)行正態(tài)分布檢測(cè)，利用ANOVA檢驗(yàn)以及 Tukey’s HSD 法進(jìn)行差異性比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理注射HCG前后卵母細(xì)胞發(fā)育階段的變化

2.1.1 對(duì)照處理與200 IU/kg HCG處理的比較 對(duì)黑邊石斑魚性腺進(jìn)行組織學(xué)切片和染色，其各發(fā)育階段分期如圖1所示。根據(jù)圖1判定對(duì)照處理和200 IU/kg HCG處理注射前24 h、注射時(shí)和注射后30、36、42、48、54、60 h卵母細(xì)胞的發(fā)育階段，如表2所示。對(duì)照處理中，注射前6尾魚卵母細(xì)胞均處于Ty1階段，注射后60 h 4尾魚卵母細(xì)胞處于Ty1階段，2尾魚處于Ty2階段。200 IU/kg HCG處理中，注射HCG 24 h前，6尾魚中有5尾魚為Ty1階段；注射HCG時(shí)，5尾魚為Ty2階段；注射HCG 30、36、42和54 h后1尾魚觀察到核移動(dòng)卵母細(xì)胞（Mn），2尾魚為Ty2階段；但注射48 h后2尾魚出現(xiàn)Mn階段，1尾魚為Ty2階段；注射60 h后1尾魚出現(xiàn)排卵現(xiàn)象，其余5尾魚均為Ty2階段。

2.2.2 對(duì)照處理與500 IU/kg HCG處理的比較 根據(jù)圖1判定，對(duì)照處理和500 IU/kg HCG處理注射前 24 h、第一次注射 0、30、36、42、48、54 h后以及第二次注射 0、30、36、42、48、54、60、66 h卵母細(xì)胞的發(fā)育情況，如表3所示。對(duì)照處理在第二次注射后66 h，3尾魚卵母細(xì)胞處于Ty1階段，3尾魚處于Ty2階段。500 IU/kg HCG 處理中注射HCG 24 h前，6尾魚中只有2尾魚卵母細(xì)胞為Ty1階段。此外，雖然注射HCG 48—54 h后，所有檢測(cè)到的尾魚均為Ty2階段，但并未觀察到成熟的卵母細(xì)胞，因此繼續(xù)進(jìn)行第二次注射試驗(yàn)。第二次注射后42—60 h，檢測(cè)到1尾魚出現(xiàn)Mn階段；注射后66 h，所有個(gè)體均無(wú)法排卵且觀察到了退行的卵母細(xì)胞（Af）。

圖1 不同發(fā)育階段雌性黑邊石斑魚性腺的切片F(xiàn)ig.1 Histological sections of female E.fasciatus at different gonadal development stages

表2 對(duì)照處理和200 IU/kg HCG處理前后黑邊石斑魚卵母細(xì)胞發(fā)育階段的變化Table 2 Changes of E.Fasciatus in the oocyte development stage under control and 200 IU/kg HCG treatments

2.2 不同處理注射HCG后卵母細(xì)胞直徑的變化

比較200 IU/kg HCG處理和500 IU/kg HCG處理中6尾魚HCG注射時(shí)和注射60 h后卵母細(xì)胞直徑的變化。HCG注射時(shí)，200 IU/kg HCG處理的4號(hào)個(gè)體卵母細(xì)胞直徑僅為477.0 μm，注射60 h后其為排卵階段，卵母細(xì)胞直徑增加至624.4 μm；500 IU/kg HCG處理的個(gè)體卵母細(xì)胞直徑無(wú)較大差異（表4）。

表3 對(duì)照處理和500 IU/kg HCG處理前后黑邊石斑魚卵母細(xì)胞發(fā)育階段的變化Table 3 Changes of E.Fasciatus in the oocyte development stage under control and 500 IU/kg HCG treatments

表4 200 IU/kg 和500 IU/kg HCG處理注射時(shí)和注射60 h后黑邊石斑魚卵母細(xì)胞直徑的變化Table 4 Changes of oocyte diameter of E.Fasciatus during and after 60 h of HCG injection under 200 IU/kg and 500 IU/kg treatments

2.3 不同處理注射HCG后受精率和孵化率的差異

200 IU/kg HCG處理獲得的總卵數(shù)為16 906粒，受精率為68.7%，孵化率為43%；500 IU/kg HCG處理因未觀察到排卵現(xiàn)象而無(wú)法統(tǒng)計(jì)受精率和孵化率。

3 討論

3.1 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)排卵的影響

本研究中，對(duì)照處理的黑邊石斑魚始終無(wú)法成熟，一直停留在第三次卵黃球發(fā)育（Ty）階段，但200 IU/kg HCG處理的卵母細(xì)胞在注射前處于Ty階段，注射48 h后卵巢已發(fā)育至核移動(dòng)期并成熟，60 h后確認(rèn)排卵。此外，該處理人工受精率為68.7%，孵化率為43%，表明劑量為200 IU/kg的外源HCG 激素可以誘導(dǎo)黑邊石斑魚成熟并排卵。褐石斑魚（E.bruneus）中，注射HCG 48 h后能夠誘導(dǎo)排卵，受精率約為90%，孵化率為60% ～ 80%［20］。七帶石斑魚（E.septemfasciatus）中，注射HCG 42 h后確認(rèn)排卵，受精率為70% ～ 98%，孵化率為70% ～100%［21］。與上述HCG誘導(dǎo)的時(shí)間相比，本研究的誘導(dǎo)時(shí)間60 h顯得稍長(zhǎng)，表明即使同為石斑魚魚種，其注射HCG激素后生殖生理變化和反應(yīng)速度也會(huì)有很大不同，從而導(dǎo)致排卵誘導(dǎo)時(shí)間的差異。此外，與其他石斑魚相比，本研究供試黑邊石斑魚的受精率和孵化率均較低，并且在成熟階段出現(xiàn)了很多退行卵母細(xì)胞。因此在今后的研究中，需要再次調(diào)整從成熟到排卵的效應(yīng)時(shí)間。

3.2 退行卵形成的主要原因

本試驗(yàn)中，雖然使用HCG誘導(dǎo)促進(jìn)了部分個(gè)體卵母細(xì)胞的成熟，但在很多個(gè)體的卵巢內(nèi)出現(xiàn)了退行卵，其形成的可能原因有以下方面：首先，在檢測(cè)魚的卵母細(xì)胞發(fā)育程度時(shí)，多次使用導(dǎo)管對(duì)魚的卵巢進(jìn)行取樣。對(duì)七帶石斑魚的研究表明，這些行為可能對(duì)魚產(chǎn)生物理性的影響，導(dǎo)致其壓力負(fù)荷大，發(fā)育成熟遲緩和退行［22］，這也可能是導(dǎo)致黑邊石斑魚退行卵形成的原因之一。此外，本研究中的試驗(yàn)魚是在東海捕獲的天然魚，而不是人工長(zhǎng)期飼養(yǎng)的親魚，因此其生理和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)也存在差異。研究表明，鳳尾魚（Engraulis mordax）處于饑餓下會(huì)引起卵巢卵的再吸收而導(dǎo)致其退化［23］。本試驗(yàn)中，采取無(wú)投食飼養(yǎng)的方法，可能是導(dǎo)致黑邊石斑魚退行卵形成的另一原因。研究表明，黑邊石斑魚從卵黃蓄積到成熟產(chǎn)卵的時(shí)間在6—7月，青銅石斑魚（E.aeneus）在4—7月［24］，赤點(diǎn)石斑魚在4—6月［25］，七帶石斑魚在 3—5月［18］，褐石斑魚在3—5月［26］。這些數(shù)據(jù)表明，其他石斑魚從卵黃蓄積到產(chǎn)卵的時(shí)間大概持續(xù)2個(gè)月左右，但黑邊石斑魚僅持續(xù)1個(gè)月，可能由于其成熟適應(yīng)期的時(shí)間太短而導(dǎo)致其成熟比例降低。此外，6—7月為高水溫時(shí)期，高水溫抑制成熟，因此卵黃蓄積后到成熟產(chǎn)卵的狀態(tài)難以得到長(zhǎng)期維持，也可能導(dǎo)致其無(wú)法正常排卵。

4 結(jié)論

本研究200 IU/kg HCG處理的6尾黑邊石斑魚在注射HCG 60 h后，最終雖然只有1尾魚成熟且排卵、受精和孵化，其結(jié)果可能具有偶然性。但本研究提供了以下可能性：在今后黑邊石斑魚人工繁殖和孵化的過程中，使用劑量為200 IU/kg外源HCG激素可能誘導(dǎo)其成熟且排卵；但為了提高排卵率、受精率和孵化率，其注射劑量和效應(yīng)時(shí)間還需要進(jìn)一步調(diào)節(jié)。此外，為了避免退行卵的形成，應(yīng)該注意防止水溫過高以及頻繁使用導(dǎo)管對(duì)魚的卵巢進(jìn)行破壞性取樣。目前，黑邊石斑魚人工繁殖技術(shù)的突破在國(guó)內(nèi)仍是一大難題，因此，在今后人工繁殖過程中應(yīng)綜合考慮以上因素。