miR-155調(diào)控線粒體自噬對足細(xì)胞損傷的機(jī)制研究

古賢君　林栩　凌霄雁　鄭心彤　黃海庭　梁釗　覃卿　杜秀日

【摘要】 目的 探討miR-155對足細(xì)胞凋亡的影響，并深入研究其機(jī)制。

方法 MPC5細(xì)胞（經(jīng)H2O2預(yù)處理）分為miR-155抑表達(dá)組、miR-155過表達(dá)組、對照（空質(zhì)粒）組、空白組。分別采用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western?blot法檢測線粒體自噬通路相關(guān)因子FOXO1、PINK1、Parkin、LC3?Ⅱ、Beclin1、p62及凋亡相關(guān)因子Caspase-3、Bax、Bcl-2?mRNA或蛋白表達(dá);JC-1探針檢測線粒體膜電位;ELISA檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量;CCK8、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞活性及凋亡。

結(jié)果 相較于對照組，miR-155抑表達(dá)組的FOXO1、PINK1、Parkin、LC3?Ⅱ、Beclin1和Bcl-2表達(dá)明顯升高，細(xì)胞活性和線粒體膜電位明顯增加（P<0.05），p62、Caspase-3和Bax的表達(dá)明顯降低，ROS含量和細(xì)胞凋亡率顯著下降（P<0.05）;miR-155過表達(dá)組的FOXO1、PINK1、Parkin、LC3?Ⅱ、Beclin1、Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)，細(xì)胞活性和線粒體膜電位明顯降低（P<0.05），p62、Caspase-3和Bax表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)ROS含量和細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05）。對照組與空白組的結(jié)果比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

結(jié)論 上調(diào)miR-155表達(dá)，可促進(jìn)足細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與miR-155靶向FOXO1，抑制線粒體自噬，促進(jìn)足細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 足細(xì)胞;miR-155;線粒體自噬;凋亡

中圖分類號：R692.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.05.002

Study?on?the?mechanism?of?miR-155?regulating?mitophagy?on?podocyte?injury

GU?Xianjun1，2，LIN?Xu1，LING?Xiaoyan1，ZHENG?Xintong1，HUANG?Haiting1，2，LIANG?Zhao2，QIN?Qing2，DU?Xiuri2

（1.Nephrology?Department?of?Affiliated?Hospital，2.Graduate?School，Youjiang?Medical?University?for?Nationalities，Baise?533000，Guangxi，China）

【Abstract】 Objective To?investigate?the?effect?of?miR-155?on?podocyte?apoptosis?and?further?study?its?mechanism.

Methods MPC5?cells（pretreated?with?H2O2）?were?divided?into?miR-155?inhibition?group，miR-155?overexpression?group，control（empty?plasmid）?group?and?blank?group.Real-time?quantitative?RT-PCR?and?Western?blot?were?used?to?detect?mRNA?or?protein?expressions?of?mitophagy?pathway-related?factors（FOXO1，PINK1，Parkin，LC3?Ⅱ，Beclin1，p62），apoptosis-related?factors（Caspase-3，Bax，Bcl-2mRNA.）?or?protein?expression.JC-1?probe?was?used?to?detect?mitochondrial?membrane?potential.ELISA?was?used?to?detect?intracellular?ROS?content.CCK8?and?flow?cytometry?were?used?to?detect?cell?viability?and?apoptosis.

Results Compared?with?the?control?group，the?expression?of?FOXO1，PINK1，Parkin，LC3Ⅱ，Beclin1，and?Bcl-2?in?the?miR-155?inhibition?group?increased?significantly，while?cell?activity?and?mitochondrial?membrane?potential?increased?significantly（P<0.05）.The?expression?of?p62，Caspase-3?and?Bax?decreased?significantly，and?the?content?of?ROS?and?apoptotic?rate?decreased?significantly（P<0.05）.In?addition，the?expression?of?FOXO1，PINK1，Parkin，LC3，Beclin1，and?Bcl-2?in?the?miR-155?overexpression?group?decreased?significantly，cell?activity?and?mitochondrial?membrane?potential?decreased?significantly（P<0.05），and?the?expression?of?p62，Caspase-3?and?Bax?increased?significantly，the?content?of?ROS?and?apoptotic?rate?increased?significantly（P<0.05）.There?was?no?significant?difference?in?the?above-mentioned?results?between?the?control?group?and?the?blank?group（P>0.05）.

Conclusion Up-regulating?miR-155?expression?can?promote?podocyte?apoptosis，and?the?mechanism?may?be?related?to?mir-155?targeting?FOXO1，inhibiting?mitochondrial?autophagy?and?promoting?oxidative?stress?injury?of?podocytes.

【Key?words】 podocytes，miR-155，mitophagy，apoptosis

足細(xì)胞損傷是狼瘡性腎炎（LN）患者腎功能障礙的重要機(jī)制。過量的氧自由基（ROS）可致足細(xì)胞凋亡[1]。線粒體是ROS產(chǎn)生的“能量工廠”，線粒體自噬可提高線粒體質(zhì)量控制，是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的主要機(jī)制之一，亦是抗細(xì)胞凋亡的重要途徑。既往研究表明，miR-155在LN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其可直接靶向降解FOXO1?mRNA[2]，抑制FOXO1表達(dá);而FOXO1可與PINK1啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，激活PINK1/Parkin通路，誘導(dǎo)線粒體自噬。本研究擬探究miR-155對足細(xì)胞凋亡的影響，并從線粒體自噬角度深入探討其機(jī)制，旨在從全新的角度闡明LN的發(fā)病機(jī)制，為LN的臨床診治提供新的思路及靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

H2O2（Sigma，323381）;TRIzol?Reagent（Invitrogen，15596026）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，RR047a）;SYBR?Green?qPCRMix（Monad，MQ10301）;BCA蛋白定量試劑盒（Solarbio，PC0020）;ECL化學(xué)發(fā)光底物（超敏）（Biosharp，BL523A）;Annexin?V-FITC/PI試劑盒（Solarbio?CA1020-50T）;ROS檢測試劑盒（mlbio，ml009876-1）;E.Z.N.A.@miRNA?Kit（Omega）;CCK8試劑盒（Solarbio，CA1210）;JC-1探針（Invitrogen，T3168）;RPMI-1640培養(yǎng)基（Solarbio，31800）;Opti-MEM?I（上海吉瑪生物）。miR-155過/抑表達(dá)重組質(zhì)粒（上海吉瑪生物）。抗體：Anti-FOXO1?antibody（ab70382），Anti-PINK1?antibody（ab216144），Anti-Parkin?antibody（ab77924），Anti-p62?antibody（ab109012），Anti-Beclin1?antibody（ab210498），Anti-Bax?antibody（ab182733），Anti-Caspase-3?antibody（ab197202），Anti-Bcl-2?antibody（ab182858），Anti-LC3?Ⅱ?antibody（CST?12741），Anit-β-actin?antibody（ab8227），山羊抗鼠二抗（Sigma，A9309）、山羊抗兔二抗（Sigma，A9169）。實(shí)時(shí)定量PCR（Agilent?Technologies，G8830-64001）;多功能酶標(biāo)儀（美國MD，F(xiàn)ilterMax?F3）;電泳儀（Bio-Rad，PowerPac?Basic）;凝膠成像系統(tǒng)（上海天能，Tanon?5200）;流式細(xì)胞儀（BD?FACSMelody）。

1.2 細(xì)胞株及分組

小鼠腎小球足細(xì)胞MPC5（購自上海復(fù)旦大學(xué)細(xì)胞中心），分為miR-155抑表達(dá)組、miR-155過表達(dá)組、對照（空質(zhì)粒）組和空白組。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

MPC5細(xì)胞用含10%BSA及1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞融合至80%進(jìn)行傳代。將MPC5接種到6孔板中，無血清培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%。在50?μL無血清培養(yǎng)液中加入0.8?μg?DNA混勻，使用前輕輕混勻RNAi-Mate試劑。用30?μL?Opti-MEM?I稀釋4?μg?RNAi-Mate試劑輕輕混勻，室溫放置5?min。將稀釋好的DNA和RNAi-Mate試劑混合，定容到100?μL;輕柔混勻，室溫放置30?min，將100?μL?DNA/RNAi-Mate復(fù)合物加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，來回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板，使DNA/RNAi-Mate混合物均勻覆蓋細(xì)胞。轉(zhuǎn)染4～6?h后將培養(yǎng)基更換為含10%BSA的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24?h。并使用H2O2（10?μmol/L）進(jìn)行預(yù)處理24?h后，收集miR-155抑表達(dá)組、miR-155過表達(dá)組、對照（空質(zhì)粒）組和空白組的細(xì)胞樣品進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.3.2 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR

從GenBank獲得相應(yīng)mRNA序列，采用Primer?5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，引物序列見表1。應(yīng)用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;然后按照說明書，采用SYBR?Green?Ⅰ染料法進(jìn)行定量PCR，PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30?s;94℃?5?s，60℃退火30?s，72℃?30?s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán);72℃延伸10?min。采用2-△△Ct法來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.3 Western?blot

細(xì)胞裂解后提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度后配平，5×Loading?buffer混勻，沸水浴5?min;每條泳道上樣50?μg蛋白，SDS-PAGE電泳，切膠，濕法轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉浸泡，室溫放置約1?h。加入1∶3000稀釋后的一抗于4℃孵育過夜，1×TBST清洗3次，每次10?min;然后用1∶3000稀釋的二抗于37℃孵育1?h，1×TBST清洗3次，每次15?min;顯色曝光后進(jìn)行底片掃描，統(tǒng)計(jì)分析蛋白灰度值。

1.3.4 CCK8檢測細(xì)胞活性

以2×103/孔的濃度將細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)置5個(gè)副孔。按照EnoGeneCellTM?Counting?Kit-8（CCK-8）細(xì)胞活力檢測試劑盒說明書操作，每孔加入100?μL?CCK8與DMEM-F12以1∶10配制的工作液，96孔板在培養(yǎng)箱中避光孵育4?h后，酶標(biāo)儀測定450?nm處吸光度。根據(jù)吸光度評價(jià)細(xì)胞活性。

1.3.5 Annexin?Ⅴ/PI試劑盒檢測細(xì)胞凋亡

收集細(xì)胞，1500?g離心10?min，棄去上清。PBS清洗兩次，重懸于0.5?mL?binding?buffer。加入Annexin?Ⅴ-FITC至終濃度為1?μg/mL，37℃避光孵育30?min。1000?g低溫離心5?min，棄去染液。加入PI至終濃度為5?μg/mL，4℃避光孵育30?min，使用流式細(xì)胞儀激發(fā)波長488?nm，發(fā)射波長515?nm檢測FITC熒光，激發(fā)波長488?nm，發(fā)射波長560?nm檢測PI熒光。

1.3.6 ELISA試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量

離心收集細(xì)胞放入-20℃冰箱冰凍后取出，室溫溶解后重復(fù)冰凍。反復(fù)凍融三次，1000?g離心10?min，收集上清液。ROS試劑盒放置室溫下復(fù)溫，按照說明書要求稀釋洗滌液，標(biāo)準(zhǔn)品現(xiàn)用現(xiàn)配。根據(jù)待測樣本數(shù)量及標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量安裝板條數(shù)，每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均做復(fù)孔設(shè)置。按照濃度范圍稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，每孔加入50?μL，每個(gè)樣品孔分別加入50?μL待測樣本。立即加入50?μL生物素標(biāo)記的抗體，蓋上膜板，輕輕振蕩搖晃混勻，37℃恒溫孵育1?h。棄液，每孔加滿洗滌液振蕩洗滌30?s，重復(fù)洗滌3次，甩干洗滌液。每孔加入80?μL的親和鏈霉素-HRP，振蕩混勻，37℃恒溫孵育30?min。甩干孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌3次。每孔加入底物A和底物B各50?μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光溫育10?min。取出酶標(biāo)板，迅速加入50?μL終止液，5?min內(nèi)酶標(biāo)儀讀取450?nm波長處OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋倍數(shù)計(jì)算每個(gè)樣品中ROS的含量。

1.3.7 JC-1探針檢測線粒體膜電位

將MPC5細(xì)胞種于60?mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，融合達(dá)到60%～70%后按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理。JC-1（200×）預(yù)先用超純水按照1∶160的體積比進(jìn)行稀釋混勻。將混合液與JC-1（5×）緩沖液按照4∶1進(jìn)行混合，為JC-1工作液。JC-1（5×）緩沖液稀釋成1×JC-1緩沖液待用。細(xì)胞處理完畢后用PBS緩沖液沖洗2次，加入1?mL胰蛋白酶消化2?min，同等體積培養(yǎng)基終止消化，1000?r/min離心5?min，PBS沖洗，1000?r/min離心5?min。細(xì)胞重懸于0.5?mL?DMEM，加入0.5?mL?JC-1工作液，充分吹打混勻后置于培養(yǎng)箱中染色20?min。取出培養(yǎng)皿，1000?r/min離心5?min，去除上清。JC-1緩沖液充分洗滌MPC5細(xì)胞后，取0.5?mL?JC-1緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析足細(xì)胞線粒體膜電位變化。線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1熒光探針為單體，呈綠色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad?Prism?5和SPSS?22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以（±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 miR-155對足細(xì)胞活力及凋亡的影響

分別采用CCK8法、流式細(xì)胞術(shù)、熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western?blot檢測足細(xì)胞活力、凋亡率、miR-155表達(dá)及凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相對于對照組，過表達(dá)miR-155組的miR-155表達(dá)顯著升高，細(xì)胞活力顯著下降，凋亡率、Bax、caspase-3表達(dá)顯著升高（P<0.05），Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05）;抑表達(dá)miR-155組的miR-155表達(dá)顯著降低，細(xì)胞活力顯著上調(diào)，凋亡率、Bax、caspase-3表達(dá)顯著降低（P<0.05），Bcl-2表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）;對照組與空白組結(jié)果比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖1，表2。

2.2 miR-155對足細(xì)胞線粒體膜電位及ROS生成的影響

采用ELISA法檢測足細(xì)胞內(nèi)ROS水平，JC-1探針檢測線粒體膜電位，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對于對照組，過表達(dá)miR-155組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，線粒體膜電位顯著降低（P<0.05）;抑表達(dá)miR-155組的細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低，線粒體膜電位顯著升高（P<0.05）;對照組與空白組結(jié)果比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖2，表3。

2.3 miR-155對足細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ、Beclin1、p62表達(dá)的影響

采用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR、Western?blot檢測足細(xì)胞中自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ、Beclin1、p62?mRNA及蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對于對照組，過表達(dá)miR-155組的LC3Ⅱ、Beclin1?mRNA及蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），p62?mRNA及蛋白表達(dá)顯著上升（P<0.05）;抑表達(dá)miR-155組的細(xì)胞LC3Ⅱ、Beclin1?mRNA及蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），p62?mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）;對照組與空白組結(jié)果比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖3，表4。

2.4 miR-155對足細(xì)胞線粒體自噬通路的影響

采用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR、Western?blot檢測線粒體自噬信號通路FOXO1、PINK1、Parkin?mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組比較，過表達(dá)miR-155組FOXO1、PINK1、Parkin?mRNA及蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05）;抑表達(dá)miR-155組FOXO1、PINK1、Parkin?mRNA及蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）;對照組與空白組結(jié)果比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖4，表5。

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種危害多器官的慢性、炎癥性的自身免疫性疾病[3]。LN是SLE的臨床常見并發(fā)癥，其特征是廣泛的腎臟病變，與SLE的預(yù)后密切相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，30%～70%的SLE患者會(huì)產(chǎn)生腎臟損傷[4]。足細(xì)胞損傷是LN患者腎功能障礙的重要機(jī)制，而氧化應(yīng)激是促進(jìn)足細(xì)胞損傷的重要因素。大量文獻(xiàn)指出，慢性損傷刺激、炎癥和免疫性反應(yīng)等均可引起足細(xì)胞氧化應(yīng)激，產(chǎn)生過量的ROS，導(dǎo)致足細(xì)胞足突消失，最終致足細(xì)胞損傷、凋亡，而足細(xì)胞作為腎小球?yàn)V過屏障的重要細(xì)胞成分，長時(shí)間的足細(xì)胞損傷會(huì)影響腎小球選擇性濾過作用，進(jìn)一步加重腎小球硬化、蛋白尿和腎功能衰竭等疾病的進(jìn)展[5]。因此，深入研究氧化應(yīng)激致足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制有利于進(jìn)一步闡明LN的發(fā)病機(jī)制。

microRNAs是一類小的非編碼RNA，在人類細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)，其通過結(jié)合靶mRNAs的3UTR的特異性互補(bǔ)序列來調(diào)控蛋白合成，從而維持細(xì)胞分化、增殖、凋亡、自噬和氧化應(yīng)激等多種過程的動(dòng)態(tài)平衡[6]。大量研究證實(shí)，多種microRNAs參與了LN的發(fā)病機(jī)制;microRNAs在LN外周血循環(huán)中的異常表達(dá)，可作為自身免疫性疾病的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[7]。其中，miR-155與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和免疫調(diào)控關(guān)系十分密切，且與多種腎臟疾病發(fā)病機(jī)制相關(guān)，包括SLE和LN。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在LN患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高[8]，表明miR-155參與了LN的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）可促進(jìn)腎小球硬化，而研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-155在足細(xì)胞中的表達(dá)，可減輕TGF-β1誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，降低足細(xì)胞凋亡率，表明miR-155與足細(xì)胞損傷、凋亡的分子機(jī)制密切相關(guān)[9]。在細(xì)胞凋亡機(jī)制中，Bcl-2和Bax是其中最有代表性的抑凋亡和促凋亡基因;Caspase家族是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，激活Caspase-3表達(dá)，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，在H2O2誘導(dǎo)的足細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中，上調(diào)miR-155的表達(dá)，可顯著降低足細(xì)胞活力，升高Bax、caspase-3的表達(dá)，降低Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)足細(xì)胞凋亡，而下調(diào)miR-155表達(dá)的結(jié)果則相反，與既往研究結(jié)果一致[9]，表明miR-155通過介導(dǎo)足細(xì)胞損傷進(jìn)而參與了LN的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生、先天免疫和細(xì)胞凋亡等關(guān)鍵功能的中心;若線粒體質(zhì)量異常則會(huì)導(dǎo)致代謝綜合征、神經(jīng)退行性和自身免疫性等多種疾病[10]。線粒體自噬即細(xì)胞為維持線粒體穩(wěn)態(tài)和自身功能而特異性清除自身異常線粒體的一種免疫防御反應(yīng)，也是保障細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的重要途徑。研究表明，足細(xì)胞自噬活性降低是腎損傷的關(guān)鍵因素之一，其自噬相關(guān)標(biāo)志物（Beclin-1、LC3Ⅱ、p62等）與LN病理類型具有顯著相關(guān)性[11]，促進(jìn)細(xì)胞線粒體自噬可減少足細(xì)胞損傷[12]。而抑制人腎上皮細(xì)胞線粒體自噬，可破壞線粒體完整性并降低細(xì)胞活力，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-155可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS生成，并降低線粒體膜電位和LC3Ⅱ、Beclin1的表達(dá)，促進(jìn)p62的表達(dá)，抑制線粒體自噬，表明miR-155參與氧化應(yīng)激致足細(xì)胞凋亡的機(jī)制與其對線粒體自噬的調(diào)控有關(guān)。

線粒體自噬涉及多種途徑，其中PINK1/Parkin信號通路在線粒體自噬過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究指出，PINK1/Parkin通過誘導(dǎo)線粒體自噬，可進(jìn)一步清除受損線粒體并改善線粒體動(dòng)力學(xué)和功能，減少ROS的過量蓄積，保護(hù)細(xì)胞免于更嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷[14]。FOXO1（Forkhead?box?O1）是叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子超家族的成員，可調(diào)控細(xì)胞的增殖與分化、自噬、氧化應(yīng)激和線粒體功能等，為多種細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵介質(zhì)。FOXO1蛋白可直接與PINK1的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄;過表達(dá)FOXO1可激活PINK1/Parkin通路誘導(dǎo)線粒體自噬，進(jìn)而降低ROS水平，減輕線粒體結(jié)構(gòu)損傷并改善細(xì)胞功能[15]。并且，F(xiàn)OXO1是SLE相關(guān)腎損傷疾病的保護(hù)因子，其表達(dá)與狼瘡性疾病活動(dòng)呈負(fù)相關(guān);增加FOXO1的表達(dá)，可改善LN引起腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷[16]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可通過結(jié)合FOXO1?3UTR的特異性互補(bǔ)序列來調(diào)控其蛋白合成，提示miR-155可能通過調(diào)控FOXO1的表達(dá)，進(jìn)而參與線粒體自噬的機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)足細(xì)胞中miR-155的表達(dá)，可抑制FOXO1、PINK1和Parkin的表達(dá)，抑制線粒體自噬，而下調(diào)miR-155的結(jié)果則與之相反，表明miR-155通過靶向FOXO1，調(diào)控PINK1/Parkin誘導(dǎo)的線粒體自噬，進(jìn)而參與了氧化應(yīng)激致足細(xì)胞凋亡過程。

由此推測，LN發(fā)生后，可上調(diào)患者體內(nèi)miR-155的表達(dá)，而miR-155可通過靶向FOXO1，抑制PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，降低線粒體膜電位和細(xì)胞活性，增加ROS生成并促進(jìn)促凋亡因子的表達(dá)，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷和凋亡，進(jìn)一步加重LN患者腎臟損傷及功能障礙。

綜上所述，上調(diào)miR-155表達(dá)，可促進(jìn)足細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與miR-155靶向FOXO1，抑制線粒體自噬，促進(jìn)足細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，表明miR-155調(diào)控線粒體自噬致足細(xì)胞凋亡是LN發(fā)生發(fā)展過程中的重要機(jī)制，提示miR-155可能是LN診斷及治療的潛在靶標(biāo)，對LN的防治具有重要的意義。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-03-24 修回日期：2020-04-14）

（編輯：潘明志）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81860131）;廣西自然科學(xué)基金（2017GXNSFAA198288）;百色市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（百科20160608）

作者簡介：古賢君，女，在讀碩士研究生，研究方向：足細(xì)胞損傷機(jī)制研究。E-mail：50317917@qq.com

通信作者：林栩。E-mail：linyyfyy@163.com

[本文引用格式]古賢君，林栩，凌霄雁，等.miR-155調(diào)控線粒體自噬對足細(xì)胞損傷的機(jī)制研究[J].右江醫(yī)學(xué)，2020，48（5）：326-333.