滲透脅迫下水楊酸誘導(dǎo)的小桐子甜菜堿積累涉及Ca2+/CaM信號

楊雙龍 楊婷 龔明

摘? 要：本研究以小桐子幼苗為材料，在水培條件下，研究了外源水楊酸（SA）對PEG 6000脅迫下小桐子幼苗甘氨酸甜菜堿含量、代謝關(guān)鍵酶BADH活性和相關(guān)基因表達，以及Ca2+和CaM抑制劑對SA誘導(dǎo)甜菜堿積累的影響。結(jié)果表明：外源1.5 mmol/L SA處理可顯著提高滲透脅迫下小桐子幼苗的甜菜堿含量、增加甜菜堿合成關(guān)鍵酶BADH的活性，以及上調(diào)JcCMO和JcBADH的表達水平。與單獨用PEG處理的幼苗相比，SA處理也提高了滲透脅迫下小桐子幼苗的鈣調(diào)素（CaM）活性。此外，CaCl2處理能增強SA誘導(dǎo)的甜菜堿積累效應(yīng)，提高BADH的活性和上調(diào)JcBADH的表達水平，而Ca2+通道阻斷劑 LaCl3、CaM抑制劑CPZ和TFP處理得到相反的結(jié)果。這些結(jié)果表明，外源SA處理可提高滲透脅迫下小桐子幼苗甜菜堿的生物合成能力，且SA誘導(dǎo)的甜菜堿積累過程可能受到Ca2+/CaM信號的調(diào)控。

關(guān)鍵詞：水楊酸;滲透脅迫;甘氨酸甜菜堿;小桐子;Ca2+/CaM信號

中圖分類號：S718.3? ? ? 文獻標識碼：A

Ca2+/CaM Signaling Involved in Salicylic Acid-Induced Glycine Betaine Accumulation in Jatropha curcas L. under Osmotic Stress

YANG Shuanglong， YANG Ting， GONG Ming*

College of Life Sciences / Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy， Ministry of Education / Key Laboratory of Biomass Energy and Environmental Biotechnology， Yunnan Normal University， Kunming， Yunnan 650500， China

Abstract： Hydroponic experiments were carried out to study the effect of exogenous salicylic acid （SA） on the content of glycine betaine （GB）， the activity of the key enzyme betaine aldehyde dehydrogenase （BADH） of GB biosynthesis， and the expression of GB metabolism-related genes in the leaves of Jatropha curcas seedlings under PEG 6000 stress. Meanwhile， the effects of Ca2+ and calmodulin （CaM） antagonists on SA-induced GB accumulation were investigated too. SA treatment significantly enhanced the content of GB， increased the activity of BADH， and improved the expression level of JcCMO and JcBADH in the leaves of J. curcas seedlings under osmotic stress. Interestingly， compared to the seedlings exposed to PEG treatment alone， SA treatment significantly increased the activity of CaM under osmotic stress. Calcium chloride （CaCl2） treatment could promote SA-induced GB accumulation. It also induced an increase of BADH activity， and up-regulated JcBADH expression. The results indicate that exogenous SA treatment can enhance the biosynthesis of GB， and Ca2+/CaM signaling might be involved in the regulation of SA-induced GB accumulation.

Keywords： salicylic acid; osmotic stress; glycine betaine; Jatropha curcas L.; Ca2+/CaM signaling

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.05.013

小桐子（Jatropha curcas L.）又名青銅木、假花生樹等，屬大戟科麻瘋樹屬，是非常重要的多用途樹種 [1-3];小桐子耐土壤貧瘠、生長繁殖速度快、生物產(chǎn)量大，并且能綠化荒山、保水固土、增加土壤有機質(zhì)等[2， 4]。此外，小桐子種子含油量在40%～60%，油質(zhì)近似柴油，是一種具有巨大開發(fā)潛力的能源植物，因此受到廣泛的關(guān)注[4-6]。小桐子起源于熱帶，一般都認為小桐子應(yīng)具有較強的耐脫水能力[5-6]，但是近年來的研究表明，冷敏感植物小桐子對低溫和干旱誘導(dǎo)的滲透脅迫非常敏感，半干旱和干旱地區(qū)小桐子的產(chǎn)量遠遠低于降雨量較豐富的地區(qū)[5]。

干旱、低溫和高鹽等誘發(fā)的滲透脅迫是世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要自然災(zāi)害，也是影響植物生長的主要因素之一。滲透脅迫可損傷植物細胞膜、誘導(dǎo)過量的活性氧產(chǎn)生、抑制植物生長等[7-8];植物遭受滲透脅迫時會造成細胞失水，同時產(chǎn)生相應(yīng)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來抵抗脅迫環(huán)境[8]。甘氨酸甜菜堿（glycine betaine， GB）是一種季銨類化合物，也是最常見的滲透調(diào)節(jié)劑之一 [9-10]。近年來的研究顯示，甜菜堿還具有保護細胞內(nèi)代謝酶和蛋白質(zhì)，以及穩(wěn)定生物膜等作用[9]。植物體內(nèi)甜菜堿的生物合成含兩步重要的氧化反應(yīng)。首先，由膽堿單加氧酶（choline monooxygenase， CMO）將膽堿催化為甜菜堿醛，然后由甜菜堿醛脫氫酶（be taine aldehyde dehydrogenase， BADH）將甜菜堿醛轉(zhuǎn)化為甜菜堿。其中，BADH被認為是高等植物中甜菜堿生物合成的關(guān)鍵限速酶[10-11]。目前，已從擬南芥、水稻、小麥、玉米等多種草本植物中分離得到BADH基因，并廣泛應(yīng)用于植物的抗逆基因工程[9-11]。大量研究表明，植物在滲透脅迫下會積累甜菜堿，且大量積累的甜菜堿顯著提高了植物的抗逆性[10-12]。但是，滲透脅迫誘發(fā)甜菜堿積累的機制尚不完全清楚。

干旱、低溫和鹽等逆境脅迫誘發(fā)植物甜菜堿積累的過程涉及復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，研究表明：該過程受脫落酸（abscisic acid， ABA）、Ca2+、NO和水楊酸（salicylic acid， SA）等信號分子的調(diào)控[13-16]。以鈣離子（Ca2+）及其受體鈣調(diào)素（calmodulin， CaM）為核心的鈣信使系統(tǒng)在植物應(yīng)對逆境脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著中心作用[17-19]。已有少量研究證明，Ca2+/CaM信號參與了干旱和鹽脅迫下植物體內(nèi)甜菜堿的積累過程[14， 20]。然而，Ca2+/CaM信號調(diào)節(jié)植物甜菜堿代謝的機制還不清楚。SA作為一種重要的內(nèi)源信號分子，在植物抵抗低溫、干旱、鹽脅迫等逆境脅迫造成的傷害時，起著重要作用[21-23]。Farhangi-Abriz等[16]研究結(jié)果表明，鹽脅迫下，外源施加SA處理可以提高大豆植株的甜菜堿含量及耐鹽性;Aghdam等[22]報道，外源SA預(yù)處理增加了紅掌中甜菜堿的含量，并提高了紅掌植株的耐冷性;Shaki等[23]的研究表明，SA提高了NaCl脅迫下紅花體內(nèi)甜菜堿、可溶性糖及葉綠素的含量。

然而，到目前為止，滲透脅迫下SA如何調(diào)控甜菜堿代謝，其中涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制還不清楚。本研究采用外源施加SA處理滲透脅迫下的小桐子幼苗，研究了滲透脅迫下SA對小桐子幼苗甜菜堿含量、BADH活性、JcBADH和JcCMO表達量及Ca2+和CaM抑制劑對SA誘導(dǎo)甜菜堿積累的影響，試圖初步探明滲透脅迫條件下SA調(diào)控小桐子甜菜堿代謝的機制及可能涉及的部分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，為深入研究滲透脅迫誘發(fā)植物甜菜堿積累的機制提供借鑒。

1? 材料與方法

1.1? 材料

小桐子種子采購于云南省元謀縣。首先挑選籽粒大小一致的種子，清洗干凈，然后用1.5%（W/V）的硫酸銅溶液消毒30 min，蒸餾水清洗干凈，放入25 ℃的培養(yǎng)箱中浸種16 h之后，播種于鋪有6層濕濾紙的白磁盤中。種子于25 ℃下加蓋暗萌發(fā)7 d。然后，將長勢較一致的幼苗置于75%相對濕度的人工氣候箱[培養(yǎng)條件為：25 ℃/20 ℃（晝/夜）、16 h光照強度300 μmol/（m2·s）]中砂培生長21 d，期間澆灌1/2 Hoagland營養(yǎng)液。

1.2? 方法

小桐子幼苗長出第3片真葉時（培養(yǎng)28 d），取長勢一致的小桐子幼苗，分別置于濃度為（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L）SA和20% PEG 6000（模擬滲透脅迫）的1/2 Hoagland營養(yǎng)液中（對照為不同濃度SA+1/2 Hoagland營養(yǎng)液），在人工氣候箱[25 ℃/20 ℃（晝/夜）、16 h光照強度300 μmol/（m2·s）、相對濕度為75%]中進行培養(yǎng)，每個處理180株，處理4 d后，取小桐子幼苗葉片，進行相關(guān)指標的測定。SA和PEG 6000選用的處理濃度設(shè)置均基于實驗室的前期研究工作。

在上述實驗基礎(chǔ)上，取長勢一致的小桐子幼苗，以1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)的幼苗為對照，分別進行不同處理，詳見表1（各處理濃度的選擇基于實驗室的前期研究工作，CPZ和TFP分別為CaM抑制劑氯丙嗪和三氟拉嗪），所有處理均在人工氣候箱中進行[培養(yǎng)條件為：25 ℃/ 20 ℃（晝/夜）、16 h光照強度300 μmol/（m2·s）、相對濕度為75%]，每個處理有6個重復(fù)，以及3次生物學(xué)重復(fù)。材料共處理2～4 d，在處理的0、1、2、3、4 d取小桐子幼苗葉片，進行相關(guān)指標的測定。

1.3? 測定方法

1.3.1? 甜菜堿含量的測定? 取小桐子幼苗葉片0.1 g，加蒸餾水2 mL，少許石英砂充分研磨之后，在搖床上提取24 h。然后，提取液于10 000g、20 ℃下離心15 min，取上清液用鹽酸將pH調(diào)至1.0，即為樣品液。吸取500 μL樣品液，加入濃度為3%的飽和雷氏鹽溶液500 μL，放置于4 ℃下保存5 h，接著于10 000g下離心15 min，棄上清液，將所得沉淀用乙醚沖洗3次。最后，用2 mL 70%的丙酮充分溶解沉淀，并于525 nm波長下測定吸光度值，依據(jù)標準曲線計算樣品甜菜堿的含量。

1.3.2? CaM和BADH活性的測定? CaM活性的測定按照Yang等[18]描述的方法進行，以pH 7.5、30 ℃和0.01 mmol/L Ca2+存在條件下，激活0.01個單位磷酸二酯酶（PDE）到50%最大活性所需的CaM量為一個活性單位（U）;參照Yang等[2]的方法測定BADH酶的活性，按每分鐘NADH的生成量計算酶活性。

1.3.3? RNA提取和qRT-PCR? 采用TaKaRa公司的RNAiso? for Polysaccharide-rich Plant Tissue試劑盒提取RNA;采用ABI 7500 Fast Real-Time PCR實時熒光定量PCR儀對甜菜堿代謝關(guān)鍵酶基因JcBADH和JcCMO的表達進行檢測，內(nèi)參基因選用小桐子18s rRNA基因，引物序列詳見表2。

按照One Step SYBR? PrimeScript? RT-PCR Kit II（TaKaRa）試劑盒說明書的操作步驟進行qRT-PCR反應(yīng)。目標基因相對定量差異表達分析采用2–ΔΔCT法進行計算[24]。

1.4? 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19. 0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析（實驗數(shù)據(jù)多重比較采用Duncan法）;采用Sigmaplot 13.0作圖軟件，圖中的數(shù)據(jù)均為平均值±標準誤。以不同的小寫字母來表示不同處理間差異達到顯著水平（P<0.05）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 外源SA處理對滲透脅迫下小桐子幼苗葉片甜菜堿含量的影響

為了確定SA的適宜處理濃度，分別用0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L SA溶液處理正常生長和20% PEG 6000脅迫下的小桐子幼苗，處理4 d后，取小桐子幼苗葉片測定其甜菜堿含量。從圖1可以看出，隨著SA處理濃度的升高，20% PEG 6000脅迫下小桐子幼苗葉片的甜菜堿含量逐漸升高，在SA濃度為1.5 mmol/L時，甜菜堿含量最高，與單獨用PEG 6000處理的小桐子幼苗相比，甜菜堿含量提高達33.1%。此后，隨著SA處理濃度的增加，幼苗甜菜堿含量呈逐漸降低的趨勢，但依然顯著高于僅用PEG 6000處理的小桐子幼苗。然而，不同濃度的外源SA對正常生長條件下的小桐子幼苗甜菜堿含量均無顯著影響（圖1對照）?；谝陨辖Y(jié)果，本研究最終選用1.5 mmol/L的SA溶液來處理滲透脅迫下的小桐子幼苗，因為該濃度誘導(dǎo)甜菜堿積累的效果最顯著。

圖2的結(jié)果顯示，對照組小桐子幼苗葉片甜菜堿的含量比較穩(wěn)定，在0～4 d中變化不大（CK）。然而，PEG處理1～4 d則顯著提高了小桐子幼苗葉片甜菜堿的含量。與對照（CK）相比，PEG處理4 d時小桐子幼苗葉片的甜菜堿含量上升了2.57倍;而SA1處理可進一步促進滲透脅迫下小桐子幼苗葉片甜菜堿的積累。說明SA1處理可顯著提高滲透脅迫下小桐子幼苗甜菜堿的積累。

2.2? SA處理對滲透脅迫下小桐子幼苗葉片甜菜堿代謝關(guān)鍵酶活性及其基因表達的影響

圖3為1.5 mmol/L SA對滲透脅迫下小桐子幼苗葉片BADH活性的影響。由圖3可知，PEG處理可大幅上調(diào)小桐子幼苗葉片的BADH活性，其中0～2 d上升速度較快，2 d后上升幅度減緩，4 d內(nèi)幼苗的BADH活性上升了1.40倍。SA1處理可進一步上調(diào)滲透脅迫下BADH的活性。

為了深入研究SA對滲透脅迫下小桐子幼苗甜菜堿生物合成的影響，實驗中用qRT-PCR法檢測了甜菜堿合成關(guān)鍵酶基因JcBADH和JcCMO的表達變化。檢測結(jié)果如圖4所示，PEG處理可大幅上調(diào)JcBADH（圖4A）和JcCMO（圖4B）的表達水平，在PEG 6000脅迫4 d時，小桐子幼苗JcBADH和JcCMO的表達水平與正常培養(yǎng)的幼苗（CK）相比分別上調(diào)了6.84倍和3.62倍。SA1處理則進一步上調(diào)了20% PEG 6000脅迫下JcBADH和JcCMO的表達水平，結(jié)果說明滲透脅迫下小桐子幼苗JcBADH和JcCMO的表達水平受到SA的調(diào)控。

2.3? Ca2+和CaM抑制劑對滲透脅迫下SA誘發(fā)小桐子幼苗甜菜堿積累的影響

CaM是Ca2+的受體，也是鈣信使系統(tǒng)的重要組成成分[17-18]。圖5為SA對20% PEG 6000脅迫下小桐子幼苗葉片CaM活性的影響。由圖5可知，隨著處理時間的延長，PEG 6000處理（PEG）對小桐子幼苗CaM活性的影響呈先升高后逐漸降低的趨勢。當PEG 6000脅迫2 d時，小桐子幼苗的CaM活性達到峰值，與對照的幼苗相比（CK），上調(diào)了35.8%，之后逐漸下降，但依然顯著高于對照。與單獨用PEG處理的幼苗相比，SA1處理可進一步提高小桐子幼苗的CaM活性，這表明滲透脅迫下SA處理可提高小桐子幼苗的CaM活性。

為了弄清Ca2+/CaM信號在SA誘發(fā)甜菜堿代謝中的作用，實驗中以不同的方式處理（PEG、SA1、SA2、SA3、SA4和SA5，表1）PEG 6000脅迫下的小桐子幼苗，研究了滲透脅迫下Ca2+和CaM抑制劑對SA誘發(fā)甜菜堿積累的影響。結(jié)果如圖6A所示，20% PEG 6000脅迫下，SA1處理2 d顯著提高了小桐子幼苗葉片的甜菜堿含量。外源CaCl2處理（SA2）則可進一步促進SA誘發(fā)的甜菜堿積累。然而，與單獨用SA處理（SA1）的幼苗相比，Ca2+通道阻斷劑 LaCl3（SA3）、鈣調(diào)素抑制劑CPZ（SA4）和TFP（SA5）處理則顯著降低了小桐子幼苗甜菜堿的含量。此外，與SA1處理的幼苗相比，CaCl2處理（SA2）2 d也大幅提高了滲透脅迫下小桐子幼苗的BADH活性，而Ca2+通道阻斷劑 LaCl3（SA3）、鈣調(diào)素抑制劑CPZ（SA4）和TFP（SA5）處理得到相反的結(jié)果（圖6B）。這些結(jié)果表明滲透脅迫下SA誘發(fā)的甜菜堿積累可能涉及Ca2+/CaM信號調(diào)控。

對不同處理條件下小桐子幼苗葉片甜菜堿代謝關(guān)鍵酶基因JcBADH和JcCMO表達水平的檢測結(jié)果顯示，與單獨用20% PEG 6000處理的幼苗相比，SA1處理2 d后JcBADH表達水平上調(diào)了61.3%，而CaCl2處理（SA2）下JcBADH表達水平上調(diào)達115.0%（圖7A）;與之相反，LaCl3（SA3）、CPZ（SA4）和TFP（SA5）處理顯著抑制了滲透脅迫下小桐子幼苗JcBADH基因的表達（圖7A）。然而，與單獨用SA處理（SA1）的幼苗相比，不論是CaCl2（SA2），還是LaCl3（SA3）、CPZ（SA4）和TFP（SA5）處理，均對滲透脅迫下小桐子幼苗JcCMO表達無顯著影響（圖7B）。上述結(jié)果表明，滲透脅迫下SA活化的JcBADH表達受到Ca2+/ CaM信號調(diào)控。

3? 討論

在鹽堿、干旱和低溫脅迫下，植物細胞會失水，從而造成滲透脅迫;為了應(yīng)對滲透脅迫傷害，植物體內(nèi)會積累大量的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿等[7，25]。在眾多滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)中，甜菜堿是研究最為廣泛的滲透調(diào)節(jié)劑之一[9-10]。近年來的研究顯示，在逆境脅迫下，甜菜

堿具有維持生物膜的穩(wěn)定性、保護大分子蛋白質(zhì)和一些酶類不被降解以及清除活性氧等作用[10-11]。目前，已有許多研究證實植物遭受滲透脅迫時會大量積累甜菜堿，然而滲透脅迫誘發(fā)甜菜堿積累的機制還不完全清楚。本研究結(jié)果顯示，滲透脅迫（20% PEG 6000處理）可誘導(dǎo)小桐子幼苗葉片積累大量的甜菜堿（圖2）。滲透脅迫也提高了甜菜堿合成關(guān)鍵酶BADH的活性，以及上調(diào)JcBADH和JcCMO的表達水平（圖3和圖4），表明滲透脅迫能激活小桐子甜菜堿的生物合成過程。

甜菜堿的積累涉及復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，受到許多因素調(diào)控，已有研究報道：ABA、Ca2+、NO、茉莉酸、SA等信號分子會誘發(fā)植物體內(nèi)甜菜堿的積累[13-16]。SA是植物重要的內(nèi)源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，它在植物響應(yīng)非生物和生物脅迫中發(fā)揮著非常重要的作用[21-23]。近年來的研究表明，外源SA處理可顯著提高鹽和低溫脅迫下植物體內(nèi)甜菜堿的積累，增強植物的抗逆性[16， 22]。Farooq等[26]研究發(fā)現(xiàn)，外源SA處理提高了干旱脅迫下水稻中有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)甜菜堿和脯氨酸的水平，從而增強了植株的耐旱性;Li[27]曾報道，高溫脅迫下，SA可提高玉米幼苗甜菜堿、脯氨酸和海藻糖的含量，以及SOD、CAT和GR等抗氧化酶的活性。然而，迄今為止，SA如何調(diào)控滲透脅迫下植物甜菜堿代謝的具體機制還不清楚。本研究結(jié)果顯示，滲透脅迫下外源施加1.5 mmol/L SA處理可顯著提高小桐子幼苗的甜菜堿含量（圖2），上調(diào)甜菜堿合成關(guān)鍵酶BADH的活性（圖3），以及上調(diào)JcBADH和JcCMO的表達水平（圖4）。上述結(jié)果表明，SA參與了滲透脅迫下小桐子幼苗甜菜堿積累的調(diào)控過程，且SA對甜菜堿合成的兩步重要氧化反應(yīng)均有促進作用。其中，SA對甜菜堿合成的第二步反應(yīng)的促進作用尤為顯著。

Ca2+是非常重要的第二信使，CaM是植物中最主要的鈣結(jié)合蛋白[17， 19];Ca2+/CaM信號普遍參與了植物對高溫、低溫、干旱、重金屬和鹽堿等逆境脅迫響應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[17， 28]。許多研究證實，逆境脅迫下Ca2+能和其他信號分子，如H2O2、NO、ABA和SA等信號分子相互作用，相互協(xié)調(diào)（信號交談），從而使植物體對各種脅迫刺激做出完整、迅速而準確的反應(yīng)[28-31]。本研究結(jié)果顯示，與單獨用PEG 6000處理的幼苗相比，1.5 mmol/L SA處理顯著提高了滲透脅迫下小桐子幼苗的CaM活性（圖5），表明滲透脅迫下SA信號和Ca2+/CaM信號之間可能有“信號交談”。進一步的實驗結(jié)果證實，CaCl2處理顯著提高了滲透脅迫下SA誘導(dǎo)的甜菜堿積累水平（圖6A）。CaCl2處理也提高了甜菜堿合成關(guān)鍵酶BADH的活性（圖6B），以及上調(diào)了JcBADH的表達水平（圖7A）。然而，Ca2+通道阻斷劑LaCl3，CaM抑制劑CPZ和TFP處理顯著抑制了SA誘導(dǎo)的甜菜堿積累效應(yīng)（圖6和圖7）。這些結(jié)果表明，滲透脅迫下SA誘導(dǎo)的小桐子甜菜堿積累過程涉及Ca2+/CaM信號調(diào)控，且Ca2+/CaM信號可能主要通過活化JcBADH表達促進甜菜堿的生物合成。

綜上所述，外源施加1.5 mmol/L SA處理可顯著提高滲透脅迫下小桐子幼苗的甜菜堿含量和BADH活性，上調(diào)甜菜堿合成關(guān)鍵酶基因JcBADH和JcCMO的表達水平，表明SA誘導(dǎo)的甜菜堿積累是其持續(xù)活化甜菜堿兩步重要合成反應(yīng)的結(jié)果。此外，CaCl2處理能提高SA誘導(dǎo)的甜菜堿積累水平，而LaCl3、CPZ和TFP處理得到相反的結(jié)果，顯示滲透脅迫下Ca2+/CaM信號可能對SA誘導(dǎo)的小桐子甜菜堿積累具有重要調(diào)控作用。

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