基于16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)分析安格斯牛瘤胃微生物多樣性和功能預(yù)測(cè)的研究

吳 瓊, 王思珍*, 張 適, 尤 歡, 胡宗福, 牛化欣*

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.通遼市家畜繁育指導(dǎo)站，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)具有豐富的和復(fù)雜的微生物群體，其微生物群落不僅受到日糧、遺傳種類(lèi)、生長(zhǎng)發(fā)育階段、生存環(huán)境等方面的影響，還與宿主的消化吸收、營(yíng)養(yǎng)代謝、生長(zhǎng)性能、免疫功能和宿主的健康狀況息息相關(guān)，認(rèn)知瘤胃微生物數(shù)量和組成對(duì)建立宿主功能具有重要作用[1-5]。然而，瘤胃是一個(gè)嚴(yán)格厭氧的環(huán)境，在種類(lèi)繁多、數(shù)量巨大的瘤胃微生物中絕大多數(shù)是不可培養(yǎng)的，利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)和常規(guī)的克隆-測(cè)序分子生物等方法來(lái)探索瘤胃微生物多樣性及分析其功能是很難實(shí)現(xiàn)的，因此，闡明和揭示反芻動(dòng)物瘤胃微生物基因資源的研究受到技術(shù)和方法的限制[6-7]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和在不同研究方向的廣泛應(yīng)用，宏基因組學(xué)科通過(guò)高通量測(cè)序的方法可全面探索微生物多樣性和系統(tǒng)發(fā)生，揭示代謝通路和功能分析的研究[8-10]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有許多應(yīng)用宏基因組學(xué)方法研究牛瘤胃微生物的報(bào)道，Jami等[11]對(duì)1日齡至2.5年齡段牛瘤胃細(xì)菌群落變化研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，出生后隨著年齡的增長(zhǎng)需氧和兼性厭氧菌減少，厭氧菌增多。De等[12]利用16S rRNA-焦磷酸測(cè)序方法分析了巴西食用牛(Nelore steer)消化道不同部位微生物多樣性的變化。周熊艷等[13]研究了云南大額牛瘤胃微生物多樣性。張慧敏等[14]利用宏基因組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)探討了海子水牛瘤胃內(nèi)的微生物組成及木質(zhì)纖維素降解酶系。以上報(bào)道主要研究了不同牛瘤胃微生物的菌落組成，但對(duì)其功能特征分析還處于探索階段[15]。安格斯牛(Angus)原產(chǎn)于蘇格蘭北部的阿伯丁和安格斯等地區(qū)，具有良好的肉用性能，養(yǎng)殖范圍分布廣，是世界上專(zhuān)門(mén)化肉牛品種中的典型品種之一[16-17]。近年來(lái)，我國(guó)不同地區(qū)也從不同國(guó)家引進(jìn)多批次的安格斯牛，對(duì)其遺傳性能、生長(zhǎng)性能、肉質(zhì)肉品等指標(biāo)進(jìn)行研究。然而，對(duì)安格斯牛瘤胃微生物多樣性及其功能分析的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究利用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)安格斯牛瘤胃微生物多樣性及其功能進(jìn)行研究和分析，為探索安格斯牛瘤胃生境微生物提供基礎(chǔ)，也為瘤胃微生物功能的探索和進(jìn)一步挖掘與某些重要營(yíng)養(yǎng)生理功能密切相關(guān)的瘤胃微生物功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)牛取自內(nèi)蒙古通遼谷潤(rùn)肉業(yè)有限公司，選取6頭22月齡左右的安格斯牛，分2組為an1和an2，平均體重550 kg。實(shí)驗(yàn)牛進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)與管理，每天飼喂2次，自由采食，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1[18]。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干基)

屠宰后立刻采集瘤胃液樣品，經(jīng)4層滅菌紗布過(guò)濾后放入50 mL凍存管中，按照1∶ 1∶ 1的比例將每組的瘤胃液混合均勻，迅速置于液氮中，-80 ℃保存，備用。

1.2 方法

1.2.1 瘤胃細(xì)菌DNA的提取、16S rRNA基因擴(kuò)增及測(cè)序 按照FastDNA? SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals，Santa Ana，CA，美國(guó))試劑盒的使用說(shuō)明，抽提瘤胃液中的細(xì)菌基因組DNA。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)基因組DNA濃度及純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。使用細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)通用引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCA)及806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)[19]，在引物兩端設(shè)計(jì)12 bp的條形碼用于識(shí)別不同樣品序列，對(duì)以上提取的DNA進(jìn)行序列擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系參考胡宗福等[20]方法。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，使用NEB Next? UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs Inc., Ipswich,127 MA, 美國(guó))建立擴(kuò)增序列文庫(kù)，之后采用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)(Illumina Corporation，San Diego，美國(guó)) 進(jìn)行克隆文庫(kù)的高通量測(cè)序，測(cè)序公司為上海美吉生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司(上海，中國(guó))。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 序列拼接與質(zhì)控、操作分類(lèi)單元(OTU)聚類(lèi)及生物信息學(xué)在http://www.i-sanger.com/云平臺(tái)按胡宗福等[20]方法進(jìn)行操作和分析。

1.2.3 16S功能預(yù)測(cè)分析 為探討瘤胃微生物群落在其體內(nèi)發(fā)揮的功能，使用PICRUSt[21]方法對(duì)16S RNA擴(kuò)增子數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了宏基因組功能組成預(yù)測(cè)，該方法將高通量測(cè)序所得的16S RNA擴(kuò)增子數(shù)據(jù)庫(kù)與Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得OUT對(duì)應(yīng)物種的功能信息，并根據(jù)最新的Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)信息，對(duì)菌落做出功能組成的預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 安格斯牛樣本序列信息、序列過(guò)濾與質(zhì)控

通過(guò)序列拼接及質(zhì)控，2個(gè)測(cè)序樣本共獲得了108 378條有效序列，平均長(zhǎng)度441 bp，經(jīng)過(guò)優(yōu)化處理后，共得到86 298條優(yōu)化序列，這些優(yōu)化序列將用于后續(xù)的OTU聚類(lèi)及分類(lèi)學(xué)分析(表2)。

表2 樣本序列信息

2.2 微生物群落的Alpha多樣性分析

表3為兩組安格斯牛的Alpha多樣性指數(shù)。Alpha多樣性用來(lái)表示樣本內(nèi)微生物群落的多樣性，其中Chao、Ace指數(shù)反映菌群豐度，其值與菌群豐度正相關(guān)；而Simpson和Shannon指數(shù)反映菌群多樣性，Shannon值與菌群多樣性正相關(guān)，Simpson值與菌群多樣性負(fù)相關(guān)。結(jié)果表明，兩組牛菌群數(shù)量及組成相似，菌群豐度較大，多樣性指數(shù)也處于較高的水平。

表3 不同樣本的Alpha多樣性指數(shù)

2.3 基于門(mén)和屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)過(guò)序列相似性大于97%水平上的OTU聚類(lèi)，共獲得了346個(gè)OTU，隸屬于13個(gè)門(mén)，21個(gè)綱，24個(gè)目，40個(gè)科，123個(gè)屬。圖1A所示，豐度大于1%的門(mén)有擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，43.16%)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes，36.29%)、變形菌門(mén)(Proteobacteria，14.50%)、纖維桿菌門(mén)(Fibrobacteres，1.53%)、互養(yǎng)菌門(mén)(Synergistetes和其他1.86%)，前三者所占比例極大。在屬水平上，豐度大于1%的菌屬有16個(gè)，依次為普雷沃氏菌屬_7 (Prevotella_7，29.28%)、琥珀酸弧菌科_UCG-001 (Succinivibrionaceae_UCG-001，11.30%)、琥珀酸菌屬(Succiniclasticum，11.10%)、普雷沃氏菌屬_1 (Prevotella_1，6.65%)、瘤胃球菌屬_1(Ruminococcus_1，5.17%)、琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio，2.75%)、普雷沃氏菌科_UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001，2.45%)、羅氏菌屬(Roseburia，2.34%)。

圖1 基于門(mén)水平(A)和屬水平(B)瘤胃細(xì)菌多樣性Fig.1 Microbial community structure of Angus cattle rumen on the phylum(A) and genus level(B)

由圖2可以看出，擬桿菌門(mén)由進(jìn)化相近的普雷沃氏菌科等6種組成。相反，厚壁菌門(mén)所包含的科比較分散，由氨基酸球菌科、瘤胃球菌科、毛螺菌科、丹毒絲菌科、韋榮氏菌科等7種組成。變形菌門(mén)由兩個(gè)進(jìn)化相對(duì)較遠(yuǎn)的琥珀酸菌科和紅椿菌科組成，其中前者豐度占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。纖維桿菌門(mén)由兩個(gè)進(jìn)化較遠(yuǎn)的纖維桿菌科和未分級(jí)組成。

2.4 功能預(yù)測(cè)分析

2.4.1 COG 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果 基于PICRUSt分析平臺(tái)的16S功能預(yù)測(cè)將獲得的OTU豐度表與Greengene數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得相應(yīng)的COG及KO功能信息及其豐度。分析發(fā)現(xiàn)牛瘤胃菌群功能主要集中于氨基酸運(yùn)輸、代謝、通用功能預(yù)測(cè)、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝和細(xì)胞壁/膜/包膜生物合成等方面，由此可預(yù)測(cè)可能含有豐富的蛋白分解、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝酶相關(guān)基因，也含有大量的纖維素和木質(zhì)素降解酶基因(圖3)。

2.4.2 KEGG分析結(jié)果 圖4 KEGG一級(jí)和二級(jí)代謝通路顯示，基因依次富集在新陳代謝49%、遺傳信息處理22%、環(huán)境信息處理12%、細(xì)胞過(guò)程3%、人類(lèi)疾病0.8%、生物體系統(tǒng)0.7%，還有未分類(lèi)功能基因14%。二級(jí)代謝通路表明，基因主要富集在新陳代謝中氨基酸代謝10%和碳水化合物代謝10%，還有遺傳信息處理中的復(fù)制與修復(fù)10%、環(huán)境信息處理中膜轉(zhuǎn)運(yùn)10%。

圖2 基于科水平安格斯牛瘤胃微生物系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Microbial biological phylogenetic tree of Angus cattle rumen on the family level

圖3 COG 分類(lèi)Fig.3 COG classification

圖4 KEGG一級(jí)和二級(jí)代謝通路Fig.4 KEGG of category level 1 and 2

2.4.3 碳水化合物酶(CAZy)注釋 根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中氨基酸序列的相似性，將不同物種來(lái)源的碳水化合物活性酶分為糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases GHs)、糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycosyl Transferases，GTs)、多糖裂合酶(Polysaccharide Lyases，PLs)、碳水化合物酯酶(Carbohydrate Esterases，CEs) ，輔助氧化還原酶(Auxiliary Activities，AAs)，碳水化合物結(jié)合模塊(Carbohydrate-Binding Modules CBMs)等6大類(lèi)蛋白質(zhì)家族。圖5顯示預(yù)測(cè)的功能基因GH所占比例最高，其他依次為GT、CBE、CE、AA和PL。

2.4.4 短鏈脂肪酸(SCAA)生成酶 參與牛瘤胃甲酸、乙酸、丙酸和丁酸短鏈脂肪酸生產(chǎn)的細(xì)菌酶COG編號(hào)和基因豐度由見(jiàn)圖6，產(chǎn)乙酸相關(guān)酶基因豐度最高，為33%(3種)，其他依次為丁酸32%(4種)、丙酸23%(3種)和甲酸12%(1種)。

圖5 CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果Fig.5 Distribution of CAZyme encoding genes

圖6 短鏈脂肪酸生成酶COGFig.6 Enzymes of short-chain fatty acid production COG 圖由內(nèi)向外依次為第1環(huán)至第4環(huán)，第3環(huán)表示COG編號(hào)和基因豐度，第4環(huán)表示SCAA生成的相關(guān)酶類(lèi) From inside to outside, theFigure shows the first ring to the fourth ring, the third ring represents the COG number and gene abundance, and the fourth ring represents the enzymes related to SCAA production

3 討 論

3.1 安格斯牛瘤胃菌群多樣性

本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)安格斯牛瘤胃液菌群結(jié)構(gòu)及組成進(jìn)行檢測(cè)，并基于原核16S rDNA高通量測(cè)序結(jié)果對(duì)菌群功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。安格斯牛瘤胃菌群基于門(mén)水平，優(yōu)勢(shì)菌群主要包括擬桿菌門(mén)(43.16%)、厚壁菌門(mén)(36.29%)和變形菌門(mén)(14.50%)，與周熊艷等[13]研究的大額牛瘤胃優(yōu)勢(shì)菌群(擬桿菌門(mén)48%、厚壁菌門(mén)42%和變形菌門(mén)3%)組成有類(lèi)似的結(jié)果。De等[12]利用16S rRNA-焦磷酸測(cè)序分析巴西食用牛消化道不同部位微生物多樣性的變化。結(jié)果顯示，在所有的樣本中，與厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)有關(guān)的序列占優(yōu)勢(shì)，這與本研究有類(lèi)似的結(jié)果。張慧敏等[14]分析的海子牛瘤胃的優(yōu)勢(shì)菌群為擬桿菌門(mén)占比55.3%，但厚壁菌門(mén)較安格斯牛和大額牛所占比例要少。其原因主要是受到遺傳種類(lèi)方面的影響。安格斯牛瘤胃優(yōu)勢(shì)菌群與諸多研究[22-23]反芻動(dòng)物瘤胃中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)的結(jié)果一致。根據(jù)科和屬水平分類(lèi)，安格斯牛瘤胃中隸屬于擬桿菌門(mén)的普雷沃氏菌屬(35.93%)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，還含有2.45%的普雷沃氏菌科_UCG-001(未分到屬水平)，可降解非纖維素植物多糖如木聚糖，在果膠的利用和蛋白質(zhì)的降解等方面發(fā)揮著重要的作用[24-25]。隸屬于厚壁菌門(mén)、氨基酸球菌科的琥珀酸菌屬占比11.10%，毛螺菌科的瘤胃球菌屬占比5.17%。研究表明，以上菌群被認(rèn)為是瘤胃中降解木質(zhì)纖維素的主要微生物，可產(chǎn)出大量的纖維素酶[26-27]。另外，隸屬于變形菌門(mén)的琥珀酸弧菌科_UCG-001占比11.30%，琥珀酸弧菌屬占比2.75%。安格斯牛瘤胃細(xì)菌中占比最大的門(mén)為擬桿菌門(mén)、最大的科為普雷沃氏菌科、最大的屬為普雷沃氏菌屬。

3.2 安格斯牛瘤胃菌群功能預(yù)測(cè)

瘤胃微生物菌群是微生物共生聯(lián)合體，它既是反芻動(dòng)物中重要的蛋白質(zhì)來(lái)源，也是反芻動(dòng)物通過(guò)纖維發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的主要能量來(lái)源，因此瘤胃細(xì)菌是龐大的生物資源庫(kù)，積極挖掘一些與重要營(yíng)養(yǎng)生理功能密切相關(guān)的瘤胃菌群功能基因是非常重要的，如碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、氨基酸運(yùn)輸和代謝、VFA的生成等[9，28]。Jami等[11]對(duì)1日齡至2.5年齡段牛瘤胃細(xì)菌群落變化研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，出生后隨著年齡的增長(zhǎng)需氧和兼性厭氧菌減少，厭氧菌增多。本研究未做厭氧菌的分析，但對(duì)安格斯牛瘤胃細(xì)菌測(cè)序數(shù)據(jù)與COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，功能集中在氨基酸運(yùn)輸及代謝、通用功能預(yù)測(cè)、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、細(xì)胞壁/膜/包膜生物合成等方面，這與印度水牛[29]、海子水牛[14]的報(bào)道和中國(guó)西門(mén)塔爾牛[30]有些差異，后三者瘤胃菌群功能集中在碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝的基因最多，而本研究中安格斯牛瘤胃菌群功能集中在氨基酸運(yùn)輸及代謝的基因最多，造成此差異的原因可能是宿主、日糧、養(yǎng)殖環(huán)境等多方面的因素。

Pitta等[31]基于16S rRNA測(cè)序技術(shù)，報(bào)道了為肉牛投喂低蛋白質(zhì)高纖維的牧草能夠轉(zhuǎn)換高蛋白質(zhì)高可溶性營(yíng)養(yǎng)物的冬小麥時(shí)，普雷沃氏菌的比例由28%上升到56%，是瘤胃中比例最高的菌屬，其與蛋白降解有關(guān)，與本研究結(jié)果類(lèi)似，因此所預(yù)測(cè)功能也集中在與高蛋白日糧有關(guān)的氨基酸運(yùn)輸及代謝上。 KEGG一級(jí)代謝通路分析顯示，基因最主要富集在新陳代謝上；二級(jí)代謝通路表明，基因主要富集在新陳代謝中氨基酸代謝和碳水化合物代謝上，這與本研究COG數(shù)據(jù)庫(kù)所預(yù)測(cè)的氨基酸運(yùn)輸和代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝功能一致。

經(jīng)過(guò)KEGG代謝酶與CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，本研究GH基因數(shù)量最多，GT次之，與海子水牛[14]、澤西奶牛[32]利用宏基因組預(yù)測(cè)的CAZy一致。瘤胃細(xì)菌可分泌半纖維素酶、淀粉酶、木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、葡糖苷酶和木聚糖乙酰酯酶等，構(gòu)成復(fù)雜的瘤胃內(nèi)纖維降解體系，能高效降解植物細(xì)胞壁中的纖維素和半纖維素，產(chǎn)生的乙酸、丙酸和丁酸等可為反芻動(dòng)物機(jī)體提供能量[33]。碳原子數(shù)為1～6的有機(jī)脂肪酸稱(chēng)為SCFA，反芻動(dòng)物短鏈脂肪酸(SCFA)，也稱(chēng)揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，主要有瘤胃菌群所產(chǎn)生的SCFA生成酶發(fā)酵碳水化合物的最終產(chǎn)物，包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸，其中乙酸、丙酸和丁酸含量最高，是瘤胃內(nèi)最重要的揮發(fā)性脂肪酸，約占SCFA的90%以上[34]，為機(jī)體提供所需能量的60%～80%[35]。本研究安格斯牛在精養(yǎng)工廠化攝飼精料育肥條件下，產(chǎn)乙酸相關(guān)酶基因豐度最高，依次為丁酸、丙酸。Deusch等[32]研究表明，分泌產(chǎn)SCFA生成酶的瘤胃菌群分別為厚壁菌門(mén)中毛螺菌科、瘤胃球菌科、韋榮氏菌科等，其產(chǎn)物為丁酸；擬桿菌門(mén)中普雷沃氏菌科_15和厚壁菌門(mén)中韋榮氏菌科，其產(chǎn)物為丙酸；擬桿菌門(mén)中普雷沃氏菌科_9其產(chǎn)物為乙酸；厚壁菌門(mén)中毛螺菌科和變形菌門(mén)中琥珀酸弧菌科，其產(chǎn)物為甲酸。這與本研究檢測(cè)到的菌群的種類(lèi)和豐度類(lèi)似。瘤胃菌群、內(nèi)容物組成(攝食日糧組成)與瘤胃SCFA的生成有著非常密切的關(guān)系[36-37]，因此，通過(guò)調(diào)控瘤胃菌群和攝食日糧組成是反芻動(dòng)物合理和高效利用SCFA的重要途徑之一。

安格斯牛瘤胃液通過(guò)Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)共獲得86 298條高質(zhì)量?jī)?yōu)質(zhì)序列，經(jīng)分類(lèi)學(xué)鑒定分屬13個(gè)門(mén)，21個(gè)綱，24個(gè)目，40個(gè)科，123個(gè)屬，擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群門(mén)，基于屬的組成依次為普雷沃氏菌屬_7、琥珀酸弧菌科_UCG-001、琥珀酸菌屬、普雷沃氏菌屬_1、瘤胃球菌屬_1、琥珀酸弧菌屬等。16S功能預(yù)測(cè)和COG、KEGG代謝通路、CAZymes注釋數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，功能集中在氨基酸運(yùn)輸和代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝的相關(guān)基因上，說(shuō)明可能含有豐富的蛋白分解、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝酶相關(guān)基因和大量的纖維素、木質(zhì)素降解酶基因。產(chǎn)乙酸和丁酸相關(guān)酶基因豐度較高。