殼聚糖膠囊對小鼠免疫功能的影響

李 卓 孫 強(qiáng) 毛日文

殼聚糖(Chitosan)是一種從海洋水生動(dòng)物外殼或真菌細(xì)胞壁中提取的天然多糖[1]，是甲殼素經(jīng)脫鈣、脫蛋白質(zhì)和脫乙酰基后的產(chǎn)物[2]。殼聚糖中的高分子多糖是一種線型的天然中性黏多糖，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一陽離子動(dòng)物纖維，唯一的堿性多糖[3]。殼聚糖是一種免疫調(diào)節(jié)劑，可激活豚鼠腹膜的巨噬細(xì)胞和中性殺傷細(xì)胞，增加抗體生成，提高遲發(fā)型超敏反應(yīng)，增加老鼠的細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)如白介素、增殖因子和干擾素的細(xì)胞分裂[1]。蜂膠是蜜蜂從植物芽孢和樹干處采集的樹脂，混入蜜蜂上顎腺分泌物和蜂蠟等形成的一種具有芳香味的黏性膠狀固形物[4]。蜂膠對機(jī)體免疫系統(tǒng)具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，國內(nèi)外對此已做了大量報(bào)道，它不但能增強(qiáng)體液免疫，還能促進(jìn)細(xì)胞免疫，蜂膠能有效提高巨噬細(xì)胞的活性、吞噬能力和抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌；增加自然殺傷細(xì)胞的活性；調(diào)節(jié)多形核粒細(xì)胞的活性，控制其增殖，因而可以提高機(jī)體的免疫力，使機(jī)體免疫功能處于動(dòng)態(tài)平衡的最佳狀態(tài)[5]。

殼聚糖或蜂膠單獨(dú)使用增強(qiáng)免疫力作用的報(bào)道很多，而關(guān)于殼聚糖和蜂膠復(fù)配使用增強(qiáng)免疫力的作用尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)以小鼠為研究對象，研究殼聚糖膠囊對正常小鼠免疫功能的影響。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》[6]，對殼聚糖膠囊進(jìn)行增強(qiáng)免疫力功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.材料與方法

1.1 樣品 殼聚糖膠囊由某保健食品公司提供，內(nèi)容物為土黃色粉狀，人體推薦量為內(nèi)容物凈重1600mg/(人·日),其中含有殼聚糖1320mg/(人·日)，蜂膠粉280mg/(人·日)。殼聚糖膠囊置于陰涼干燥處保存，供實(shí)驗(yàn)用。

1.2 動(dòng)物 選用上海某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司繁殖的18.0～22.6gF1健康雌性小鼠60只，隨機(jī)分為4組，每組15只，作為Ⅰ組，進(jìn)行二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠DTH試驗(yàn)。18.3～22.4gF1健康雌性小鼠60只，隨機(jī)分為4組，每組15只，作為Ⅱ組，進(jìn)行小鼠抗體生成細(xì)胞及半數(shù)溶血值(HC50)試驗(yàn)。18.0～22.6gF1健康雌性小鼠60只，隨機(jī)分為4組，每組15只，作為Ⅲ組，進(jìn)行小鼠碳廓清試驗(yàn)。18.6～22.7gF1健康雌性小鼠60只，隨機(jī)分為4組，每組15只，作為Ⅳ組，進(jìn)行小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)。18.8～22.1gF1健康雌性小鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只，作為Ⅴ組，進(jìn)行小鼠ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、NK細(xì)胞活性試驗(yàn)。

1.3 儀器與設(shè)備 打孔器、T1000型電子動(dòng)物稱、722型分光光度計(jì)、超凈工作臺、酶標(biāo)儀、二氧化碳培養(yǎng)箱。

1.4 方法

1.4.1 劑量設(shè)定：每人(按60kg體重計(jì))每日推薦量為1600mg，相當(dāng)于26.7mg/(kg·bw)。分別按人體推薦攝入量5倍、10倍、30倍設(shè)計(jì)三個(gè)劑量組即133mg/(kg·bw)、267mg/(kg·bw)、800mg/(kg·bw)，另設(shè)0mg/(kg·bw)組以水(已消毒)代替受試物，經(jīng)口每日一次給予小鼠相應(yīng)劑量的受試物，連續(xù)灌胃30天后測各項(xiàng)增強(qiáng)免疫力功能指標(biāo)。小鼠灌胃量為10ml/(kg·bw)。

1.4.2 二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo)小鼠DTH(耳腫脹法)：參考《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》。

1.4.3 血清溶血素測定：參考《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》。

1.4.4 抗體生成細(xì)胞測定(Jerne改良玻片法)：參考《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》。

1.4.5 小鼠碳廓清試驗(yàn)：參考《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》。

1.4.6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)(半體內(nèi)法)：參考《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》。

1.4.7 NK細(xì)胞活性測定(乳酸脫氫酶測定法)：參考《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》。

1.4.8 ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(MTT法)：參考《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 10.0軟件對各實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，滿足“方差齊”要求的數(shù)據(jù)資料，用單因素方差分析和多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與一個(gè)對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理；對非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)資料進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足“正態(tài)方差齊”要求后，用轉(zhuǎn)換所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2.結(jié)果與分析

2.1 樣品對小鼠體重的影響 133mg/(kg·bw)、267mg/(kg·bw)、800mg/(kg·bw)組與0mg/(kg·bw)組相比較，差異均無顯著性。殼聚糖膠囊對小鼠的體重增長無影響。

2.2 樣品對胸腺、脾臟器官的影響 所測定的胸/體比、脾/體比值，133mg/(kg·bw)、267mg/(kg·bw)、800mg/(kg·bw)組與0mg/(kg·bw)組相比較，差異均無顯著性。

2.3 樣品對DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH的影響 由表1結(jié)果可見，133mg/(kg·bw)、267mg/(kg·bw)、800mg/(kg·bw)組與0mg/(kg·bw)組相比較，差異均無顯著性。

表1 樣品對DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH的影響

2.4 樣品對小鼠血清溶血素形成的影響 由表2結(jié)果可見，267mg/(kg·bw)組小鼠血清溶血素含量明顯高于0mg/(kg·bw)組。

表2 樣品對小鼠血清溶血素形成的影響

2.5 樣品對抗體生成細(xì)胞(溶血空斑數(shù))的影響 由表3結(jié)果可見，267mg/(kg·bw)、800mg/(kg·bw)組小鼠溶血空斑數(shù)明顯高于0mg/(kg·bw)組。

2.6 樣品對碳廓清作用的影響 由表4結(jié)果可見，133mg/(kg·bw)與800mg/(kg·bw)組小鼠吞噬指數(shù)明顯高于0mg/(kg·bw)組。

表3 樣品對溶血空斑的影響

表4 樣品對小鼠碳廓清作用的影響

2.7 樣品對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率及吞噬指數(shù)的影響 由表5結(jié)果可見，800mg/(kg·bw)組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率顯著高于0mg/(kg·bw)組。267mg/(kg·bw)與800mg/(kg·bw)組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬指數(shù)顯著高于0mg/(kg·bw)組。

表5 樣品對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率及吞噬指數(shù)的影響

2.8 樣品對NK細(xì)胞活性的影響 由表6結(jié)果可見，800mg/(kg·bw)組小鼠NK細(xì)胞活性明顯高于0mg/(kg·bw)組。

表6 樣品對NK細(xì)胞活性的影響

表7 樣品對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

2.9 樣品對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響 由表7結(jié)果可見，800mg/(kg·bw)組小鼠加ConA孔與不加ConA孔吸光度的差值明顯高于0mg/(kg·bw)組。

3.討論

亞健康狀態(tài)是指人體處于疾病與健康之間的一種狀態(tài)。亞健康狀態(tài)以疲勞、活力減退、免疫力降低為主要臨床表現(xiàn)，已經(jīng)成為危害健康的隱患之一。以慢性疲勞為主要癥狀的亞健康問題是21世紀(jì)威脅人類健康的重大問題，發(fā)生率呈逐年增加的趨勢。因此，以提高免疫力來預(yù)防亞健康為切入點(diǎn)具有非常重要的作用[7]。

大量研究結(jié)果表明，殼聚糖可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，對免疫系統(tǒng)具有多方面的調(diào)節(jié)作用[8]。殼聚糖具有調(diào)解和提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)抗體產(chǎn)生和增強(qiáng)機(jī)體抗病能力的功能。殼聚糖具有抵抗原性，能使交感和副交感神經(jīng)取均衡。此外，殼聚糖還能使體液保持正常，從而達(dá)到強(qiáng)化體細(xì)胞及免疫細(xì)胞的目的，提高人體免疫力[9]。蜂膠是一種天然高效的免疫增強(qiáng)劑,能刺激機(jī)體的免疫機(jī)能，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活力，提高機(jī)體免疫力,對預(yù)防感冒、癌癥、衰老和消除老年斑、色素沉積有良好作用[10]。殼聚糖和蜂膠都具有增強(qiáng)免疫力的作用，因此開發(fā)殼聚糖、蜂膠復(fù)配的產(chǎn)品有一定的意義。

本試驗(yàn)經(jīng)口給予小鼠不同劑量的殼聚糖膠囊30天，結(jié)果顯示，殼聚糖膠囊能增強(qiáng)小鼠碳廓清的能力，提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率及吞噬指數(shù)，促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞溶血空斑及血清溶血素的形成，能增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞的增殖能力，提高NK細(xì)胞的活性，因此認(rèn)為殼聚糖膠囊具有增強(qiáng)免疫力的功能。