生物樣品中有機(jī)酸的離子排斥色譜測定方法進(jìn)展

賈鵬禹，孫蕊，李良玉，周行，韓毅強(qiáng)，馮乃杰

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

生物樣品是指動物、植物、微生物或其他相關(guān)領(lǐng)域研究中采集的動物體液和排泄物、植物組織和細(xì)胞、微生物培養(yǎng)液和發(fā)酵液等測試樣品，具有基體復(fù)雜多樣、水相背景等特點，常見的生物樣品來源主要有動物生理體液、腸道內(nèi)容物、微生物發(fā)酵品、釀造食品、青貯飼料和果汁等[1-4]。有機(jī)酸是一類含有羧酸基團(tuán)的有機(jī)化合物，在生物樣品中或來源于微生物代謝產(chǎn)物或來源于動植物自身生理代謝產(chǎn)物，是相關(guān)研究中重要的考察指標(biāo)[5-6]，例如通過檢測瘤胃液中乳酸及短鏈脂肪酸的含量考察反芻動物的生理變化，通過檢測青貯飼料中各有機(jī)酸含量監(jiān)測青貯發(fā)酵品質(zhì)等。生物樣品中有機(jī)酸的檢測工作因各種樣品復(fù)雜的背景干擾不斷受到挑戰(zhàn)，分析人員不但需要針對實際情況制定樣品前處理和儀器測試方法策略，而且要兼顧樣品前處理與儀器檢測方法的銜接工作。近年來，生物樣品中有機(jī)酸的檢測需求逐年擴(kuò)大，研究人員在相關(guān)指標(biāo)測試中亟待快速建立有效的檢測方法，隨著分離分析技術(shù)的進(jìn)步，離子排斥色譜法逐漸成為分析有機(jī)酸的簡捷有效方法?，F(xiàn)對離子排斥色譜法分析有機(jī)酸的分離機(jī)制、方法的組成要素、方法的建立與優(yōu)化和方法應(yīng)用中的常見問題等加以綜述。

1 有機(jī)酸的檢測方法

有機(jī)酸的檢測方法主要有氣相色譜法、反相高效液相色譜法和離子色譜法等[7-11]。氣相色譜法主要用于具有揮發(fā)性，熱穩(wěn)定性的有機(jī)酸化合物的檢測，如短鏈脂肪酸的分析，對揮發(fā)性差的化合物不能直接測定，一般需要對其進(jìn)行衍生化處理，此外在樣品前處理時要避免生物樣品中水對色譜柱使用壽命的影響，因此在一定程度上限制了氣相色譜方法的應(yīng)用范圍。反相高效液相色譜結(jié)合紫外—可見檢測器可用于多數(shù)有機(jī)酸化合物的分析，但對多目標(biāo)化合物分離選擇性的色譜優(yōu)化工作相對復(fù)雜，需要精確調(diào)控流動相組成，方法可移植性不強(qiáng)[12-13]。此外在以C18 為主的反相高效液相色譜方法應(yīng)用中，弱保留目標(biāo)組分常受到樣品基體中非目標(biāo)組分的共流出干擾，使得在弱保留區(qū)目標(biāo)組分的色譜峰信號失常，導(dǎo)致目標(biāo)組分無法準(zhǔn)確定量。離子色譜是分離有機(jī)酸的良好方法，適用于生物樣品中有機(jī)酸的分析，該方法設(shè)備依賴性強(qiáng)，方法不易普及[11]。近年來逐漸得到廣泛應(yīng)用的離子排斥色譜是一種新穎、經(jīng)濟(jì)適用且分離選擇性好的有機(jī)酸檢測方法，其獨特的分離機(jī)制使得方法在簡單的儀器配置上即可實現(xiàn)多個目標(biāo)化合物的高效分離，非常適合生物樣品中有機(jī)酸化合物的檢測[14-17]。課題組在有機(jī)酸的離子排斥色譜檢測方面進(jìn)行了多年的技術(shù)應(yīng)用，針對反芻動物瘤胃液、實驗動物糞便、微生物發(fā)酵液、青貯飼料及果汁等生物樣品所建立的檢測方法取得了良好的應(yīng)用效果[14，17]。

2 離子排斥色譜的分離機(jī)制

離子排斥色譜一般采用表面鍵合磺酸基團(tuán)的不同交聯(lián)度聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物微粒（PS/DVB- SO3H）作為分離介質(zhì)（色譜填料），鍵合相一端裸露的磺酸氫質(zhì)子是產(chǎn)生分離選擇性的主要官能結(jié)構(gòu)。離子排斥色譜的分離機(jī)制廣泛被認(rèn)為是Donnan排斥理論[14，18]，此外還可能包含空間排斥、吸附和配位體交換等機(jī)理，多種作用模式使分離介質(zhì)具備良好的有機(jī)酸分離能力。由于分離介質(zhì)表面存在大量質(zhì)子，在Donnan 排斥過程中，分離介質(zhì)與化合物間被假定存在一層Donnan 膜，強(qiáng)酸電解質(zhì)向填料滲透時被膜排斥，而弱酸電解質(zhì)可穿透膜進(jìn)入填料，因此產(chǎn)生了色譜保留。在色譜分離過程中，一元羧酸的分離主要受Donnan 排斥和吸附作用，二元、多元羧酸的分離同時還受到空間排斥作用，上述作用使得不同性質(zhì)的小分子有機(jī)酸和大分子有機(jī)酸得到了良好的分離。相比反相液相色譜而言，上述離子排斥色譜的分離機(jī)制充分體現(xiàn)了其對強(qiáng)弱電解質(zhì)組分的分離選擇能力，在實際應(yīng)用中，樣品基體中的強(qiáng)電解質(zhì)干擾物在離子排斥色譜柱上被優(yōu)先洗脫，同時對弱保留目標(biāo)組分幾乎不產(chǎn)生干擾，加強(qiáng)了對目標(biāo)組分的定性定量能力，這種特殊的分離選擇性在反相色譜柱上是很難實現(xiàn)的。離子排斥色譜的有機(jī)酸檢測適用范圍較廣，幾乎涵蓋了生物樣品中常見的有機(jī)酸化合物，常見有機(jī)酸化合物在美國Sepax 公司生產(chǎn)的Carbomix H 型色譜柱上的保留情況見表1。不同型號色譜柱對多種有機(jī)酸化合物均具有較好的分離選擇性，這與其獨特的分離機(jī)制密切相關(guān)，此外色譜條件只采用濃度極低的稀酸溶液作為等度洗脫的流動相，因此采用離子排斥色譜進(jìn)行有機(jī)酸的檢測具有經(jīng)濟(jì)、綠色環(huán)保、普適、簡便等特點。

3 離子排斥色譜法的組成要素

3.1 色譜柱

在分析方法建立前，色譜柱的選擇至關(guān)重要。目前市售的離子排斥色譜柱有多種品牌可供選擇，見表2，與反相高效液相的硅膠基質(zhì)色譜柱不同，離子排斥色譜柱尺寸多為300×7.8 mm ID 大尺寸色譜柱，這與采用聚合物為色譜填料有關(guān)。由于采用了相似的色譜柱填料類型，各品牌色譜柱對有機(jī)酸化合物的分離具有相似的分離選擇性，化合物出峰順序大致相同略同，所使用的流動相類型略有不同[15]，此外相同化合物的保留時間也存在差異。在選定品牌后，填料粒徑和交聯(lián)度是兩個重要的選擇參數(shù)，要結(jié)合樣品類型和目標(biāo)化合物的性質(zhì)進(jìn)行選擇，一般若同時分離多個目標(biāo)化合物時，宜選擇粒徑小的填料，可以帶來更高的分離柱效，對大多數(shù)化合物實現(xiàn)基線分離。若化合物中含有大分子化合物，宜選擇交聯(lián)度低的填料，容易對大分子目標(biāo)物產(chǎn)生體積排阻效應(yīng)，從而使分離效果更佳。需要注意的是，交聯(lián)度低的填料剛性較差，容易受到流動相沖擊發(fā)生柱頭填料塌陷現(xiàn)象。分析小分子化合物一般應(yīng)選擇剛性適中的8%交聯(lián)度色譜柱[14]。

3.2 儀器配置

離子排斥色譜分析方法一般采用簡單的儀器配置，只需要等度色譜泵系統(tǒng)、溫度可控的色譜柱箱和紫外—可見檢測器或示差折光檢測器，比早前采用抑制型電導(dǎo)檢測方法所需的儀器配置更為簡單易用[19]，因此檢測方法的建立在絕大多數(shù)儀器分析室即可快速實現(xiàn)。在不同檢測器配置下的方法學(xué)應(yīng)用中，紫外—可見檢測下的相同濃度的目標(biāo)組分峰面積或信號響應(yīng)強(qiáng)度存在較大差異，原因可能在于不同目標(biāo)組分的紫外—可見摩爾吸光系數(shù)不同[14，16]，而采用示差折光檢測器下的同類化合物組分信號響應(yīng)強(qiáng)度差異相對較小。在檢測靈敏度方面，示差折光檢測器受固有因素影響較紫外—可見檢測器還存在不足，因此在方法建立時要根據(jù)定量需求選擇不同的儀器配置，或根據(jù)實驗室已有的條件選擇不同的定量方法，一般紫外檢測器選擇外標(biāo)法，示差折光檢測器選擇內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法。此外，由于紫外檢測器較示差折光檢測器在某些有機(jī)酸組分上的靈敏度高，針對微量組分檢測時，宜選用紫外檢測器。

集中技訓(xùn)從大一下學(xué)期陸續(xù)開展，每學(xué)期不超過一次，具體時間安排結(jié)合各學(xué)院專業(yè)課程要求進(jìn)行。實施中，每學(xué)期固定兩個教學(xué)周停開其他課程單獨進(jìn)行集中技訓(xùn)教學(xué)。采用“帶教帶學(xué)”模式進(jìn)行授課，教師“帶教”，班級輔導(dǎo)員督促“帶學(xué)”。通過近幾年的實施，學(xué)校教務(wù)處及學(xué)院各專業(yè)有效的整合了教學(xué)資源，教學(xué)實踐潛力得到挖掘，目前各專業(yè)都不同程度取得了成績，運行狀況良好。

表1 Carbomix H 型色譜柱上不同有機(jī)酸保留時間Table 1 Retention time of different organic acids on carbomix H columns

表2 常見商用色譜柱Table 2 Common commercial chromatographic columns

4 離子排斥色譜法的方法建立及優(yōu)化

4.1 色譜柱安裝與儀器的啟動

由于采用合成聚合物的離子排斥色譜填料交聯(lián)度較低，類似軟凝膠，在高流速下會產(chǎn)生高柱壓，因此離子排斥色譜方法常在低流速下使用。盡管低流速會增加分析的時間，但這將有助于提高色譜柱的柱效。若有特殊研究需要，低的操作流速還允許將兩根色譜柱串聯(lián)起來，用于解決復(fù)雜樣品中的目標(biāo)組分的分析。在常規(guī)分析中，流速的設(shè)定要充分考慮填料交聯(lián)度、色譜柱溫度和色譜柱尺寸之間的關(guān)系，以獲得最佳的分離效果和分析效率。

4.2 樣品的前處理

在檢測過程中，系統(tǒng)壓力異常是常見的故障現(xiàn)象，易導(dǎo)致色譜出峰重現(xiàn)性變差。壓力異常主要體現(xiàn)在三個方面：一是系統(tǒng)無壓力，表現(xiàn)為泵正常工作而系統(tǒng)壓力為零，其原因主要在于泵輸液系統(tǒng)嚴(yán)重泄漏或輸液系統(tǒng)單向閥故障，應(yīng)檢查系統(tǒng)是否存在漏點或清洗單向閥件。二是系統(tǒng)壓力波動，表現(xiàn)為壓力忽高忽低，其原因可能在于輸液系統(tǒng)流動相初級過濾頭或單向閥污染，應(yīng)檢查輸液系統(tǒng)流動相過濾頭或單向閥件是否存在臟污。三是系統(tǒng)壓力過高，表現(xiàn)為系統(tǒng)高壓運行甚至報警停泵，除需逐段檢查輸液管線是否堵塞外，還應(yīng)著重檢查色譜柱頭篩板或色譜填料的堵塞，篩板臟污堵塞可采用超聲清除或反沖色譜柱，填料堵塞若修補未能達(dá)到檢測要求時需要更換色譜柱[28]。

4.3 流動相的優(yōu)化

（1）觸摸法：用手摸，粗的是 N a2CO3，細(xì)的是N aH CO3（N a2CO3為白色粉末或細(xì)粒， N aH CO3為白色細(xì)小晶體）；

豬丹毒病原是豬丹毒桿菌，為一種革蘭氏陽性的纖細(xì)小桿菌，在自然界分布甚廣。該菌屬有2個種，即紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌。紅斑丹毒絲菌俗稱豬丹毒桿菌，有血清型la、1b、2、4、5、6、8、11、12、15、16、17、19、21和N；扁桃體丹毒絲菌有血清型3、7、10、14、20和23；其他2個丹毒絲菌屬血清型分別為13和18[3]。豬丹毒桿菌是一種兼性厭氧菌，細(xì)長，不運動，無芽孢，無鞭毛。目前，已發(fā)現(xiàn)的豬丹毒桿菌主要為1型(1a和1b)和2型。

4.4 色譜柱溫度的優(yōu)化

在樣品檢測完畢后，一般用10～20 倍柱體積的保存溶劑沖洗色譜柱，沖洗結(jié)束后，先將流速設(shè)定為0.10 mL·min-1并關(guān)閉柱溫箱，待柱溫降低至40 ℃以下后，方可取下色譜柱，色譜柱長期不用時，色譜柱需注入2.5～4.0 mmol·L-1的硫酸溶液，存于陰涼處并禁止低溫凍結(jié)。為了防止柱床干涸，柱兩端堵頭需旋緊。此外色譜系統(tǒng)管路中的酸液應(yīng)及時沖洗更換，避免儀器系統(tǒng)受到強(qiáng)酸或含鹵素化合物的腐蝕[27]。

4.5 流動相流速的優(yōu)化

由于離子排斥色譜柱所用聚合物基質(zhì)相比硅膠基質(zhì)剛性較差，可承受的色譜柱壓較低，因此色譜儀器的啟動要遵照“起步低，進(jìn)階緩”的原則。將色譜柱接入色譜儀器系統(tǒng)前，首先旋去兩端的堵頭，按色譜柱標(biāo)記方向與流動相流動的方向保持一致將色譜柱接入管線。一般新的離子排斥色譜柱采用稀酸溶液進(jìn)行封裝，在長期儲存和運輸過程中，柱填料兩端可能會干涸，應(yīng)參照說明書使用10～20 倍柱體積的保存溶劑進(jìn)行沖洗以活化色譜柱。系統(tǒng)啟動時，先以0.10 mL·min-1流速啟動恒流泵，開啟柱溫箱并設(shè)置到工作溫度，待色譜柱溫度升高并穩(wěn)定30 min 后，以0.10 mL·min-1為步長，以3 min 為時間間隔緩慢升高流速至所需色譜條件。需要注意的是，色譜柱安裝前一定要用方法所用的流動相充分置換儀器管路中的舊溶液，特別是有機(jī)溶劑，否則易導(dǎo)致有機(jī)溶劑進(jìn)入色譜柱溶解填料損壞色譜柱。

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5 方法應(yīng)用中的常見問題

5.1 色譜柱使用后的保養(yǎng)

離子排斥色譜運行溫度較常見的反相高效液相色譜模式運行溫度高，且溫度對離子排斥色譜柱的組分保留時間和分離效率有顯著影響[24，25]。對大多數(shù)應(yīng)用而言，在相同的化合物、填料類型和流動相條件下，隨著柱溫的升高保留時間將會縮短，柱效將會提高，同時柱壓會隨之降低。升高溫度可減少固定相中慢傳質(zhì)過程所引起的譜帶展寬效應(yīng)，從而提高分離的效率。此外升高溫度還能減小流動相的粘度，使溶質(zhì)分子更容易地滲入樹脂內(nèi)部，從而獲得高的分辨率，但是在優(yōu)化條件時不宜超出最高溫度上限（如85 ℃）或低于下限（如30 ℃），溫度過高或過低都將可能對色譜柱造成損傷，其原因可能在于填料機(jī)械形態(tài)的不可逆轉(zhuǎn)變[26]。

5.2 系統(tǒng)壓力異常

樣品前處理不但關(guān)系目標(biāo)化合物的檢測靈敏度和回收率，而且關(guān)系色譜柱的使用壽命，因此是分析工作的重點。生物樣品一般為水基體樣品，并含有蛋白、碳水化合物、無機(jī)鹽和其他極性化合物等雜質(zhì)，其中水溶性碳水化合物和無機(jī)鹽對色譜柱及分離分析幾乎無不良影響。由于離子排斥色譜方法對有機(jī)酸分離具有極好的專屬性，在樣品前處理時，一般只考慮蛋白等大分子雜質(zhì)的去除[14，20-21]，因此樣品前處理過程十分簡便。蛋白去除的方法有有機(jī)溶劑法、等電點法等，先前的研究發(fā)現(xiàn)，采用有機(jī)溶劑如乙腈等雖能有效去除樣品中蛋白，但有機(jī)溶劑在上機(jī)樣品中的殘留或?qū)δ繕?biāo)物分離產(chǎn)生強(qiáng)烈干擾，或?qū)ιV填料產(chǎn)生不可逆的損害，因此不適用于方法的建立[14]。實踐證明，與離子排斥色譜相匹配的蛋白脫除方法主要為等電點法，即利用強(qiáng)酸去除樣品中的蛋白雜質(zhì)，主要試劑有偏磷酸、高氯酸、5-磺基水楊酸等，過量的強(qiáng)酸在色譜分離過程中受Donnan 排斥作用最先被洗脫出來，不對目標(biāo)組分產(chǎn)生干擾，因此實現(xiàn)了樣品前處理和儀器方法的良好銜接。在蛋白沉淀后一般選用萬轉(zhuǎn)以上離心轉(zhuǎn)速澄清溶液，上清液上機(jī)前要選用0.22 或0.45 μm 濾膜進(jìn)行過濾。

簡單的洗脫劑組成和等度洗脫方式是離子排斥色譜的主要特點[18-23]。一般建議流動相為稀酸溶液（如2.5 mmol·L-1H2SO4、0.1% H3PO4或3 mmol·L-1HClO4），色譜柱適用的pH 范圍為1～3，流動相氫離子的供體主要有苯磺酸、高氯酸、硫酸和磷酸等，在選擇酸類型時要充分考慮所用試劑的經(jīng)濟(jì)性和安全性及色譜泵系統(tǒng)的耐受性。在某些特殊情況下，流動相中添加有機(jī)溶劑如乙腈等能夠改善化合物的分離度[14，17]，但流動相中有機(jī)改性劑的含量不應(yīng)高于10%（v/v），防止有機(jī)相滲入色譜填料使其過分溶脹從而改變填料的性能，有機(jī)改性劑不推薦使用甲醇、四氫呋喃等對聚合物產(chǎn)生損害的溶劑。

5.3 無峰或倒峰

在檢測過程中，出現(xiàn)無峰或倒峰現(xiàn)象主要集中在檢測器工作異常方面，一般無峰原因可能在于檢測器信號接收線路出現(xiàn)斷點，應(yīng)檢查通訊線路是否穩(wěn)固。倒峰現(xiàn)象原因可能在于通信信號線正負(fù)極接反或檢測器極性設(shè)置錯誤。對于示差折光檢測器，倒峰原因還可能在于參比池和測量池的管路連接存在問題，或參比池的清洗及零點玻璃的校正存在問題[29]。

5.4 峰型異常

峰型異常主要表現(xiàn)為拖尾、前伸以及峰底過分展寬。主要原因可能在于色譜柱前后管路死體積過大、流動相類型或濃度與目標(biāo)組分不匹配、色譜柱未充分預(yù)熱或流動相泄漏等[30]。要檢查輸液管線長度是否過長，管線接頭與色譜柱是否匹配并是否插緊，盡量使用熱傳導(dǎo)良好的金屬管線，以保證流動相在進(jìn)入色譜柱前充分預(yù)熱。

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5.5 色譜峰裂分

色譜峰裂分是聚合物基質(zhì)色譜柱常見的故障之一，特別是在基體復(fù)雜的生物樣品檢測時，樣品中的大分子雜質(zhì)如殘存蛋白不易洗脫，造成柱頭篩板堵塞、柱頭填料污染和柱頭填料塌陷等問題，使得各組分在柱內(nèi)傳質(zhì)過程中出現(xiàn)遲滯和渦流，導(dǎo)致同一組分色譜峰發(fā)生裂分影響組分定量[30]。主要解決辦法是清除堵在色譜柱入口端的臟污，一般需要將色譜柱反接進(jìn)行沖洗，在色譜柱反接沖洗時，色譜柱出口不接檢測器，防止發(fā)生二次污染。沖洗流速一般采用0.20 mL·min-1，沖洗12 h 以上。

6 總結(jié)及展望

綜述了離子排斥色譜在生物樣品有機(jī)酸檢測方面的研究進(jìn)展。離子排斥色譜方法樣品前處理簡便，重現(xiàn)性好，所用試劑安全且價格低廉，所用儀器配置簡單，采用10 萬元儀器配置即可滿足多數(shù)有機(jī)酸化合物的檢測，方法應(yīng)用廣泛，是一種新穎、實用、可靠的檢測手段[31]。盡管上述方法體現(xiàn)出了較好的優(yōu)越性，但不難發(fā)現(xiàn)，該方法的應(yīng)用還僅集中在在常量或微量有機(jī)酸分析方面，由于受系統(tǒng)自身靈敏度限制，針對樣品中痕量或亞微量有機(jī)酸的檢測，或針對微小或珍貴樣品中有機(jī)酸的檢測，例如細(xì)胞檢測等，方法還存在應(yīng)用局限，需要借助其他更為先進(jìn)的手段[32-34]。未來幾年中，生物樣品中有機(jī)酸的高靈敏度及高通量檢測技術(shù)將成為新的發(fā)展趨勢，可能將通過改善分離通道或與質(zhì)譜兼容實現(xiàn)上述目標(biāo)。