基于地衣芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)搭建左旋多巴新合成體系

李樂云，李由然，許銀彪，張梁，顧正華，丁重陽(yáng)，石貴陽(yáng)*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

左旋多巴(3,4-dihydroxylphenylalanine，L-DOPA)是一種人體內(nèi)L-酪氨酸(L-tyrosine, Tyr)的氨基酸類似物，是多巴胺、黑色素、生物堿等許多物質(zhì)的前體，是治療帕金森病的特效藥[1-3]。目前合成L-DOPA的方法主要有化學(xué)合成法[4]、植物提取法[5]和酶催化法[6-7]?；瘜W(xué)合成法多以香草醛和乙內(nèi)酰脲為原料，經(jīng)過8步反應(yīng)得到L-DOPA[4]，過程復(fù)雜且對(duì)應(yīng)選擇性低，不符合綠色生產(chǎn)的發(fā)展趨勢(shì)。植物提取法的主要原材料是貓豆[5]，但是其中L-DOPA含量最高僅有9%，原料來源限制難以滿足市場(chǎng)需求。酶催化法是一種環(huán)境友好、簡(jiǎn)便高效的新型合成途徑，受到越來越多的關(guān)注[7]。

目前用于催化合成L-DOPA的酶主要有4種：酪氨酸酚解酶[8-10]、4-羥基苯乙酸酯3-單加氧酶(4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase， 4HPA3H)[11]、酪氨酸酶[12]以及酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)[13-14]。酪氨酸酚解酶以鄰苯二酚、氨水以及丙酮酸為底物合成L-DOPA，其中鄰苯二酚是一種蛋白質(zhì)變性劑，可導(dǎo)致酪氨酸酚解酶發(fā)生不可逆失活[15-16]。4HPA3H、酪氨酸酶、酪氨酸羥化酶均以L-Tyr為底物催化合成L-DOPA。4HPA3H是一種由hpaB,hpaC基因編碼的雙組分酶，催化過程需要一種膜相關(guān)的細(xì)胞色素P450酶，而該酶很難在原核系統(tǒng)中功能表達(dá)[17]。酪氨酸酶具有單酚氧化酶和二酚氧化酶作用，前者將L-Tyr羥基化合成L-DOPA，后者可將L-DOPA氧化為多巴醌，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為黑色素，對(duì)L-DOPA產(chǎn)物得率有較大影響。TH是一種以四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin, BH4)和Fe2+為輔因子的單加氧酶，在L-Tyr的鄰位羥基化，不具有二酚氧化酶活性[18]，減少了L-DOPA的氧化，應(yīng)用前景較好。

目前關(guān)于TH的研究主要集中于昆蟲和哺乳動(dòng)物來源[19]，隨著基因數(shù)據(jù)庫(kù)以及基因合成技術(shù)的發(fā)展，酶基因挖掘更加快捷和可靠。通過篩選不同來源的TH基因，分析其保守序列及催化機(jī)制，對(duì)拓展酶催化法合成L-DOPA具有重要意義。其中篩選出穩(wěn)定高效的TH基因以及實(shí)現(xiàn)輔因子BH4的供給是L-DOPA合成中的主要限制因素。

Bacilluslicheniformis是一種重要的工業(yè)生產(chǎn)菌株，具有酶系豐富、產(chǎn)酶量高、耐熱、代謝改造可積累L-Tyr等諸多優(yōu)點(diǎn)[20]，同時(shí)也是一種食品安全級(jí)(generally recognized as safe, GRAS)菌株[21]。值得注意的是，地衣芽孢桿菌存在BH4前體物質(zhì)6-丙酮酰四氫蝶呤的合成途徑，僅需一步墨蝶呤還原酶催化即可獲得BH4，為基于B.licheniformis表達(dá)系統(tǒng)過表達(dá)TH合成L-DOPA奠定基礎(chǔ)(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)。作為GRAS工業(yè)菌株，B.licheniformis生產(chǎn)的L-DOPA具有更廣闊的應(yīng)用前景，目前尚未有利用B.licheniformis合成L-DOPA的報(bào)道。

本研究通過生物信息學(xué)方法基于動(dòng)物來源的TH基因保守序列分析，挖掘到StreptosporangiumroseumDSM 43021來源TH基因(srth)，利用B.licheniformis表達(dá)系統(tǒng)其進(jìn)行胞內(nèi)外的重組表達(dá)，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室保藏的墨蝶呤還原酶重組菌以L-Tyr為底物進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并對(duì)TH功能及催化過程進(jìn)行初步探究。構(gòu)建B.licheniformis的L-DOPA合成體系，為基于GRAS菌株酶催化法合成L-DOPA的工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 本研究所用的菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 主要試劑

限制性核酸內(nèi)切酶(NdeI,NheI,KpnI,SalI)、T4DNA連接酶，美國(guó)Thermo Fisher；2×TaqPCR Master Mix、2×PfuPCR Master Mix，杭州寶賽公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，康寧生命科學(xué)有限公司(上海)；卡那霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素，Sigma公司；L-Tyr、L-DOPA、BH4,生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉，英國(guó)OXOID公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基 (g/L): 蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，LB固體培養(yǎng)基另加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基I (g/L): 乳糖 30，蛋白胨12，酵母粉24，甘油 5，K2HPO4·3H2O 16.43，KH2PO42.3，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基II (g/L): 葡萄糖 30，蛋白胨FP321 20，酵母粉FM408 10，玉米漿干粉 5，K2HPO4·3H2O 9.12，KH2PO41.36，無水CaCl20.50，MgSO4·7H2O 0.50，(NH4)2HPO410。

發(fā)酵培養(yǎng)條件I：

種子培養(yǎng)：接1環(huán)平板活化后的單菌落至LB培養(yǎng)基，添加終濃度為30 μg/mL卡那霉素，37 ℃、250 r/min 搖床培養(yǎng)12～16 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液按照體積分?jǐn)?shù)3%接種量轉(zhuǎn)接至30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基I，加入終濃度為30 μg/mL卡那霉素，37 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵培養(yǎng)條件II：

種子培養(yǎng)：接1環(huán)平板活化后的單菌落至LB培養(yǎng)基，添加終濃度為20 μg/mL四環(huán)素，37 ℃、250 r/min 搖床培養(yǎng)12～16 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：按照體積分?jǐn)?shù)3%接種量將種子液轉(zhuǎn)接至30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基II，加入終濃度為20 μg/mL四環(huán)素，于37 ℃、250 r/min 搖床培養(yǎng)8～12 h至OD600為0.4～0.6，加入體積分?jǐn)?shù)1.5%D-山梨醇誘導(dǎo)，于28 ℃、250 r/min搖床誘導(dǎo)36 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氨基酸序列分析

依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Streptosporangiumroseum來源的TH氨基酸序列(登錄號(hào)：ACZ90985.1)，利用ExPASy ProtParam、ProtScale、Compute pI/Mw在線工具分析編碼蛋白分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、疏水性能、不穩(wěn)定指數(shù)等；進(jìn)一步在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得動(dòng)物來源及其他微生物來源的TH氨基酸序列，利用DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)和保守序列分析；最后利用MEGA 6.0 繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析同源性。

1.2.2 重組TH表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

依據(jù)B.licheniformis密碼子偏好性優(yōu)化合成srth，以合成的基因?yàn)槟０?，利用SnapGene軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物，第一對(duì)引物兩端引入酶切位點(diǎn)NdeI、NheI以及保護(hù)堿基，在后引物前端引入His標(biāo)簽；第二對(duì)引物兩端引入酶切位點(diǎn)KpnI、SalI以及保護(hù)堿基，2對(duì)引物序列及酶切位點(diǎn)見表2。利用合成的引物擴(kuò)增基因序列，擴(kuò)增的基因序列回收之后加A尾后，再連接至pMD19-T載體上，命名為pMD19-T-srth1、pMD19-T-srth2，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)JM109。測(cè)序正確后用NdeI和NheI同時(shí)酶切pMD19-T-srth1和pMA5載體，用KpnI和SalI同時(shí)酶切pMD19-T-srth2和pHY載體，酶切后回收目的片段SrTH1、線性化的pMA5、srth2和線性化的pHY。按照基因和載體摩爾質(zhì)量比3∶1的比例各配制連接體系10 μL，在16 ℃干式恒溫器中過夜連接。將連接產(chǎn)物pMA5-srth、pHY-srth轉(zhuǎn)入JM109，分別命名為Eco/pMH、Eco/pHH，涂布氨芐青霉素抗性平板，挑取轉(zhuǎn)化子、提取質(zhì)粒，經(jīng)單雙酶切驗(yàn)證正確后，將2個(gè)重組質(zhì)粒采用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主B.licheniformis9945a，分別命名為Bl/pMH(胞內(nèi)表達(dá))、Bl/pHH(胞外表達(dá))。Bl/pMH涂布卡那霉素抗性平板，Bl/pHH涂布四環(huán)素抗性平板，挑取轉(zhuǎn)化子、提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗(yàn)證及測(cè)序正確后，保藏菌種。

表2 構(gòu)建TH表達(dá)質(zhì)粒所用引物Table 2 Primers for the construction of plasmids carrying tyrosine hydroxylase

注：下劃線為酶切位點(diǎn)

1.2.3 重組SrTH的表達(dá)和純化

1.2.3.1 SrTH的表達(dá)

SrTH重組菌Bl/pMH(胞內(nèi)表達(dá))按照發(fā)酵培養(yǎng)條件I培養(yǎng)48 h后4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.0) 洗滌細(xì)胞2次，緩沖液重懸細(xì)胞至OD600為10，加入溶菌酶于37 ℃培養(yǎng)箱反應(yīng)30 min后超聲破碎菌液，離心得到的上清液即為粗酶液。Bl/pHH菌株(胞外表達(dá))在發(fā)酵培養(yǎng)基II中誘導(dǎo)結(jié)束后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.2.3.2 SrTH粗酶液的純化

(1)濃縮：粗酶液置于-70 ℃冷凍后，于冷凍干燥機(jī)中凍干，用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)重懸，使粗酶液濃縮10倍。

(2)(NH4)2SO4沉淀：在冰浴狀態(tài)下緩慢加入飽和(NH4)2SO4溶液，至(NH4)2SO4質(zhì)量濃度為500 g/L，邊加邊攪拌使其在酶液中快速混合均勻，然后將溶液磁力攪拌6 h，使蛋白質(zhì)充分沉淀。

(3)重懸沉淀：4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集沉淀部分，用等體積50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)重懸。

(4)透析：將重懸液放入透析袋中透析24 h，每隔6 h更換透析液除去(NH4)2SO4，收集透析后溶液，離心留上清液，透析液為20 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)。

(5)鎳柱親和層析：①40 mL結(jié)合緩沖液平衡鎳柱，流速2 mL/min；②上樣，流速1 mL/min；③40 mL結(jié)合緩沖液洗脫雜蛋白，流速2 mL/min；④100 mL解析緩沖液梯度洗脫重組蛋白，分別設(shè)置咪唑濃度為200、300、500 mmol/L三個(gè)梯度，流速2 mL/min。收集蛋白峰，將純化后樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。其中，結(jié)合緩沖液: Tris-HCl (pH 7.4) 25 mmol/L、NaCl 0.5 mol/L；解析緩沖液: Tris-HCl (pH 7.4) 25 mmol/L、NaCl 0.5 mol/L、咪唑500 mmol/L。

1.2.4 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化

TH重組菌Bl/pMH與墨蝶呤還原酶重組菌Bl/pMF分別在發(fā)酵培養(yǎng)基I中發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)OD600，然后于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集菌體，用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)洗滌細(xì)胞2次，再用緩沖液重懸菌體至菌體濃度OD600為20。將重懸后的Bl/pMH與Bl/pMF按照1∶1的菌體濃度比例混合，加入2 g/LL-Tyr，在37 ℃、250 r/min進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化36 h。以等菌體濃度的Bl/pMA、Bl/pMH和Bl/pMF菌株單獨(dú)轉(zhuǎn)化為對(duì)照。

1.2.5 酶活力檢測(cè)

TH酶活力檢測(cè)方法參考VERMEER等[22]的方法，稍作修改。

樣品檢測(cè)：①將酶液與終濃度為0.25 mmol/L的BH4、2.5 μmol/L Fe2+混合，冰浴10 min；②加入L-Tyr，37 ℃反應(yīng)20 min；③加入終濃度為2 mmol/L的高碘酸鈉，混勻后常溫反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)37 ℃、475 nm的吸光值。總反應(yīng)體系為200 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定：用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液配制一系列不同濃度的L-DOPA標(biāo)準(zhǔn)樣品與2 mmol/L高碘酸鈉混合液，相同條件下反應(yīng)10 min，檢測(cè)475 nm下的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.000 4x+0.014 6，R2=0.99。式中，y，A475nm；x，L-DOPA濃度，μmol/L)。

酶活力定義：每1 min生成1 nmolL-DOPA所需的酶量為1個(gè)酶活力單位，記為U：

(1)

式中：ρ，L-DOPA質(zhì)量濃度，g/L；V，酶反應(yīng)體系體積，L；M，L-DOPA相對(duì)分子質(zhì)量，197.19；t，反應(yīng)時(shí)間，min。

1.2.6L-DOPA[23]與BH4[24]檢測(cè)

樣品經(jīng)三氯乙酸沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行HPLC測(cè)定。HPLC液相檢測(cè)條件如下：

L-DOPA：色譜柱(4.6 mm×250 mm，XSelect?HSS T3，Japan)；柱溫30 ℃；波長(zhǎng)280 nm；流動(dòng)相為0.08%甲酸/乙腈；流速1 mL/min。配制一系列濃度的L-DOPA標(biāo)準(zhǔn)樣品，在相同條件下檢測(cè)，以確定出峰時(shí)間并制作峰面積-濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=27.6x，R2=0.999。其中：y，峰面積，μAU·s；x，L-DOPA濃度，μmol/L)。

BH4：色譜柱(4.6 mm×250 mm，XSelect?HSS T3，Japan)；柱溫40 ℃；波長(zhǎng)246 nm；流動(dòng)相為30 mmol/L乙酸鈉，體積分?jǐn)?shù)3%甲醇；流速：1 mL/min。配制一系列濃度的BH4標(biāo)準(zhǔn)樣品，在相同條件下檢測(cè)，以確定出峰時(shí)間并制作峰面積-濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=27.697x+0.809，R2=0.99。其中：y，峰面積，mAU·min；x，BH4濃度，mmol/L)。

1.2.7 TH催化過程探究

將酶液與終濃度為0.3 mmol/L的BH4、2.5 μmol/L Fe2+混合，冰浴10 min；加入一定濃度的L-Tyr，置于37 ℃培養(yǎng)箱反應(yīng)，每隔10 min取樣。樣品加入終體積分?jǐn)?shù)為5%的三氯乙酸，在4 ℃放置3 h，然后4 ℃、12 000 r/min離心10 min取上清液，進(jìn)行HPLC測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 TH的氨基酸序列分析

在B.licheniformis中構(gòu)建L-DOPA合成途徑的關(guān)鍵是篩選出合適的TH基因。本研究選擇Streptosporangiumroseum來源的TH基因，并對(duì)其進(jìn)行氨基酸序列分析。查找NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)可得，srth全長(zhǎng)894 bp，編碼297個(gè)氨基酸殘基。通過ExPASy在線工具分析可知，srth基因編碼的SrTH蛋白分子式為C1511H2311N411O445S5，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量約為33.5 kDa，等電點(diǎn)為5.00。在組成SrTH蛋白的所有氨基酸中，丙氨酸(Ala) 比例最高，占氨基酸總量的11.8%；其次是亮氨酸(Leu)，占氨基酸總量的10.1%；半胱氨酸(Cys)比例最低，僅為總氨基酸量的0.3%；帶負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為46個(gè)，帶正電殘基總數(shù)(Arg+Lys)為28個(gè)；脂肪族氨基酸指數(shù)90.40，親水性的總平均值為-0.208，屬于親水性蛋白；計(jì)算失穩(wěn)指數(shù)(II)為35.62，歸類為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

為了解SrTH與動(dòng)物來源TH的親緣關(guān)系，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載獲得不同微生物及動(dòng)物來源TH氨基酸序列，利用MEGA 6.0 繪制了TH系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。由進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，微生物來源和動(dòng)物來源的TH在進(jìn)化樹中各自聚集在一起，SrTH與TbTH(ThermobisporabisporaDSM 43833)的進(jìn)化距離最近，與動(dòng)物來源的TH較遠(yuǎn)，與人類來源的TH進(jìn)化距離最遠(yuǎn)，因此難以斷定該基因是否具有與動(dòng)物來源基因相同的生物學(xué)功能，有必要進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，根據(jù)保守性初步判定其是否具備催化L-Tyr合成L-DOPA的功能。因此，利用DNAMAN進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析(圖2)。

圖1 SrTH與其他來源的TH的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of SrTH and TH from other sources

研究表明，動(dòng)物來源TH的活性受到N端的Ser19、Ser31、Ser40的磷酸化調(diào)節(jié)，具有鐵原子和底物蝶呤結(jié)合的氨基酸殘基[25-27]。根據(jù)氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，SrTH中存在參與鐵元素結(jié)合的保守氨基酸殘基His162、His167和Glu208以及參與底物喋呤結(jié)合氨基酸殘基Gly124、Leu126、Phe131、Glu163和 Glu208，與家蠶來源的TH一致[27]。此外，比對(duì)發(fā)現(xiàn)微生物來源與動(dòng)物來源的TH在參與底物喋呤結(jié)合的氨基酸殘基區(qū)域存在一定差異(動(dòng)物來源TH：Leu125、Tyr203；微生物來源TH：Val125和Phe203)。該差異殘基是否影響對(duì)酶與底物喋呤親和力，需進(jìn)一步驗(yàn)證。

“▲”、“★”分別表示與鐵離子和底物蝶呤結(jié)合的保守氨基酸殘基圖2 SrTH與其他來源的TH氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Comparison of the amino acids sequences ofSrTH and TH from other sources

以上研究表明，SrTH與動(dòng)物來源TH存在基本一致的底物結(jié)合位點(diǎn)，具備基于B.licheniformis表達(dá)系統(tǒng)合成L-DOPA的功能基礎(chǔ)，接下來將SrTH在B.licheniformis中異源表達(dá)驗(yàn)證其酶功能。

2.2 SrTH重組表達(dá)菌構(gòu)建

按照1.2.2的方法構(gòu)建TH重組質(zhì)粒pMA5-srth、pHY-srth，重組質(zhì)粒的大小分別為7 954、6 314 bp；將2個(gè)重組質(zhì)粒分別用NdeI、NheI和KpnI、SalI雙酶切。Bl/pMH酶切后理論條帶大小是912和7 042 bp，Bl/pHH酶切后理論條帶大小是894和5 420 bp，結(jié)果如圖3所示，電泳條帶大小與理論值一致，說明TH重組質(zhì)粒pMA5-srth、pHY-srth構(gòu)建成功。

M-DNA marker；1～2-重組質(zhì)粒pMA5-srth單、雙酶切；3～4-重組質(zhì)粒pHY-srth單、雙酶切圖3 重組質(zhì)粒pMA5-srth、pHY-srth單雙酶切驗(yàn)證Fig.3 Verification of recombinant plasmids pMA5-srthand pHY-srth through enzyme digestion reactions

2.3 地衣芽孢桿菌中TH功能探究

2.3.1 胞內(nèi)酶活力的測(cè)定

將對(duì)照菌Bl/pMA及重組表達(dá)菌株Bl/pMH按1.2.3分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。按照1.2.5酶活性檢測(cè)方法檢測(cè)粗酶液酶活力。結(jié)果顯示，空載菌株Bl/pMA未檢測(cè)到酶活力，重組菌株Bl/pMH胞內(nèi)檢測(cè)到酶活力。以Bl/pMA為空白對(duì)照，重組表達(dá)菌株Bl/pMH胞內(nèi)粗酶酶活性為30.7 U/mL。由此可知，酪氨酸羥化酶SrTH可在B.licheniformis中正常表達(dá)并具有酶活力。然而其是否具有生物學(xué)功能，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.3.2 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化

如圖4所示，在B.licheniformis中，L-DOPA的合成在TH、L-Tyr、輔因子BH4的共同參與下完成。由于B.licheniformis自身基因組中存在從GTP合成BH4前體的代謝途徑，通過表達(dá)墨蝶呤還原酶即可實(shí)現(xiàn)BH4的合成。因此，在底物L(fēng)-Tyr的存在下，只需提供墨蝶呤還原酶即可在重組菌Bl/pMH中實(shí)現(xiàn)L-DOPA合成。將酪氨酸羥化酶重組菌Bl/pMH與墨蝶呤還原酶重組菌Bl/pMF進(jìn)行混合，便可直接快速高效地利用全細(xì)胞聯(lián)合催化合成L-DOPA。

將Bl/pMH與Bl/pMF菌株混合，以L-Tyr為底物進(jìn)行全細(xì)胞聯(lián)合轉(zhuǎn)化，并與空載及Bl/pMH、Bl/pMF單獨(dú)轉(zhuǎn)化進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果如圖5所示。

全細(xì)胞轉(zhuǎn)化36 h后，Bl/pMH與Bl/pMF全細(xì)胞聯(lián)合轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系變成黑色，而在相同的培養(yǎng)條件下，空載及Bl/pMH、Bl/pMF的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)液未發(fā)生顏色變化(圖5-a)。

虛線方內(nèi)框?yàn)锽. licheniformis中BH4前體物質(zhì)6-丙酮酰四氫蝶呤合成途徑圖4 地衣芽孢桿菌中TH催化L-Tyr合成L-DOPA途徑Fig.4 The biosynthesis of L-DOPA via L-tyrosine catalyzed by tyrosine hydroxylase in B. licheniformis

a-L-DOPA的氧化;b-L-DOPA的液相檢測(cè)圖5 不同重組菌株的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化Fig.5 Whole-cell biotransformation of differentrecombinant strains

由于L-DOPA很容易被氧化成多巴醌并進(jìn)一步氧化成黑色素[28]，因此我們推斷，B.licheniformis中srth基因成功表達(dá)，并在墨蝶呤還原酶的存在下，實(shí)現(xiàn)L-DOPA積累，并一定程度上被空氣氧化為黑色素[30]，使得發(fā)酵液變?yōu)楹谏?/p>

進(jìn)一步將發(fā)酵液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，結(jié)果如圖5-b所示?？蛰d菌株Bl/pMA5、Bl/pMF單獨(dú)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化均沒有L-DOPA產(chǎn)生，Bl/pMH與Bl/pMF全細(xì)胞聯(lián)合轉(zhuǎn)化后L-DOPA產(chǎn)量為335.92 μmol/L。分析其原因是B.licheniformis具有從GTP合成BH4前體6-丙酮酰四氫蝶呤的代謝途徑，墨蝶呤還原酶的過表達(dá)成功催化前體6-丙酮酰四氫蝶呤合成BH4，為TH催化L-Tyr合成L-DOPA提供了輔因子。同時(shí)，該結(jié)果說明BH4在TH催化L-Tyr合成L-DOPA過程中至關(guān)重要，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[29]。在不存在BH4下，SrTH可以催化L-Tyr合成少量L-DOPA，具體原因有待進(jìn)一步研究。

由以上結(jié)果可知，在墨蝶呤還原酶重組菌Bl/pMF輔助下，SrTH在B.licheniformis中具有催化L-Tyr合成L-DOPA的能力。但是催化過程中底物L(fēng)-Tyr與輔因子BH4需求量及消耗比例尚不可知，后續(xù)使用純化后SrTH對(duì)底物與輔因子比例進(jìn)行初步探索，為后期B.licheniformis“從頭”合成L-DOPA代謝改造奠定基礎(chǔ)。

2.4 地衣芽孢桿菌中TH的分離純化與酶活性分析

為了更加清晰明了表達(dá)后的SrTH酶催化過程底物與輔因子的消耗比例關(guān)系，選擇用純化后的酶進(jìn)行探究。為便于酶的分離純化和酶活性分析，選擇重組菌Bl/pHH進(jìn)行胞外表達(dá)。將按照1.2.3獲得純化后的SrTH蛋白。將純化后酶液進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖6所示。

M-蛋白質(zhì)marker；1-空載Bl/pHY；2-Bl/pHY-srth純化后重組蛋白圖6 重組蛋白SrTH SDS-PAGE結(jié)果Fig.6 SDS-PAGE results of recombinant protein SrTH

在35 kDa位置有目的蛋白條帶，與SrTH預(yù)測(cè)分子質(zhì)量33.5 kDa相符，獲得了純度較高的目的蛋白，可用于進(jìn)一步研究。

將目的蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化并收集洗脫組分進(jìn)行透析復(fù)性，結(jié)果如表3所示。SrTH蛋白酶活力為22.79 U/mL，總酶活力為113.94 U，回收率為10.67%，比酶活力為70.77 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)33.38。相比于桂江[19]在大腸桿菌中異源表達(dá)家蠶來源TH基因，同樣以L-Tyr為底物，僅獲得0.13 U/mg的比酶活力，SrTH蛋白具有較好的表現(xiàn)。

表3 酶純化過程中酶活力及蛋白濃度Table 3 Enzyme activities and protein concentrationsduring purification proces

2.5 TH催化過程探究

在TH轉(zhuǎn)化L-Tyr合成L-DOPA過程中，L-Tyr在BH4存在下轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-DOPA，同時(shí)BH4參與反應(yīng)后轉(zhuǎn)化為4a-OH-BH4[30]，因此若要實(shí)現(xiàn)B.licheniformis中TH轉(zhuǎn)化L-Tyr合成L-DOPA過程的持續(xù)進(jìn)行，保證L-Tyr與BH4的充足供給，有必要探究催化過程中底物L(fēng)-Tyr與輔因子BH4的消耗比例。利用純化后的SrTH和商業(yè)來源的BH4標(biāo)準(zhǔn)樣品設(shè)計(jì)酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。對(duì)酶反應(yīng)過程中L-Tyr、L-DOPA、BH4以及4a-OH-BH4的變化情況進(jìn)行分析。結(jié)果如圖7所示。

圖7 SrTH催化L-Tyr合成L-DOPA過程圖Fig.7 The process of the synthesization for L-DOPAvia L-tyrosine catalyzed by SrTH

從圖7可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，底物L(fēng)-Tyr與輔因子BH4不斷被消耗，產(chǎn)物L(fēng)-DOPA與4a-OH-BH4逐漸增多。在0～20 min內(nèi)，L-Tyr濃度迅速由1 681 μmol/L降至1 498 μmol/L，隨后基本不再變化，L-DOPA逐漸積累至13 μmol/L，20 min后出現(xiàn)略微降低，這是因?yàn)長(zhǎng)-DOPA在空氣中不穩(wěn)定，逐漸被氧化為黑色素導(dǎo)致的[28]。同時(shí)觀察到BH4由302 μmol/L降至較低水平，在30 min時(shí)已基本檢測(cè)不到，因此推測(cè)是輔因子BH4不足導(dǎo)致反應(yīng)無法繼續(xù)進(jìn)行。在第40 min補(bǔ)加BH4至728 μmol/L，L-Tyr在10 min內(nèi)減少了145 μmol/L，證明輔因子BH4是限制酶反應(yīng)進(jìn)行的重要因素；60～70 min 反應(yīng)逐漸停止，該階段L-DOPA 最高積累量為25 μmol/L。然而此時(shí)酶反應(yīng)體系尚存在BH4，我們猜測(cè)反應(yīng)的停止是酶量不足所致。因此酶反應(yīng)80 min同時(shí)補(bǔ)加酶液和BH4，L-Tyr在30 min內(nèi)減少量為224 μmol/L，L-DOPA增加量為20 μmol/L，BH4減少量為437 μmol/L。由此可知，BH4是酶反應(yīng)進(jìn)行的重要限制性因素，通過補(bǔ)充BH4和酶液可以使反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，計(jì)算可知L-Tyr的消耗量與輔因子BH4的需求量之比約為1∶2。同時(shí)，根據(jù)酶反應(yīng)的結(jié)果推測(cè)，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化中Bl/pMF合成的BH4在 TH的催化過程中也可能是不充足的。

3 結(jié)論

本研究通過生物信息學(xué)方法篩選出一種具有底物保守結(jié)合位點(diǎn)的微生物來源TH基因，在B.licheniformis中成功表達(dá)，胞內(nèi)外酶活性分別為30.7和22.79 U/mL。進(jìn)一步通過B.licheniformis重組菌(Bl/pMH與Bl/pMF)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法成功實(shí)現(xiàn)L-DOPA的積累。其次，通過在TH/墨蝶呤還原酶催化Tyr合成L-DOPA過程中進(jìn)行輔因子補(bǔ)給，我們得出L-DOPA合成過程中底物L(fēng)-Tyr與四氫生物蝶呤之間供給比例關(guān)系，為后續(xù)TH法催化L-Tyr合成L-DOPA提供可靠的理論支持。