子宮內(nèi)膜樣癌組織中ING4、p53、Ki-67、ER、PR的表達及其意義

董 杏 李 珍 宿曉曉 林艷麗 杜艷敏 張歡歡 曾憲旭

子宮內(nèi)膜樣癌是原發(fā)于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，為女性生殖道三大惡性腫瘤之一[1]。近年來發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計2015年中國新發(fā)病例63 400例，死亡病例21 800例[2]。子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)生機制目前尚未明確，相關(guān)研究表明子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)生與內(nèi)源性及外源性雌激素長期刺激關(guān)系密切[3-4]。ING4作為ING家族中的一員，是一個腫瘤抑制因子，目前的研究表明，它可通過多種途徑來參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡[5]。本研究通過組織芯片及免疫組化方法聯(lián)合檢測，一方面探討ING4在子宮內(nèi)膜樣癌中的表達，另一方面探討不同子宮內(nèi)膜組織中ING4、p53、Ki-67、ER、PR的表達水平，結(jié)合臨床病理學特征進行分析，為疾病的診斷和預后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

該研究經(jīng)鄭州大學第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準，收集了2015年12月至2019年3月于鄭州大學第三附屬醫(yī)院因子宮內(nèi)膜病變行全子宮切除術(shù)，術(shù)后常規(guī)病理確診為子宮內(nèi)膜樣癌的標本60例(研究組，C組)，按照2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟新修訂標準，手術(shù)病理分期Ⅰ期40例、Ⅱ期13例、Ⅲ期7例；按照2003年世界衛(wèi)生組織修訂標準，組織學分級高分化28例、中分化17例、低分化15例；無子宮肌層浸潤7例、浸潤淺肌層者(<1/2)28例，深肌層或漿膜浸潤(≥1/2)25例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7例。另取同時期因其他婦科疾病而進行手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜標本為對照組，其中子宮內(nèi)膜不典型增生的標本30例(B組)以及正常的子宮內(nèi)膜標本20例(A組)。所有研究對象術(shù)前均未接受內(nèi)分泌治療或輔助放化療，且術(shù)前肝功能及腎功能指標均在正常范圍內(nèi)。選取患者的年齡為45～79歲，平均53歲。

1.2 實驗試劑

免疫組化試劑P53(DO-7)、Ki-67(30-9)、ER(SP1)、PR(IE2)由美國羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司提供；ING4(Cat No.：I0617-I-AP)抗體由武漢三鷹公司提供。DAB顯色試劑盒購自上海生工生物工程公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織芯片的制備 首先在HE切片上選定最具代表性的子宮內(nèi)膜位點，對照石蠟標本進行標記，精確穿刺位點，用1 mm孔徑的穿刺針將采集到的組織注入到蠟塊陣列中，并對每一個位點進行編號。并按照6×9的序列將其整齊的排列在蠟塊上。組織芯片要制平整以免出現(xiàn)組織移位、缺失等，點間距離是0.3 mm。使用Leica2245切片機以4 μm厚度進行連續(xù)切片，以備后續(xù)實驗。

1.3.2 免疫組織化學染色(SP)方法 組織芯片蠟塊取4 μm切片在75 ℃恒溫烤箱中烘烤30 min后，將石蠟切片放在二甲苯中脫蠟；將脫蠟后的切片進行梯度酒精脫水，自來水沖洗；然后將切片放入EDTA修復液中煮沸、修復；冷卻至室溫后把切片放入濕盒中用3%過氧化氫封閉；PBS沖洗3次后，滴加按比例稀釋的一抗，包括ING4抗體(Cat No.：I0617-I-AP，1：600)，P53(DO-7)、Ki-67(30-9)、ER(SP1)、PR(IE2)，37 ℃孵育1 h；PBS沖洗3次后，室溫下加用相應(yīng)二抗30 min；DAB顯色、復染后用中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察。

1.3.3 染色結(jié)果及判定標準 由2位病理科主任醫(yī)師在臨床和病理資料不知曉的情況下獨立觀察切片，并進行染色評分，ING4蛋白的陽性表達位于細胞核或胞質(zhì)，但主要是核表達，以核出現(xiàn)棕黃色細顆粒狀著色為標準。陽性結(jié)果判定：每張切片隨機選取5個視野(×40)，計數(shù) 500個細胞，依照細胞染色強度和染色密度作為評分標準：①染色強度根據(jù)染色深度分為4級：無染色者為0分、淺黃色為1分，棕黃色者2分，棕褐色者為3分。②依據(jù)染色細胞百分比：未見染色細胞為0分，染色細胞比例≤25%者為1分，染色細胞比例在 25%～50%為2分，染色細胞比例≥50%為3分。以上訴兩方面之和的總得分來判定結(jié)果，≤2分判定為陰性，>2分判定為陽性[6]。

1.4 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，定性資料應(yīng)用χ2檢驗，有序等級資料采用Spearman等級檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同子宮內(nèi)膜組織中ING4、p53、Ki-67及ER、PR 的表達情況

ING4在A組中表達率最高，在B組和C組中表達率逐漸降低，且三者比較差異有統(tǒng)計學意義。p53、Ki-67蛋白在C組中高表達，表達率分別為63.33%和41.67%；在B組中表達率分別為40.00%和33.33%，A組中表達率分別為15.00%和10.00%，A、B組與C組相比，P<0.05；且A組與B組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ER、PR在A組、B組、C組中的陽性表達率逐漸下降，且C組與A組及B組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 子宮內(nèi)膜癌中ING4、p53、Ki-67、ER、PR的表達與臨床病理特征的關(guān)系

ING4的表達與子宮內(nèi)膜癌臨床病理分期、組織分化程度、肌層浸潤深度等病理特征均有關(guān)，子宮內(nèi)膜癌組織、臨床分期越晚、分化程度越差、肌層浸潤越深者，ING4表達越低，且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。p53、Ki-67的陽性表達率隨子宮內(nèi)膜癌病理分期、肌層浸潤深度的增加有增高的趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ER的陽性表達率與分化程度及肌層浸潤深度有關(guān)(P<0.05)，PR的陽性表達率與病理分期、分化程度以及肌層浸潤深度均相關(guān)；由于淋巴結(jié)陽性樣本量較少，未發(fā)現(xiàn)上述因子的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性，見表2。

表1 ING4、p53 、Ki-67及ER、PR在不同組織中的表達情況(例，%)

注：*表示與子宮內(nèi)膜癌(C組)比較，P<0.05；#表示與不典型增生子宮內(nèi)膜(B組)比較，P<0.05。

表2 子宮內(nèi)膜組織中ING4、p53、Ki-67、ER、PR的陽性表達與臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

2.3 子宮內(nèi)膜樣癌中ING4、p53、Ki-67、ER和PR的相關(guān)性研究

Pearson相關(guān)分析顯示：ING4的表達與ER及PR的表達量存在正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ING4的表達與p53的表達量存在負相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 ING4、p53、Ki-67、ER和PR的相關(guān)性(γ)

注：*表示兩者相比，P<0.05。

3 討論

ING4作為ING家族的成員，是一個腫瘤抑制因子，它可以通過不同的途徑來參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖和凋亡，如在結(jié)腸癌和膠質(zhì)瘤細胞中，ING4可通過與NFκB/p65的相互作用導致NFκB/p65蛋白酶體依賴性降解和腫瘤抑制[7-8]。本研究中，ING4蛋白在正常子宮內(nèi)膜、不典型增生性子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜樣癌中，隨著病變程度的增加，ING4的表達逐步降低，與趙倩等[6]研究結(jié)果一致。

ING4為抑癌基因，但其真正的作用機制目前尚未清楚，結(jié)合其在其他腫瘤中的研究，我們推測ING4可能在子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)生發(fā)展過程中參與了p53通路的調(diào)控，所以本課題致力于探討ING4在子宮內(nèi)膜癌中的分子作用機制，并對ING4對腫瘤細胞的增殖、凋亡進行研究分析。本研究發(fā)現(xiàn)ING4的表達與p53的表達量存在負相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學意義。

我們對ING4蛋白的表達與子宮內(nèi)膜樣癌臨床病理特征進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ING4蛋白在子宮內(nèi)膜樣癌組織中，隨著腫瘤肌層浸潤加深，其表達逐漸降低；Ⅱ～Ⅲ較Ⅰ期的表達下降；低分化組與中高分化組相比，ING4的表達下降。研究者在乳腺癌[9]和前列腺癌[10]中也發(fā)現(xiàn)同樣的結(jié)論，此外ING4在子宮內(nèi)膜癌和不典型增生中的表達明顯下降，提示ING4的基因突變或蛋白表達異常甚至缺失可能參與了啟動子宮內(nèi)膜癌的惡變過程。

Ki-67存在于增殖細胞核基質(zhì)內(nèi)，檢測Ki-67的陽性率表達常作為評估腫瘤細胞增殖活性的指標[11]。抑癌基因p53編碼核磷酸蛋白，具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、誘導凋亡等多種生物學作用。p53在人類腫瘤中極易發(fā)生突變，突變后其正常的抑癌作用消失，細胞將發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[12]。我們采用免疫組化方法檢測到的p53為突變型p53。Athanassiadou等[13]研究顯示，突變的p53可明顯增加子宮內(nèi)膜的癌變率。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中p53陽性表達率明顯高于對照組患者，且與FIGO 病理分期、分化程度、肌層浸潤程度呈正相關(guān)，這表明突變的p53可直接反映子宮內(nèi)膜癌的惡性程度，與腫瘤的發(fā)生、腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

子宮內(nèi)膜癌發(fā)病與雌、孕激素密切相關(guān)[4]。研究顯示[14]PR、ER 陽性表達的子宮內(nèi)膜癌患者有更高的5年生存率。PR低表達通常早于 EC 的發(fā)生或發(fā)生在早期階段，由此推測由于孕激素無法發(fā)揮拮抗ER的作用，促進了ER、PR 表達下調(diào)的早期癌變細胞的生存，從而誘發(fā)癌變的進一步發(fā)生，導致 EC 的發(fā)生[15]。本研究顯示，ER、PR陽性表達率從正常子宮內(nèi)膜到癌變的內(nèi)膜，呈下降趨勢，多數(shù)情況下為弱陽性表達，在子宮內(nèi)膜癌中表達降低。ER、PR 在子宮內(nèi)膜樣癌中的陽性率隨組織學分級的增高而降低，與肌層浸潤深度及分期無關(guān)，與徐珂等[16]研究中顯示的ER、PR蛋白表達量與 EC 臨床分期、組織分化程度存在明顯相關(guān)性結(jié)論一致。此外本研究證實ER、PR在雌激素依賴性子宮內(nèi)膜癌中呈現(xiàn)出高表達的狀態(tài)且與P53、Ki-67的表達呈負相關(guān)。

綜上所述，ING4的表達與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生呈負相關(guān)，可作為子宮內(nèi)膜癌患者的一種可靠的預后指標。P53突變的子宮內(nèi)膜癌，其瘤細胞分化較差，惡性程度高，提示預后不良。Ki-67陽性也提示子宮內(nèi)膜癌預后較差。上述指標聯(lián)合應(yīng)用可能對子宮內(nèi)膜癌病理診斷及預后和靶向治療提供幫助。