超聲波提取川貝母黃酮類物質(zhì)的工藝優(yōu)化

鄧 祥，黃小梅

(四川文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，四川 達(dá)州 635000)

貝母(Fritillaria)為百合科貝母屬多年生草本植物，以鱗莖入藥[1].貝母因其形狀而得名，形似聚貝子，故稱其為貝母[2].貝母主要產(chǎn)于四川、浙江、陜西秦巴山區(qū)、新疆等地，分別稱之為川貝母、浙貝母、土貝母、伊貝母[3].川貝母(Bulbus Fritillariae Cirrhosae)作為一種名貴的中藥材，具有悠久的使用歷史，早在漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，是貝母中的珍品，為代表性川產(chǎn)道地中藥材之一[4-6].川貝母中藥材具有清熱潤肺、開郁散結(jié)、解毒消癰、化痰止咳之功效，主要用于治療肺熱燥咳、干咳少痰、痰多胸悶、陰虛勞嗽、咯痰帶血等癥狀[7-8].川貝母含有黃酮類、多酚類、多糖類、生物堿類以及皂苷類等有效成分[9-10].大量研究表明：川貝母提取物藥效成分除與生物堿類和皂苷類化合物有關(guān)外，還與其黃酮類化合物有關(guān)[11-12].因此，研究川貝母中藥材中黃酮類物質(zhì)的有效含量，有利于判明川貝母潛在的藥用價(jià)值和開發(fā)利用前景.

目前，黃酮類物質(zhì)的提取方法主要有溶劑浸提法、超聲波輔助提取法、樹脂吸附分離法、復(fù)合酶提取法、微波輔助提取法、超臨界CO2萃取法等[13].其中超聲波輔助提取法是近年來發(fā)展起來的一種中藥材提取技術(shù)，是利用超聲波強(qiáng)烈的機(jī)械振動(dòng)效應(yīng)、擾動(dòng)效應(yīng)和空化效應(yīng)等作用，增加溶劑的穿透力以及分子運(yùn)動(dòng)的速度和頻率，從而加速目標(biāo)物溶解，達(dá)到高效提取的目的[14-15].本實(shí)驗(yàn)采用超聲波提取技術(shù)，旨在對四川達(dá)州萬源產(chǎn)貝母中黃酮類物質(zhì)進(jìn)行含量檢測和提取工藝優(yōu)化研究，為川貝母的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

川貝母(四川達(dá)州萬源產(chǎn))，40 ℃恒溫干燥后，粉碎過40目的篩子得川貝母粉末備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照品(阿拉丁試劑)；無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉等(上海試劑二廠)，其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水.

1.2 主要儀器設(shè)備

VOSHIN-1500C型低溫超聲波萃取儀(無錫 沃信)；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)(日本 島津)；ESJ200-4A型全自動(dòng)電子分析天平(沈陽 龍騰)；JIDI-20D臺(tái)式多用途高速離心機(jī)(廣州 吉迪)；101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津 泰斯特)；WK-400B型高速中藥粉碎機(jī)(青州 邁德森)；40目不銹鋼篩子.

2 方法與實(shí)驗(yàn)

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)試劑，5% NaNO2、10% Al(NO3)3、1 mol/L NaOH為顯色劑，采用Al(NO3)3- NaNO2比色法測定黃酮含量[16].首先準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照品20.0 mg，再用50%乙醇溶液溶解并定容到100 mL，得0.2 g/L的蘆丁對照品儲(chǔ)備液.分別準(zhǔn)確移取0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL上述對照品儲(chǔ)備液于不同25 mL容量瓶中，再依次分別加入50%乙醇至容量瓶的一半，1.0 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，1.0 mL 10%的硝酸鋁溶液，5.0 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，50%乙醇定容，每次加入溶液搖勻后靜置10 min.以空白作為對照，在510 nm處測定吸光度.每個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)分別測定3次求平均值，以蘆丁濃度ρ為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制準(zhǔn)曲線，見圖1.

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 黃酮的提取及測定

將川貝母掰成小片，在40 ℃條件下恒溫干燥，經(jīng)粉碎后過40目篩，得到川貝母粉末.準(zhǔn)確稱取0.5 g(M)川貝母粉末于離心管中，取一定量不同濃度的乙醇做溶劑，用超聲波萃取儀重復(fù)提取2次，通過高速離心后，將上層清液收集到容量瓶中，用相應(yīng)提取溶劑定容(V0)，再精確移取定容后的提取液5.0 mL(V1)于25.0 mL(V)容量瓶中，按2.1的方法處理，取待測樣品溶液，測定510 nm處的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程求川貝母黃酮類物質(zhì)的提取濃度(C)，計(jì)算川貝母黃酮類物質(zhì)的提取率(W)：W=(C×V×F)/M.其中，W為黃酮類物質(zhì)的提取率，mg/g；C為黃酮類物質(zhì)的提取濃度，g/L；F=V0/V1為溶液稀釋倍數(shù)；V為溶液體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g.

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步優(yōu)化各因素對川貝母黃酮類物質(zhì)提取率的影響，固定超聲功率不變，對乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間和超聲溫度四個(gè)變量進(jìn)行條件優(yōu)化，根據(jù)正交試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)了L9(34) 正交試驗(yàn)，其因素水平關(guān)系見表 1所示.經(jīng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，最后通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得出黃酮類物質(zhì)超聲波提取最優(yōu)條件.

表1 因素及水平

3 結(jié)果與討論

3.1 紫外-可見吸收波長的確定

通過萼貝提取得到的待測樣品和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，對其進(jìn)行了紫外-可見吸收光譜測試，如圖2所示.蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在顯色前沒有出現(xiàn)特征吸收峰，如圖2(c)所示.顯色后，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在510 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，其峰值位于450和600 nm之間，如圖2(a)所示.萼貝提取得到的待測樣品在顯色前也沒有出現(xiàn)特征吸收峰，如圖2(d)所示.顯色后，樣品也在510 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，如圖2(b)所示.因此可以采用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作為對照檢測萼貝提取物中的黃酮類物質(zhì)，其紫外-可見吸收光譜特征吸收峰為510 nm.

圖2 紫外-可見吸收光譜圖Fig.2 UV-Vis absorption spectra

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

3.2.1 超聲功率對提取率的影響

稱取川貝母粉末0.5 g，加入無水乙醇15.0 mL，在超聲溫度40 ℃條件下超聲提取1.5 h，并重復(fù)提取2次，按2.2的方法處理，并計(jì)算出川貝母黃酮類物質(zhì)的提取率，考察超聲功率對川貝母黃酮類物質(zhì)提取率的影響，其結(jié)果如圖3所示.

圖3 超聲功率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power

從圖3可以看出，在所測定的超聲功率范圍內(nèi)，川貝母黃酮類物質(zhì)的提取率逐漸增大，當(dāng)超聲功率達(dá)到800 W時(shí)，川貝母黃酮類物質(zhì)的提取率達(dá)到最大值并趨于穩(wěn)定.所以，為了節(jié)約能源，達(dá)到綠色化學(xué)的要求，選擇800 W為最佳超聲功率.

3.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響

稱取川貝母粉末0.5 g，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液15.0 mL，在超聲功率800 W和超聲溫度40 ℃條件下超聲提取1.5 h，并重復(fù)提取2次，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對川貝母黃酮類物質(zhì)提取率的影響，其結(jié)果如圖4所示.

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction

由圖4可知，在所測定的乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，川貝母黃酮類物質(zhì)的提取率先隨著乙醇的體積分?jǐn)?shù)的增加而隨之增大，但當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)超過80%時(shí)，川貝母黃酮類物質(zhì)的提取率開始降低.這可能是因?yàn)楫?dāng)乙醇濃度較低時(shí)，黃酮類物質(zhì)的溶出率較小，而隨著乙醇的濃度的增大，黃酮類物質(zhì)的溶解度也隨之增大，但增大到一定的程度時(shí)，黃酮類物質(zhì)與其他有機(jī)物競相溶出，相互競爭，黃酮類物質(zhì)的溶解度反而降低，所以，為了達(dá)到最優(yōu)條件應(yīng)將乙醇的體積分?jǐn)?shù)定為80%.

3.2.3 料液比對提取率的影響

稱取川貝母粉末0.5 g，加入不同體積的80%乙醇溶液，在超聲功率800 W和超聲溫度40 ℃條件下超聲提取1.5 h，并重復(fù)提取2次，考察料液比對川貝母黃酮類物質(zhì)提取率的影響，其結(jié)果如圖5所示.

圖5 液料比的影響Fig.5 Effect of material-solvent ratio

由圖5可知，在所測定的料液比范圍內(nèi)，川貝母黃酮類物質(zhì)的提取率先隨著乙醇用量的增加而隨之增大，但當(dāng)料液比達(dá)到1 g∶40 mL之后，黃酮類物質(zhì)的提取率趨于穩(wěn)定.這是因?yàn)橐掖加昧枯^小時(shí)，黃酮類物質(zhì)不能充分溶解在溶劑中，隨著溶劑用量的增大，黃酮類物質(zhì)的溶解度增大，但隨著溶劑量的進(jìn)一步增加，過量的溶劑已經(jīng)不能對川貝母黃酮類物質(zhì)的提取產(chǎn)生影響，于是黃酮類物質(zhì)的提取率趨于穩(wěn)定.因此確定川貝母黃酮類物質(zhì)超聲提取的最佳料液比為1 g∶40 mL.

3.2.4 超聲時(shí)間對提取率的影響

稱取川貝母粉末0.5 g，加入80%乙醇溶液20.0 mL，在超聲功率800 W和超聲溫度40 ℃條件下進(jìn)行超聲提取，并重復(fù)提取2次，考察超聲時(shí)間對川貝母黃酮類物質(zhì)提取率的影響，其結(jié)果如圖6所示.

圖6 超聲時(shí)間的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time

從圖6可以看出，川貝母黃酮類物質(zhì)的提取率逐漸增大，但當(dāng)超聲時(shí)間超過2 h后，黃酮類物質(zhì)的提取率略有下降.這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間比較短時(shí)，黃酮類物質(zhì)在乙醇中的溶解不充分，隨著超聲時(shí)間的延長，黃酮類物質(zhì)溶解的越來越充分，但超聲時(shí)間過長，其他組分也逐漸被提取出來，反而抑制了黃酮類物質(zhì)的提取，提取效率反而降低.所以，當(dāng)超聲時(shí)間為2 h時(shí)，川貝母黃酮類物質(zhì)的提取率最大.

3.2.5 超聲溫度對提取率的影響

稱取川貝母粉末0.5 g，加入80%乙醇溶液20.0 mL，在超聲功率800 W條件下超聲提取2.0 h，并重復(fù)提取2次，考察超聲溫度對川貝母黃酮類物質(zhì)提取率的影響，其結(jié)果如圖7所示.

圖7 超聲溫度的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature

由圖7可知，在所測定的溫度范圍內(nèi)，川貝母黃酮類物質(zhì)的提取率先隨著溫度的升高而逐漸增加，但當(dāng)超聲溫度超過45 ℃之后，黃酮類物質(zhì)的提取率隨之下降.這是因?yàn)闇囟仍礁?，分子熱運(yùn)動(dòng)越快，黃酮類物質(zhì)的提取率越高，又由于在高溫下，黃酮類物質(zhì)不穩(wěn)定，容易部分分解或氧化，此時(shí)隨著溫度的升高，川貝母黃酮類物質(zhì)的提取率反而下降.因此川貝母黃酮類物質(zhì)的最佳超聲溫度為45 ℃.

3.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表和單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在固定超聲功率800 W不變的情況下，對乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間和超聲溫度四個(gè)因素，設(shè)計(jì)了四因素三水平L9(34) 正交試驗(yàn)，其結(jié)果見表2所示.

表2 正交試驗(yàn)

由表2可知，通過極差R大小進(jìn)行比較分析，可以判斷超聲溫度(D)和料液比(B)對川貝母黃酮類物質(zhì)的提取率有顯著影響，其次是超聲時(shí)間(C)，最后是乙醇體積分?jǐn)?shù)(A).通過均值k進(jìn)行比較分析，得出其最佳提取工藝條件為：A2B3C2D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，料液比為1 g∶45 mL，超聲時(shí)間為2.0 h，超聲溫度為45 ℃.

3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果，在固定超聲功率800 W不變條件下，設(shè)計(jì)五組重復(fù)操作實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表3所示.最佳提取工藝條件下，川貝母黃酮類物質(zhì)的提取率約為77.13 mg/g，根據(jù)測定結(jié)果計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值為0.39%.

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)

3.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

稱取川貝母粉末0.5 g，按最佳提取工藝條件進(jìn)行提取，經(jīng)處理后按所建立的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測，采用加標(biāo)回收法做回收率實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果見表4.從表中可以看出，本方法對檢測苦味酸的回收率和RSD分別為97.48%～103.84%和0.95%～1.72%.

表4 蘆丁加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

4 結(jié)論

本研究以中藥材川貝母為原料，采用超聲波提取技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對川貝母黃酮類物質(zhì)的有效提取.探討了超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間和超聲溫度等單因素對川貝母黃酮類物質(zhì)提取率的影響，在固定超聲功率800 W條件下，通過正交試驗(yàn)對川貝母黃酮類物質(zhì)的提取條件參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，建立了川貝母黃酮類物質(zhì)的超聲波最佳提取工藝參數(shù)：超聲功率800 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，料液比為1 g∶45 mL，超聲時(shí)間為2.0 h，超聲溫度為45 ℃.根據(jù)最佳提取工藝參數(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，川貝母黃酮類物質(zhì)的提取率達(dá)到77.13 mg/g，RSD值為0.39%.當(dāng)加入5.00、20.00、80.00 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品到0.5 g川貝母提取液中，加標(biāo)回收率和RSD分別為97.48%～103.84%和0.95%～1.72%.