降香黃檀葉枯病菌的鑒定及其生物學(xué)特性

陳瑤 李航宇 周德明

摘? 要：近年來，降香黃檀葉枯病的危害越來越嚴(yán)重，為深入了解該病菌特征，本研究對該病原菌進(jìn)行鑒定，以期為制定更有效的防治措施提供依據(jù)。本研究對降香黃檀葉枯病病株進(jìn)行病原菌分離，并對病原菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察及rDNA-ITS序列測定，確定該病原菌為天門冬擬莖點(diǎn)霉菌[Phomopsis asparagi （Sacc.） Bubak]。通過觀察該病原菌在不同培養(yǎng)基、溫度、pH、光照等4種環(huán)境因素中的生長情況，發(fā)現(xiàn)該病原菌在馬鈴薯果糖瓊脂培養(yǎng)基（PFA）中菌絲生長最快;菌絲在10～30 ℃均能生長，最適宜的生長溫度為25～30 ℃;最適宜的pH為6;光照對該病原菌的生長沒有顯著影響。

關(guān)鍵詞：降香黃檀;葉枯病;天門冬擬莖點(diǎn)霉;鑒定;生物學(xué)特性

中圖分類號：S763.15? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Identification and Biological Characteristics of Dalbergia odorifera Leaf Blight

CHEN Yao， LI Hangyu， ZHOU Deming*

Central South University of Forestry and Technology / Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration on Control of Artificial Forest Diseases and Pests in South China / Hunan Provincial Key Laboratory for Control of Forest Diseases and Pests / Key Laboratory for Non-wood Forest Cultivation and Conservation of Ministry of Education， Changsha， Hunan 410000， China

Abstract： In recent years， the harmfulness of Dalbergia odorifera leaf blight has become more and more serious. In order to provide a basis for the control and comprehensive treatment of this disease， the pathogenic fungus causing the disease was isolated and identified and the biological characteristics were studied. In this study， the pathogenic fungus was isolated from the pathogen of D. odorifera leaf blight， and the morphological observation of the pathogenic fungi was carried out. And the rDNA-ITS sequence was obtained by sequencing. The pathogenic fungus was identified as Phomopsis asparagi. Through experiments on the growth medium， temperature， pH value and illumination of the pathogens， the mycelial growth of the fungus in PFA medium was the fastest. The mycelium could grow at 10–30 ℃， and the optimum temperature for mycelium growth was 2530 ℃. The optimum pH for the mycelium growth was 6. Light had no significant effect on the growth of the pathogen.

Keywords： Dalbergia odorifera; leaf blight; Phomopsis asparagi; identification; biological characteristics

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.05.022

降香黃檀（Dalbergia odorifera），俗稱海南黃花梨，作為國家二級保護(hù)植物，是我國四大名木之一，其心材結(jié)構(gòu)致密，堅(jiān)硬極重，耐濕耐腐，紋理細(xì)密，有芳香氣味，是制造名貴家具、樂器、雕刻、工藝品的上等材料[1-2]。降香黃檀一般生長在熱帶地區(qū)，為我國海南省特有樹種。

目前，國內(nèi)外有關(guān)降香黃檀病蟲害的研究相對較少，大多數(shù)集中在降香黃檀生物學(xué)特性、引種育苗、造林栽培、藥理藥性等方面。伍慧雄等[3]在對廣東肇慶市國有林業(yè)總場屬下的3個林場和2個苗圃基地調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，降香黃檀的主要病害為炭疽病和細(xì)菌性穿孔病，主要蟲害為螟蛾類蛀梢害蟲。桑利偉等[4]對降香黃檀炭疽病的病原菌進(jìn)行研究，鑒定出降香黃檀炭疽病病原菌為膠孢炭疽菌[Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Sacc.]。劉洪灣等[5]、董文統(tǒng)等[6]對廣東省、海南省降香黃檀主要病蟲害進(jìn)行了全面調(diào)查，研究表明降香黃檀主要病蟲害有黑痣病、幼苗枯萎病、細(xì)菌性穿孔病、炭疽病、葉枯病、卷葉蟲、瘤胸天牛、金龜子、白蛾蠟蟬、局部黑斑等。降香黃檀的黑痣病和炭疽病導(dǎo)致病株葉片逐漸干枯或穿孔甚至脫落，影響了植物的生長與發(fā)育，對其成材也有較大影響[5-7]。目前，國內(nèi)外關(guān)于降香黃檀葉枯病害系統(tǒng)性的研究尚未見報道。為了進(jìn)一步了解降香黃檀葉枯病，本研究開展該病原菌的鑒定與生物學(xué)特性研究，從而為降香黃檀葉枯病的防治與綜合治理提供科學(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

病害樣本采自海南科大林業(yè)有限公司基地，樣本為新鮮的葉枯病帶葉病枝和健康的帶葉枝條。

1.2? 病原菌分離與純化

使用無菌不銹鋼手術(shù)刀在超凈工作臺上切取葉片病斑的病健康交界處組織，然后將其置于0.1%升汞中消毒30 s，并在無菌水中漂洗3次，再置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)皿中，在恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃下自然生長4 d。篩選出優(yōu)勢菌，將優(yōu)勢菌純化后放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，備用。

1.3? 致病性測定

將分離純化后的菌株培養(yǎng)3 d后接種到相同的健康降香黃檀離體葉片上，在28 ℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)3 d后，培養(yǎng)觀察。

1.4? 分離菌株的鑒定

1.4.1? 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定? 將菌株JXHT16置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間，待其產(chǎn)孢后，用顯微鏡觀察病原菌的菌落、菌絲、分生孢子梗及分生孢子的形態(tài)特點(diǎn)。

1.4.2? 病原菌的分子鑒定? 采用CTAB法提取病原菌DNA，并用紫外分光計檢測所提取的DNA濃度，將其稀釋至50 ng/μL備用[7]。擴(kuò)增采用真菌通用引物ITS1（5-TCCGTAGGTGAA CCT G C GG- 3）、ITS4（5-TCCTCCGCTTA TTGAT AT GC-3）（上海生工公司合成）。PCR反應(yīng)總體系（25 μL）：10倍緩沖液2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL，引物各1 μL，Taq酶（5 U/μL）0.25 μL，模板DNA 2.0 μL（對照組加ddH2O，其他條件同實(shí)驗(yàn)組），ddH2O 18.25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性5 min;95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min[8]。

1.5? 降香黃檀葉枯病病原菌生物學(xué)特性研究

1.5.1? 培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響? 將在28 ℃恒溫?zé)o菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d的病原菌菌株沿菌落邊緣用打孔器取直徑為6 mm的菌餅，分別接種到含有PDA、PSA、PMA、PLA、PFA、淀粉等不同碳源的平板培養(yǎng)皿上，每皿1片，每個處理重復(fù)3次，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用十字交叉法[9]每隔2 d分別測定菌落直徑，8 d后繪制菌絲生長速度的曲線圖，并進(jìn)行方差分析與多重比較[10]。

1.5.2? 溫度對病原菌菌絲生長的影響? 用打孔器取直徑為6 mm的病原菌菌餅接種到PDA平板上，分別置于0、5、10、15、20、25、30、35 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，處理重復(fù)3次，培養(yǎng)及測量方法同1.5.1。

1.5.3? pH對病原菌菌絲生長的影響? 用打孔器取直徑為6 mm的病原菌菌餅，分別接種到pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的PDA培養(yǎng)基上，處理重復(fù)3次，培養(yǎng)及測量方法同1.5.1。

1.5.4? 光照對病原菌菌絲生長的影響? 用打孔器取直徑為6 mm的病原菌菌餅接種到PDA平板上，分別置于全光照、半光照與黑暗條件下的28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，處理重復(fù)3次，培養(yǎng)及測量方法同1.5.1。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 病原菌的分離與鑒定

2.1.1? 病原菌分離與形態(tài)學(xué)鑒定? 降香黃檀葉枯病在田間主要危害葉部與枝條，從葉尖開始發(fā)病，然后逐漸擴(kuò)展到枝條。發(fā)病初期，病斑為水漬狀的小斑點(diǎn)，且呈“V”字形，由淡青色逐漸變?yōu)榈稚?，病斑慢慢向葉莖交界處擴(kuò)大，葉部中間稍凹陷，并變?yōu)樯詈稚饾u散生黑色小點(diǎn)（圖1A）。病原菌菌落生長初期內(nèi)呈白色，濃厚，棉絮狀，近圓形，具有整齊的外邊緣。4～5 d后菌落開始變?yōu)榈G色，具有隔菌絲與黑褐色分生孢子器（圖1E）。分生孢子一般有2種類型：一種為α型，呈橢圓形至紡錘形，為無色單胞，有的孢子兩端會有油球出現(xiàn)，大小為（3.0～5.2）μm×（2.2～2.8）μm（圖1B）;另一種為β型，絲狀無色單胞，一端略彎，大小為（17.5～35.0）μm×（1.3～1.8）μm。本研究中分生孢子均為α型，由于環(huán)境與樣本采集等不穩(wěn)定因素的影響，往往只能看到α型孢子[11]。

2.1.2? 致病性測定? 3 d后分離菌接種在健康降香黃檀葉片上產(chǎn)生癥狀（圖2A），由淡褐色逐漸變?yōu)樯詈稚?，與葉片初始感染葉枯病出現(xiàn)的癥狀基本一致，而空白對照并沒有出現(xiàn)癥狀。再分離菌株培養(yǎng)3 d的菌絲形態(tài)與原分離菌株表現(xiàn)一致（圖2B）。因此，可以確定分離的菌株即為降香黃檀葉的病原菌菌株。

2.1.3? 病原菌的分子鑒定? （1）病原菌菌株ITS區(qū)擴(kuò)增及其序列比對。病原菌菌株的rDNA ITS區(qū)（含5.8S區(qū)）PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖3，從圖3中可以看出，ITS區(qū)條帶約600 bp，PCR擴(kuò)增的條帶一致、清晰，無雜帶。

將測序所得JXHT16菌株的ITS序列輸入GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST搜索，得到一系列同源性比較高的同屬不同種的ITS序列，其中與GenBank登錄號為JQ614001的天門冬擬莖點(diǎn)霉菌的ITS區(qū)間同源性最高且大于99%（圖4）。從圖4可以看出，所測JXHT16菌株序列與JQ614001菌株序列相比，10號位點(diǎn)缺少一個堿基T，562號位點(diǎn)多了一個堿基A。

（2）菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建分析。根據(jù)系統(tǒng)樹規(guī)律鑒定種的方法，符合Taylor等[12]概述的用PSR（phylo genetic species recognition）來作為鑒定進(jìn)化種的標(biāo)準(zhǔn)。圖5結(jié)果顯示，JXHT16菌株與擬莖點(diǎn)霉屬菌株聚為一簇，遺傳關(guān)系最近。結(jié)合此病原菌的形態(tài)特征，確定降香黃檀葉枯病斑中分離出來的JX H T16菌株為擬莖點(diǎn)霉屬菌，且與天門冬擬莖點(diǎn)霉菌（JQ614001）具有最近的親緣關(guān)系。

2.2? 降香黃檀葉枯病原菌生物學(xué)特性

2.2.1? 不同的培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響? 不同的培養(yǎng)基對病原菌菌絲體的生長有不同的影響（圖6，表1），降香黃檀葉枯病原菌在PDA、PSA、PMA、PLA、PFA、淀粉培養(yǎng)基上均能生長，病原菌菌絲體在PFA培養(yǎng)基中生長最快，平均菌落直徑為4.94 cm，其次是PSA培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基，平均菌落直徑分別為4.85 cm和4.11 cm。淀粉培養(yǎng)基中生長最慢，平均菌落直徑僅為2.12 cm。從菌落的顏色和形態(tài)看，病原菌在各培養(yǎng)基上均存在差異，在PDA、PSA、PMA、PFA培養(yǎng)基上菌落更致密一些，在PLA、淀粉培養(yǎng)基上菌落較稀疏一些。

2.2.2? 溫度對病原菌菌絲生長的影響? 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響是不同的（圖7），病原菌菌絲可以在10～30 ℃生長，較適宜生長的溫度在20～30 ℃之間，平均菌落直徑為2.20～3.61 cm，最適宜的溫度在25～30 ℃之間，平均菌落直徑為3.62 cm。從圖中可以看出，溫度在0～5 ℃、35 ℃以上時病原菌菌絲幾乎不能生長。

2.2.3? 不同pH對病原菌菌絲生長的影響? 不同pH對病原菌菌絲生長的影響狀況（圖8），病原菌菌絲在pH為5～10均可以生長，但存在顯著性差異。在pH 6時，菌落生長最快，菌落直徑可以達(dá)到3.95 cm，菌落生長也很密集，所以最適宜菌落生長的pH為6。

2.2.4? 光照對病原菌菌絲生長的影響? 不同光照條件下對病原菌菌絲生長的影響不同（圖9），病原菌菌絲在全光照和半光照條件下的平均菌落直徑分別為4.94 cm和4.55 cm，差異不明顯。全光與全黑條件下菌落直徑平均相差1.43 cm，而全光與半光照條件下的平均菌落直徑差為0.39 cm，差異小于前者，研究結(jié)果表明在全光條件下菌絲生長表現(xiàn)更致密一些。

3? 討論

擬莖點(diǎn)霉屬[Phomopsis （Sacc.） Bubak]是半知菌類、腔孢綱、球殼孢目中的一個重要真菌屬，有性態(tài)是間座殼屬（Diaporthe），其種類多、分布較廣[13]，但其種間形態(tài)具有較大的相似性。1980年Sutton在The Coelomycetes中給出了擬莖點(diǎn)霉屬的定界，其主要形態(tài)學(xué)特征為：具有一個暗色的真子座質(zhì)的分生孢子器，產(chǎn)生2型分生孢子，甲（）型分生孢子無色、單胞、橢圓形、紡錘形或長橢圓形，常含有2個油球;乙（β）型分生孢子無色、單胞、線形，頂端常成鉤狀或卷曲。分生孢子梗無色，分枝;產(chǎn)孢細(xì)胞圓柱狀，內(nèi)壁芽生瓶體式[13]。長期以來擬莖點(diǎn)霉的?；砸恢北徽J(rèn)識到屬，因而種級分類主要是以寄主植物屬為基礎(chǔ)，寄生在同屬植物上形態(tài)相符的即為一種，寄生于不同屬植物即使是形態(tài)相近也常被命名為不同的種，截至2005年，報道該屬的寄主植物共有74科[14]。

本研究對降香黃檀葉枯病的病原菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)的鑒定，病原菌經(jīng)BLAST同源性比對，與天門冬擬莖點(diǎn)霉菌相似度達(dá)99%，經(jīng)形態(tài)學(xué)和ITS區(qū)間分子生物學(xué)鑒定降香黃檀葉枯病的病原菌為天門冬擬莖點(diǎn)霉菌[Phomopsis asparagi （Sacc.） Bubak]。

2005年Elena[15]首次報道了蘆筍上由天門冬擬莖點(diǎn)霉菌引起的病害，此病在保護(hù)地和露地均可為害，是影響蘆筍產(chǎn)量的典型病害[16]。而在降香黃檀和其他檀木類植物上未發(fā)現(xiàn)該病害的相關(guān)報道，本研究也是首次在降香黃檀葉片上發(fā)現(xiàn)由該病菌引起的病害。

通過對該病原菌的生物學(xué)特性研究，本研究得出以下結(jié)論：對降香黃檀葉枯病菌生長最有利的培養(yǎng)基為PFA培養(yǎng)基，平均菌落直徑為4.94 cm，PSA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基稍次之，平均菌落直徑分別為4.85 cm和4.11 cm。病原菌在可溶性淀粉培養(yǎng)基中生長速度最慢，平均菌落直徑僅為2.12 cm。該病原菌的最適生長溫度是25～30 ℃;最適合菌落生長的pH為6.0;光照對其生長影響不明顯。本研究結(jié)果與劉志恒等[16]、顧振芳等[17]研究結(jié)果一致。由于病原菌的復(fù)雜性，今后可以在降香黃檀葉枯病的流行規(guī)律以及降香黃檀葉枯病的無公害防治等方面開展研究，即可對降香黃檀林木的保護(hù)、降香黃檀林木病害的防治和綜合治理提供更多的科學(xué)依據(jù)。

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