孕酮調(diào)節(jié)腺苷信號通路緩解大鼠神經(jīng)病理性疼痛*

蘇 穎 胡志妍 賈改麗 李 莉 俞陳陳 朱雅冰 謝 紅

（1 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 育英兒童醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，溫州 325027；2 蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，蘇州 215000；3 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 育英兒童醫(yī)院 浙江省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州 325027；4 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，溫州 325015）

國際疼痛學(xué)會定義由軀體感覺系統(tǒng)損傷或疾病引起的疼痛為神經(jīng)病理性疼痛 (neuropathic pain, NP)[1]。NP 常繼發(fā)于創(chuàng)傷、糖尿病、感染及癌癥等，主要表現(xiàn)為痛覺過敏、異常性疼痛和自發(fā)性疼痛。NP 患病人數(shù)逐年增加，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，但目前臨床治療效果欠佳。NP 對于機(jī)體是一種慢性應(yīng)激，能引起機(jī)體生理和心理等發(fā)生異常變化。其中對維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有重要作用的生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)是最易受到影響的系統(tǒng)之一。睪丸產(chǎn)生睪酮，是生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)敏感的靶器官。男性睪酮水平降低不僅影響免疫系統(tǒng)干擾炎癥反應(yīng)[2]，還易使機(jī)體產(chǎn)生疼痛和不愉快情緒[3]。疼痛能激活大腦邊緣系統(tǒng)的終紋床核(bed nuclei of the stria terminals, BST)神經(jīng)元，該腦區(qū)是協(xié)調(diào)應(yīng)激以及神經(jīng)內(nèi)分泌改變的重要腦區(qū)[4]，也與疼痛引起的厭惡情緒密切相關(guān)[5]。從機(jī)體整體水平調(diào)節(jié)與NP 相關(guān)重要系統(tǒng)的功能比，僅治療神經(jīng)損傷部位更有助于NP 的改善。內(nèi)源性神經(jīng)類固醇孕酮對腦和脊髓都有保護(hù)作用，利于NP 的恢復(fù)[6,7]，但其機(jī)制還未完全清楚。

孕酮影響具有鎮(zhèn)痛作用的內(nèi)源性腺苷水平，腺苷的鎮(zhèn)痛作用主要是通過G 蛋白偶聯(lián)腺苷A1 受體(adenosine 1 receptor, A1R)介導(dǎo)[8]。至今國內(nèi)外尚無研究調(diào)節(jié)機(jī)體生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)靶器官功能對NP 影響的報道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立坐骨神經(jīng)結(jié)扎損傷(chronic constriction injury, CCI)模型，測定背根神經(jīng)節(jié) (dorsal root ganglion, DRG) 和脊髓背角(spinal dorsal horn, SDH)以及生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)靶器官睪丸和疼痛相關(guān)腦區(qū)BST 的腺苷上游信號胞外5'-核苷酸酶(ecto-5'-nucleotidase, CD73)和腺苷下游信號A1R 的表達(dá)，探討孕酮治療NP 時睪丸和BST腺苷信號改變對NP 的影響，為NP 的治療提供更多研究基礎(chǔ)和新思路。

方 法

1. 實(shí)驗(yàn)動物和主要試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)用SPF 級SD 大鼠32 只，體重230±20 g，購自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。實(shí)驗(yàn)主要試劑：孕酮（美國Sigma公司），DPCPX（美國Sigma公司），甲醇和乙腈（色譜純，德國Merk 公司），NT5E/CD73 抗體（兔抗多克隆抗體，中國Proteintech 公司），Adenosine A1 Receptor 抗體（兔抗多克隆抗體，中國Proteintech 公司）。主要儀器：von Frey 電子自動測痛儀（美國Life Science 公司），336 爪/尾刺激痛覺測試儀（美國Life Science 公司），UPLC/MS/MS 液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Waters 公司），石蠟切片機(jī)（德國Leica 公司），顯微鏡（日本Nikon 公司），蛋白質(zhì)電泳設(shè)備（美國BIO-RAD 公司），超低溫冰箱（美國Thermo 公司）。

2. 動物模型建立、分組及處理

32 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為4 組 (n = 8)：假手術(shù)組（Sham + 溶劑組，Sham + VEH 組）、模型組（CCI + VEH 組）、腺苷A1 受體拮抗劑組（DPCPX組，腹腔注射2 mg·kg-1，結(jié)扎后第14 天開始連續(xù)給藥14 天，先后間隔半小時給予DPCPX 和孕酮）[9]、孕酮組（PROG 組，腹腔注射12 mg·kg-1，結(jié)扎后第14 天開始連續(xù)給藥14 天）[10,11]。參照Bennett 等的方法，建立CCI 大鼠模型，結(jié)扎右后肢坐骨神經(jīng)。為避免操作差異，所有動物的手術(shù)操作由同一人進(jìn)行，術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)。CCI 模型建立后第7 天，痛閾降低30%以上，且出現(xiàn)術(shù)側(cè)爪內(nèi)收、后足輕度外翻和跛行，顯示模型成功，否則予以剔除。術(shù)前1 天、術(shù)后第7、14、21 和28 天給藥后進(jìn)行機(jī)械性縮足閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)和熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL) 兩種行為學(xué)測試。術(shù)后第28 天行為學(xué)測試后取血清測定血清睪酮含量；每組3 只大鼠甲醛灌注，取L4-5DRG 和對應(yīng)的脊髓節(jié)段檢測CD73 免疫組化陽性細(xì)胞；每組5 只大鼠進(jìn)行L4-5DRG 和對應(yīng)的脊髓節(jié)段取材，檢測A1R 蛋白表達(dá)，并進(jìn)行睪丸和BST 腦區(qū)取材，檢測CD73 和A1R 蛋白表達(dá)。

3. MWT 的測定

用von Frey 電子自動測痛儀檢測大鼠MWT。實(shí)驗(yàn)時將大鼠置于有機(jī)玻璃罩內(nèi)，底部為用金屬絲制成的網(wǎng)格墊，測試前讓大鼠適應(yīng)30 min，此期間大鼠活動較多，有便溺行為，仔細(xì)清理網(wǎng)格上的糞便，30 min 后用von Frey 細(xì)絲垂直刺激大鼠右后足底部中間的區(qū)域（未實(shí)施手術(shù)的足底則刺激與之相同的區(qū)域），待大鼠有明確反應(yīng)（如舔足、突然收縮或抖足等）時，記錄液晶顯示器上的數(shù)字度數(shù)，該讀數(shù)即為大鼠的機(jī)械縮足反射閾值；最大施加力度為55 g，每次測試至少間隔約10 min，等候刺激引起的行為反應(yīng)（如舔足等）完全消失后再給予下一次刺激；MWT 為3 次測試的平均值。

4. TWL 的測定

采用336 爪/尾刺激痛覺測試儀測定大鼠TWL。參數(shù)設(shè)定：加熱頭空閑時激光發(fā)射強(qiáng)度為20%，加熱頭測試工作時激光發(fā)射強(qiáng)度為60%，切斷時間30 s，以防測試時間過長對動物造成損傷，觸發(fā)溫度30℃；將實(shí)驗(yàn)大鼠置于透明玻璃板上，照射大鼠右側(cè)后足足底至出現(xiàn)抬腿回避時間為熱縮足反射潛伏期；每次刺激間隔5 min，測3 次取平均值。

5. 液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS)檢測血清睪酮含量

連續(xù)給藥14 天行為學(xué)檢測后取血，參考Gao等[12]的方法并加以改進(jìn)，測定大鼠血清睪酮含量。

色譜條件：色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS C18(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；流動相：0.1% 乙酸（流動相A），乙腈（流動相B），流速0.4 ml·min-1；柱溫30℃；樣品室溫度10℃；進(jìn)樣量為10 μl，采用梯度洗脫程序：60% A～40% B，1 min；10% A～90% B，1.5 min；60% A～40% B，1.4 min。

質(zhì)譜條件：采用ESI 正電離模式，多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，毛細(xì)管電壓為3 000 V，錐孔電壓38 V，離子源溫度150℃，脫溶劑氣溫度500℃；錐孔氣流量50 L·h-1；脫溶劑氣流量均為1 000 L·h-1；碰撞氣為氬氣，碰撞能量22 V；母離子：289.1，子離子：97.1。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量測定采用FBS 血清-睪酮溶液。

6. 免疫組化檢測DRG 和SDH 的CD73 表達(dá)

連續(xù)給藥14 天行為學(xué)檢測后以5%水合氯醛深麻醉大鼠，待意識消失后開胸經(jīng)左心室-升主動脈插管，生理鹽水快速灌注至右心室流出液透亮后，再灌注4%多聚甲醛150 ml，見肝臟發(fā)白、四肢僵直，將大鼠L4-5DRG 和對應(yīng)脊髓節(jié)段取出，4%多聚甲醛固定24 h 后，梯度蔗糖溶液脫水，石蠟包埋，做連續(xù)冠狀切片，片厚4 μm，54℃恒溫水浴展片，晾干備用。依次60℃烤片、二甲苯脫蠟至水化、梯度乙醇脫水、枸櫞酸修復(fù)液中高壓熱修復(fù)抗原；3%過氧化氫封閉后分別加入兔抗鼠CD73 抗體(1:500)或兔抗鼠A1R 抗體(1:500)，37℃孵育2 h 后PBS液沖洗；加入抗兔兩步法檢測試劑，37℃孵育2 h后PBS 液沖洗；DAB 顯色、蘇木素復(fù)染；分化、脫水、透明、封片。尼康倒置顯微鏡觀察并采集圖像，每組選3 張切片，每張切片隨機(jī)挑選3 個100 倍視野進(jìn)行拍照，胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行分析。

7. Western blot 檢測DRG 和SDH 的A1R 蛋白、睪丸和BST 腦區(qū)CD73 和A1R 蛋白含量的變化

以5%水合氯醛深麻醉后處死大鼠，迅速在冰上分離L4-5DRG 和對應(yīng)脊髓節(jié)段、睪丸和BST 腦區(qū)，分別置于凍存管中液氮速凍。檢測時加入組織裂解液和酶抑制劑，冰上勻漿，離心取上清；BCA 法測蛋白濃度；配平后加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(5×)100℃變性，冷卻后離心-20℃保存；分別配置5%濃縮膠和10%分離膠(SDS-PAGE)；加入marker 和樣本，電泳至溴酚藍(lán)達(dá)分離膠底部（75 V 45 min 和120 V 90 min）；再將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上（恒流200 mA 1 h）；5%脫脂奶粉封閉1 h；TBST 洗膜，加入兔抗鼠CD73 一抗（1:1 000 稀釋）或兔抗鼠A1R 一抗（1:1 000 稀釋），4℃孵育過夜；TBST 洗膜3 次；加入二抗(1:3 000)孵育2 h；TBST 洗膜3 次；膜上均勻涂抹化學(xué)發(fā)光底物，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光掃描條帶，Alpha 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白條帶的相對灰度值。

8. 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，用Levene 法檢測方差是否齊性。行為學(xué)結(jié)果比較采用重復(fù)測量方差分析，兩兩比較用最小顯著差法(LSD)，校正系數(shù)Epsilon ＜ 0.7時，選擇Bonferroni 法進(jìn)行兩兩比較；其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用One-way ANOVA 方差分析，方差齊性時兩兩比較用LSD 法，方差不齊時用Dunnett's T3 法。P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 各組大鼠MWT 和TWL 的變化

造模前各組大鼠的MWT 和TWL 基礎(chǔ)值之間均無顯著性差異，造模后未見感染和自殘現(xiàn)象。CCI 大鼠術(shù)側(cè)爪內(nèi)收、足外翻和跛行，Sham + VEH 組大鼠無此表現(xiàn)。CCI 術(shù)后有4 只大鼠行為學(xué)測定值的標(biāo)準(zhǔn)差大，予以剔除，每組7 只動物繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

與Sham + VEH 組相比，其他3 組大鼠MWT在術(shù)后第7 天有明顯下降(P ＜ 0.01)，第14 天分別降至最低，且這3 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。分別給予藥物或溶劑后，第21 天 PROG 組MWT 比CCI + VEH 組和DPCPX 組都顯著回升(P ＜ 0.01)，而DPCPX 組與CCI + VEH 組間無明顯差異。第28 天各組MWT維持相對穩(wěn)定（見圖1）。

術(shù)后第7 天，除Sham + VEH 組外其他3 組TWL 都顯著降低(P ＜ 0.01)，第14 天降至更低，這3 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。給藥后，第21 天和第28 天時PROG 組TWL 比CCI + VEH 組和DPCPX組均顯著升高(P ＜ 0.01)；DPCPX 組與CCI + VEH 組TWL 在第21 天和第28 天時差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見圖2）。

2. 血清睪酮含量的變化

經(jīng)LC-MS/MS 檢測，睪酮及內(nèi)標(biāo)睪酮-D3 的質(zhì)譜圖見圖3，色譜圖見圖4。睪酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y = 0.0 008 784 x + 0.07369，R2為0.9978，線性范圍100～10 000 pg·ml-1，最低定量限100 pg·ml-1?；厥章试凇?5%以內(nèi)，RSD 均小于10%，由絕對回收率和基質(zhì)效應(yīng)得出血清中內(nèi)源性物質(zhì)對睪酮和內(nèi)標(biāo)的測定沒有影響，此檢測方法準(zhǔn)確、可靠。CCI + VEH 組比Sham + VEH 組的睪酮含量顯著減少(P ＜ 0.05)。與CCI + VEH 組相比，PROG 組和DPCPX 組睪酮含量都有回升(P ＜ 0.05)，但PROG組回升的更顯著（P ＜ 0.05，見圖5）。

3. DRG 和SDH 的CD73 表達(dá)變化

圖1 各組大鼠MWT 變化(n = 7, ±SD)*P ＜ 0.01，與 Sham + VEH 組相比；#P ＜ 0.05，與CCI + VEH 組相比；△P ＜ 0.05，與DPCPX 組相比Fig. 1 Variations of MWT (n = 7, ±SD)*P ＜ 0.01, compared with group Sham + VEH; #P ＜ 0.05, compared with group CCI + VEH; △P ＜ 0.05, compared with group DPCPX.

圖2 各組大鼠TWL 變化 (n = 7, ±SD)*P ＜ 0.01，與 Sham + VEH 組相比；#P ＜ 0.05，與CCI + VEH 組相比；△P ＜ 0.05，與DPCPX 組相比Fig. 2 Variations of TWL (n = 7, ±SD)*P ＜ 0.01, compared with group Sham + VEH; #P ＜ 0.01, compared with group CCI + VEH; △P ＜ 0.05, compared with group DPCPX.

CD73 是促進(jìn)腺苷生成的上游酶，高表達(dá)于DRG 和SDH 神經(jīng)元上。CCI 模型大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎后第14 天開始連續(xù)給予孕酮或提前半小時注射A1R 拮抗劑，第28 天檢測DRG（左列）和SDH（右列）的CD73 免疫組化染色結(jié)果（見圖6）。SDH 與DRG 情況類似，PROG 組和DPCPX 組與CCI + VEH組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，PROG 組也與DPCPX 組間有顯著性差異。提示孕酮促進(jìn)這兩處組織CD73 的恢復(fù)，以便機(jī)體產(chǎn)生更多適量的腺苷發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，但A1R 拮抗劑能減弱這種促進(jìn)作用。

圖3 睪酮和睪酮-D3 質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectrum of testosterone and testosterone-D3

圖4 睪酮和睪酮-D3 血清樣品色譜圖(A, D)分別為不含睪酮和睪酮-D3 的空白FBS 血清；(B, E)分別為含睪酮和睪酮-D3 的FBS 血清標(biāo)準(zhǔn)添加樣品（線性中間濃度）；(C, F)分別為含睪酮和睪酮-D3 的實(shí)測大鼠血清樣品Fig. 4 Chromatogram of testosterone-D3 in serum(A, D) were blank FBS serums without testosterone or testosterone-D3, respectively; (B, E) were FBS serum spiked samples (Linear intermediate concentration) for testosterone and testosterone-D3 apart; (C, F) were measured serum samples of rats for testosterone and testosterone-D3 separately.

4. DRG 和SDH 的A1R 蛋白及睪丸和BST 腦區(qū)的CD73、A1R 蛋白變化

睪丸合成的睪酮引起的作用及BST 產(chǎn)生的痛覺相關(guān)厭惡情緒都與外周NP 的進(jìn)展密切相關(guān)。CD73分布于全身各組織器官。腺苷A1R 高表達(dá)于DRG和SDH 神經(jīng)元上，在睪丸主要表達(dá)于支持細(xì)胞，高密度表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本研究在第28 天行為學(xué)測試后各組5 只大鼠取出DRG、SDH、睪丸和BST 腦區(qū)組織，提取總蛋白后檢測CD73 或A1R 蛋白相對濃度。使用β-actin 為內(nèi)參蛋白。免疫印記條帶顯示，睪丸和BST 腦區(qū)CD73 蛋白在PROG 組和DPCPX 組間無差異，但這兩組的CD73 蛋白水平均顯著高于CCI + VEH 組，提示孕酮治療利于睪丸和BST 腦區(qū)的CD73 蛋白恢復(fù)，但拮抗A1R 未明顯干擾此作用；坐骨神經(jīng)結(jié)扎后CCI + VEH 組上述四種組織的A1R 蛋白比Sham + VEH 組均減少(P ＜ 0.05)；給予孕酮后，PROG 組這四種組織的A1R 蛋白表達(dá)均比CCI + VEH 組顯著增多(P ＜ 0.05)；然而DPCPX 組這四種組織的A1R 蛋白均比PROG 組顯著減少（P ＜ 0.05，見圖 7），說明拮抗A1R 影響孕酮治療引起的A1R 蛋白水平恢復(fù)。

圖5 各組大鼠血清睪酮含量 (n = 7, ±SD)*P ＜ 0.01，與Sham + VEH 組相比；#P ＜ 0.01，與CCI + VEH 組相比；△P ＜ 0.01，與DPCPX 組相比Fig. 5 Testosterone levels in serum (n = 7, ±SD)*P ＜ 0.01, compared with group Sham + VEH; #P ＜ 0.01, compared with group CCI + VEH; △P ＜ 0.01, compared with group DPCPX.

討 論

圖6 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角CD73 表達(dá)的免疫組化檢測 (n = 3, ±SD) (200×, Scale bar = 200 μm)(A, E) Sham + VEH 組； (B, F) CCI + VEH 組；(C, G) DPCPX 組； (D, H) PROG 組；(I) 各組背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角CD73 陽性細(xì)胞計數(shù)*P ＜ 0.05，與Sham + VEH 組相比；#P ＜ 0.05，與CCI + VEH 組相比；△P ＜ 0.05，與DPCPX 組相比Fig. 6 Immunohistochemistry detection of expression of CD73 in DRG and the SDH (n = 3, ±SD) (200×, Scale bar = 200 μm)(A, E) Sham + VEH group; (B, F) CCI + VEH group; (C, G) DPCPX group; (D, H) PROG group; (I) positive cell counting for each group*P ＜ 0.05, compared with group Sham + VEH; #P ＜ 0.05, compared with group CCI + VEH; △P ＜ 0.05, compared with group DPCPX.

圖7 各組大鼠CD73 和A1R 蛋白表達(dá)反應(yīng)條帶和相對蛋白濃度比較 (n = 4, ±SD)(A-D)蛋白表達(dá)反應(yīng)條帶；(A) 背根神經(jīng)節(jié)；(B) 脊髓背角；(C) 睪丸；(D) BST 腦區(qū)；(E) 睪丸和BST 腦區(qū)CD73蛋白相對濃度；(F) 四種組織A1R 蛋白相對濃度*P ＜ 0.05，與Sham + VEH 組相比；#P ＜ 0.05，與 CCI + VEH 組相比；△P ＜ 0.05，與DPCPX 相比Fig. 7 The protein expression and relative concentration of CD73 and A1R (n = 4, ±SD)(A-D) The protein expression; (A) The protein expression in DRG; (B) the protein expression in SDH; (C) the protein expression in testis; (D) the protein expression in brain BST; (E) the relative concentration of CD73 in testis and brain BST; (F) the relative concentration of A1R in the four tissues*P ＜ 0.05, compared with group Sham + VEH; #P ＜ 0.05, compared with group CCI + VEH; △P ＜ 0.05, compared with group DPCPX.

NP 引起機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，影響生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。同時，生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)功能的改變，也會對NP 產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。病理情況下男性睪酮水平降低，更易產(chǎn)生疼痛和不愉快情緒。對發(fā)生NP 的糖尿病雄性大鼠給予睪酮代謝產(chǎn)物干預(yù)，可以改善痛閾，并通過調(diào)節(jié)突觸前膜和突觸后膜、谷氨酸釋放以及多種免疫和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等調(diào)節(jié)NP[13]。本研究中坐骨神經(jīng)損傷使CCI + VEH 組血清睪酮水平顯著降低，但給予孕酮治療后有所回升，且可被A1R 拮抗劑抑制。這些說明既是雄性激素也是神經(jīng)類固醇的睪酮參與了NP 的進(jìn)展，具有鎮(zhèn)痛作用的內(nèi)源性腺苷與機(jī)體的疼痛和應(yīng)激反應(yīng)密不可分。腺苷是由CD73 催化三磷酸腺苷代謝產(chǎn)物5'-AMP 去磷酸化生成，這一過程能迅速減少局部組織內(nèi)三磷酸腺苷的積聚，也直接影響腺苷功能的實(shí)現(xiàn)。鞘內(nèi)注射重組CD73 可以改善小鼠的熱痛和機(jī)械痛，但對A1R 基因敲除小鼠無效。Kan 等也發(fā)現(xiàn)A1R 敲除小鼠和正常小鼠相比，TWL 縮短，坐骨神經(jīng)結(jié)扎后A1R 敲除小鼠比正常小鼠的熱痛覺過敏癥狀更加明顯。拮抗A1R 可以阻礙外源性腺苷緩解辣椒辣素對小鼠引起的NP[14]。這些都提示A1R 是腺苷發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的重要受體。為了深入探索改善NP 的分子機(jī)制，本研究從調(diào)控腺苷生成的上游酶CD73 和腺苷下游A1R 為靶點(diǎn)進(jìn)行檢測。本研究也發(fā)現(xiàn)孕酮治療后能使NP 大鼠睪丸組織降低的CD73 蛋白和A1R 蛋白都明顯提高，與睪酮水平的變化相符，結(jié)合NP 的行為學(xué)改變，說明孕酮對睪丸腺苷信號的調(diào)節(jié)可能與NP 的改善有關(guān)。

神經(jīng)元周圍組織環(huán)境的改變干擾機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡。發(fā)生NP 時，合成神經(jīng)類固醇的酶和活性神經(jīng)類固醇都增多，參與了NP 的調(diào)節(jié)過程[15]，這是機(jī)體的保護(hù)性反應(yīng)，孕酮屬于這類重要的類固醇。有研究發(fā)現(xiàn)，孕酮抑制實(shí)驗(yàn)性脊髓損傷和CCI 大鼠異常性疼痛[7]，也可顯著改善大鼠NP 痛覺過敏和異常性疼痛的行為學(xué)得分[11]。本研究結(jié)果顯示，連續(xù)給予孕酮治療7 天后，即手術(shù)后第21 天，PROG組的機(jī)械痛閾和熱痛閾都比CCI + VEH 組顯著性升高，NP 得以改善，研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致。研究報道，一定劑量范圍內(nèi)的孕酮治療動物外周神經(jīng)損傷，產(chǎn)生保護(hù)作用的同時不會導(dǎo)致明顯的不良反應(yīng)[10]。孕酮可作用于機(jī)體多種組織器官，又可以從多方面保護(hù)神經(jīng)功能，故本研究使用孕酮作為NP的治療藥物。

早期Pen?e 等發(fā)現(xiàn)孕酮能使腺苷脫氨酶水平降低，間接促使內(nèi)源性腺苷水平升高，這提示孕酮影響腺苷的代謝。本研究從孕酮調(diào)節(jié)腺苷生成的角度進(jìn)行探索。在生理和病理?xiàng)l件下，全身各組織都可以產(chǎn)生腺苷，即腺嘌呤核苷。腺苷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)調(diào)節(jié)因子。神經(jīng)源性疼痛的病人血液及腦脊液中腺苷的濃度低于只有神經(jīng)系統(tǒng)損傷而無疼痛的病人。勞力型心絞痛的病人靜脈注射低劑量腺苷可以減輕疼痛的癥狀，而對心率、血壓以及心電圖征象均無影響。腺苷也經(jīng)常被用來治療病人的術(shù)后疼痛，可以減少其他術(shù)后鎮(zhèn)痛藥的用量。安慰劑對照的雙盲實(shí)驗(yàn)中，給NP 病人靜脈或鞘內(nèi)注射腺苷，都可減輕病人的痛覺過敏、異常性疼痛和/或自發(fā)性疼痛的癥狀，這種止痛作用可以持續(xù)數(shù)小時甚至數(shù)天。既然已有臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)注射大劑量的腺苷或類似物對脊髓無神經(jīng)毒性，不會使運(yùn)動功能顯著受損，那么如果可以通過改變相關(guān)組織和器官的內(nèi)源性腺苷水平來調(diào)節(jié)NP，可能會使NP 的治療更加安全有效，而本研究使用的孕酮就可以改變機(jī)體內(nèi)源性腺苷水平。

NP 形成過程中，DRG 和SDH 神經(jīng)元發(fā)揮復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，參與痛覺信息處理過程。CD73 和A1R高表達(dá)于這兩處組織的神經(jīng)元上。這些神經(jīng)元上A1R 的激活，抑制炎癥和神經(jīng)損傷導(dǎo)致的NP。本研究給予大鼠孕酮治療14 天后，PROG 組比CCI + VEH組DRG 和SDH 的CD73 陽性細(xì)胞明顯增多，使機(jī)體產(chǎn)生更多適量的腺苷發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，拮抗A1R 明顯 干 擾 此 作 用。PROG 組DRG 和SDH 的A1R 蛋白都比對應(yīng)的CCI + VEH 組顯著增多，也顯著高于DPCPX 組，證明孕酮促進(jìn)A1R 蛋白恢復(fù)的作用可被A1R 拮抗劑抑制。結(jié)合行為學(xué)改變，提示孕酮促進(jìn)NP 大鼠傳入神經(jīng)DRG 和初級傳入神經(jīng)中樞SDH 的CD73 和A1R 蛋白恢復(fù)，參與了NP 的改善過程。

男性生殖系統(tǒng)不是孤立的，與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)密切作用形成生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)，即下丘腦-垂體-睪丸軸，是最易受到應(yīng)激影響的重要系統(tǒng)之一，對維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有重要作用。BST 含有性激素受體，睪酮水平的變化也影響該腦區(qū)核團(tuán)的功能。BST 位于伏隔核的后方，是連接邊緣前腦與下丘腦室旁核HPA 軸效應(yīng)神經(jīng)元的重要腦區(qū)。生成促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的神經(jīng)元胞體位于BST 內(nèi)，其部分神經(jīng)纖維密集投射到下丘腦[16]，影響生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)功能。疼痛引起腹側(cè)與背側(cè)BST 內(nèi)的去甲腎上腺素和促皮質(zhì)素釋放因子的釋放，激活BST II 類神經(jīng)元，抑制從BST 投射到VTA 區(qū)的輸出型GABA 能神經(jīng)元，使VTA 區(qū)輸入型GABA 能神經(jīng)元的抑制作用增強(qiáng)及VTA 區(qū)多巴胺能神經(jīng)元興奮性減弱，引起與疼痛密切相關(guān)的厭惡情緒[5]。腹側(cè)BST 的谷氨酸—一氧化氮信號被激活，引起誘導(dǎo)型超極化陽性神經(jīng)元興奮也是厭惡情緒產(chǎn)生的重要環(huán)節(jié)[17]。疼痛引起的與BST 腦區(qū)相關(guān)的厭惡情緒屬于應(yīng)激情緒，都不利于恢復(fù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡和疾病的康復(fù)，減弱這種厭惡不良情緒將有利于NP的恢復(fù)[18,19]。本研究結(jié)果顯示孕酮對NP 大鼠BST腦區(qū)CD73 蛋白和A1R 蛋白有明顯的修復(fù)作用，其中A1R 蛋白修復(fù)作用可被A1R 拮抗劑抑制，結(jié)合行為學(xué)改變，提示孕酮對該腦區(qū)腺苷信號的調(diào)節(jié)可能也參與了NP 改善的過程。這些與孕酮通過另一個腦區(qū)對NP 大鼠產(chǎn)生保護(hù)作用的研究結(jié)果相呼應(yīng)[20]。本研究中PROG 組與DPCPX 組相比，睪丸和BST腦區(qū)CD73 蛋白改變不明顯，可能用孕酮治療NP 時，抑制這兩個組織和器官的A1R，只影響腺苷信號下游受體作用，未影響到腺苷信號上游的調(diào)節(jié)因子。

綜上所述，從機(jī)體整體水平調(diào)節(jié)與NP 相關(guān)的生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)靶器官睪丸和疼痛相關(guān)腦區(qū)BST 功能，更有利于NP 的改善。調(diào)節(jié)DRG 和SDH 以及生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)睪丸和BST 腦區(qū)中促進(jìn)腺苷生成的上游酶CD73 或下游受體A1R 參與了孕酮治療NP的過程。鑒于NP 調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜，更深入的調(diào)節(jié)機(jī)制以及與這些組織和器官中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)、對腺苷其他亞型受體或其他類型受體和胞內(nèi)信號的作用等，還需進(jìn)行更多研究。本研究為今后探索治療NP 的新方法提供了理論依據(jù)。