ARL4C 在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)及臨床意義

彭華紅，肖龍飛，王林，陳賽鵬，王嘉南，楊闊

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津300211）

睪丸生殖細(xì)胞腫瘤占全世界男性新診斷癌癥的1.0%～1.5%，其發(fā)病率在過(guò)去20 年中呈上升趨勢(shì)，是14～44 歲男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。睪丸生殖細(xì)胞腫瘤約占睪丸原發(fā)性惡性腫瘤的90%～95%，約有50%睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者的組織學(xué)類型為精原細(xì)胞瘤，另外約50%的患者被診斷為有各種類型的非精原細(xì)胞瘤或混合型睪丸生殖細(xì)胞腫瘤，在初次診斷時(shí)大約30%的患者已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移性病變[2]。盡管手術(shù)和順鉑化療的結(jié)合使睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者的治愈率大大增加，但耐藥及腫瘤的復(fù)發(fā)依然對(duì)患者的生命造成了威脅，所以需要更好的了解睪丸生殖細(xì)胞腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制以及尋找新的治療靶點(diǎn)。

ADP-核糖基化因子-4（ARL4）家族蛋白，包括ARL4A、ARL4C 和ARL4D，均涉及一些基本的細(xì)胞功能，如遷移和傳播等[3]。其中ARL4C 已被發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌、肺癌和平滑肌肉瘤等均呈現(xiàn)高表達(dá)，且對(duì)腫瘤有不同程度的促進(jìn)作用[4]，但其在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤發(fā)生過(guò)程中扮演的作用依然未知，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)探索ARL4C 在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)情況及對(duì)其發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 通過(guò)GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫(kù)收集137 例睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者及165 例非睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者ARL4C 的表達(dá)情況，以及ARL4C 對(duì)68 例睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者和68 例非睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者預(yù)后的影響。另外，收集2015-2018 年天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院40 例睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者的基本住院信息、臨床病理資料以及石蠟包埋的組織蠟塊，每例患者都經(jīng)過(guò)了2 位以上的病理醫(yī)生確診。實(shí)驗(yàn)中所用的正常睪丸細(xì)胞系HT，睪丸生殖細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系NT2，Tcam-2 由天津泌尿外科研究所提供并保存。本研究已經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化 患者的石蠟包埋切片通過(guò)免疫組織化學(xué)測(cè)定蛋白質(zhì)表達(dá)。首先使用二甲苯脫蠟，然后將切片浸入0.01 mol/L 枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液中（pH6.0～6.5）放入微波爐加熱共15 min 進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫冷卻，3%H2O2去離子水避光孵育15 min 阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。PBS 緩沖液清洗10 min，滴加山羊血清封閉液孵育15 min，然后滴加ARL4C一抗(1:200)于4℃過(guò)夜。第2 天PBS 清洗10 min 后依次滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗及辣根過(guò)氧化物酶各孵育15 min（中間用PBS 清洗10 min）。之后每張切片滴加DAB 工作液，自來(lái)水沖洗3 min，滴加蘇木素工作液復(fù)染，沖洗同前，最后經(jīng)過(guò)脫水處理之后常規(guī)中性樹(shù)膠封片。免疫組化結(jié)果用Mattern 積分法判定，依照細(xì)胞陽(yáng)性著色程度分為：1（弱陽(yáng)性）；2（中等陽(yáng)性）；3（強(qiáng)陽(yáng)性）。依照陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量可分為：0（0），1（1%～25%），2（26%～50%），3（51%～100%）。二者相乘，小于或等于3 分為陰性，大于3 分為陽(yáng)性，大于6 分為強(qiáng)陽(yáng)性。400×顯微鏡下隨機(jī)觀察5 個(gè)視野，取其平均值。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞用RPMI-1640 培養(yǎng)基加入胎牛血清使終濃度為10%（Gibco，Australia），加入青霉素和鏈霉素使終濃度為 1%（Solarbio，China），在37℃，5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，常規(guī)傳代。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR） 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)，使用TRIzolTM試劑（Life Technologies，USA）獲得細(xì)胞總 RNA。通過(guò)HiFiScript cDNA 合成試劑盒（Cwbiotech，China）將總 RNA 合成互補(bǔ) DNA（cDNA），使用 EcoTMReal-Time PCR System（Illumina，USA）進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)如下：95℃ 10 min，之后 95℃15 s，60℃30 s，72℃ 15 s，持續(xù) 42 個(gè)循環(huán)。最終 95℃持續(xù)15 s，60℃持續(xù) 15 s，95℃持續(xù) 15 s。在 qRT-PCR 中使用引物如下：ARL4C：正向：5′-AGGTGACCAAGTTCGC CGAG-3′，反向：5′-GACGTGATAGGTGGTGGCCG-3′。GAPDH: 正向：5′-TGCCAAATATGATGACATCAAGAA-3′，反向：5′-GGAGTGGGTGTCGCTGTTG-3′。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blot 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，使用細(xì)胞總蛋白提取試劑盒與PMSF（100:1）提取細(xì)胞蛋白，BCA 法測(cè)量蛋白濃度，按3:1 添加蛋白上樣緩沖液后于95℃加熱5 min 使蛋白變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）用于蛋白分離，制備濃度為10%的分離膠，按上述測(cè)量濃度添加一定體積蛋白，初始電壓80 V 進(jìn)行電泳。40 min 后轉(zhuǎn)為120 V 直至電泳結(jié)束。將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜并用5%BSA 封閉1 h，在4℃下與ARL4C 一抗敷育過(guò)夜。第2 天用 TBST 洗滌 15 min×3 次，并在 20℃下與二抗孵育1 h。通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影，GAPDH用于對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS13.0 及 GraphPad Prism7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，χ2檢驗(yàn)分析 ARL4C在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤及癌旁組織中的表達(dá)情況，Kaplan-Meier 生存曲線分析患者預(yù)后情況，Spearman 相關(guān)性分析ARL4C 與DIRAS1 之間的關(guān)系，獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)分析ARL4C 在正常睪丸細(xì)胞與睪丸腫瘤細(xì)胞之間的差異表達(dá)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARL4C 在多種癌癥中呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì) 在GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索ARL4C 基因，發(fā)現(xiàn)其在多種癌癥中呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)，結(jié)果如圖1A 所示。其中，在膽管癌（CHOL）、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）、腎透明細(xì)胞癌（KIRC）、腎乳頭狀細(xì)胞癌（KIRP）、急性髓系白血病（LAML）、肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）、卵巢漿液性囊腺癌（OV）、胰腺癌（PAAD）、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤(PCPG)、胃腺癌（STAD）、睪丸生殖細(xì)胞腫瘤（TGCT）、胸腺瘤（THYM）、子宮內(nèi)膜癌（UCEC）、子宮癌肉瘤（UCS）中的差異表達(dá)具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），結(jié)果如圖1B，筆者選取睪丸生殖細(xì)胞腫瘤作為研究對(duì)象。

2.2 ARL4C 在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)及對(duì)其預(yù)后的影響 在GEPIA 中收集了137 例睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者及165 例非睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者的ARL4C 表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在非睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者中ARL4C 基因平均表達(dá)量處于極弱的水平，而睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者中ARL4C 基因表達(dá)量顯著升高，與非腫瘤患者差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2A），繼續(xù)深入探討ARL4C 與腫瘤的關(guān)系，筆者將137 例腫瘤患者按臨床分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)各期之間ARL4C 表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。分別統(tǒng)計(jì)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)中68 例高表達(dá)ARL4C 患者與68 例低表達(dá)ARL4C 患者的生存時(shí)間，Kaplan-Meier 生存分析顯示高表達(dá)患者生存時(shí)間顯著縮短（P＜0.05，圖2C），ARL4C 在體內(nèi)的高表達(dá)水平對(duì)患者的生存具有不利影響。

2.3 免疫組化驗(yàn)證ARL4C 在睪丸組織的表達(dá)情況 收集了天津醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2015-2019 年40 例不同臨床分期的睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者臨床信息以及病理組織（包括癌組織與癌旁組織）。對(duì)病理組織進(jìn)行ARL4C 特異性免疫組織化學(xué)染色（免疫組化）實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，與GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)中收集的信息相一致，ARL4C 在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織（P＜0.05，表 1），免疫組化評(píng)分（染色強(qiáng)度×著色細(xì)胞比例）如圖3A 所示，圖3B 為選取的典型圖像。對(duì)所有患者的臨床信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表2 所示，ARL4C 的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小、分化程度、是否伴隨轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，與患者年齡、臨床分期的關(guān)系則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 ARL4C 在多種癌癥中呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)Fig 1 ARL4C shows high expression in a variety of cancers

圖2 ARL4C 在睪丸癌中的表達(dá)及對(duì)其預(yù)后的影響Fig 2 Expression of ARL4C in testicular cancer and its effect on prognosis

表1 睪丸腫瘤組織與癌旁組織ARL4C 表達(dá)情況Tab 1 Expression of ARL4C in testicular tumor tissues and adjacent tissues

2.4 RT-qPCR 和 Western blot 驗(yàn)證 ARL4C 在不同睪丸細(xì)胞系中的差異表達(dá) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證ARL4C在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)情況，選用正常睪丸細(xì)胞系HT、睪丸生殖細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系NT2 及TCam-2 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）及 Western blot 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4 所示，與正常細(xì)胞 HT 相比，NT2 和TCam-2 的 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05，圖4A）。Western blot 結(jié)果與qPCR 相似，腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)RL4C 蛋白表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞系（圖4B）。

表2 ARL4C 表達(dá)與患者臨床病理信息的關(guān)系Tab 2 Relationship between ARL4C expression and clinical pathological information of patients

圖3 免疫組化驗(yàn)證ARL4C 在睪丸組織的表達(dá)情況Fig 3 Immunohistochemistry confirmed the expression of ARL4C in testis tissue

2.5 DIRAS1 下調(diào)促進(jìn)ARL4C 表達(dá)，從而導(dǎo)致睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的發(fā)展 為了探尋ARL4C 過(guò)度表達(dá)在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者中發(fā)揮的作用，利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)尋找其作用靶點(diǎn)，結(jié)果如圖5A 所示，ARL4C與 DIRAS1、GMPS、CHST10、JDP2 等基因均有相互作用。DIRAS1 屬于腫瘤抑制性小GTP 酶，定位于19p13.3。它的表達(dá)可競(jìng)爭(zhēng)性與SmgGDS（促進(jìn)幾種致癌GTP 酶活化的蛋白質(zhì)）結(jié)合并抑制SmgGDS 與其他促進(jìn)惡性腫瘤的小GTP 酶的結(jié)合，包括KRas4B、RhoA 和 Rap1A[5]，DIRAS1 的異位表達(dá)可通過(guò)阻斷Ras 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來(lái)抑制神經(jīng)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[6]。另外，DIRAS1 是膠質(zhì)瘤和食管鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤抑制因子，DIRAS1 的下調(diào)發(fā)生在約50%的原發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌中，其與晚期臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較差的總體存活率顯著相關(guān)。在原發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的異位重新表達(dá)DIRAS1 可抑制細(xì)胞增殖、克隆形成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和腫瘤形成[7]。Spearman相關(guān)性分析顯示 ARL4C 與 DIRAS1 顯著相關(guān)（P＜0.05，圖5B）。通過(guò)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)收集137 例睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者與166 例非睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者DIRAS1 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)DIRAS1 在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者中的表達(dá)顯著降低（圖5C），為了驗(yàn)證這一結(jié)論，對(duì)40 例腫瘤組織和癌旁組織進(jìn)行了免疫組化染色，結(jié)果如圖5D 顯示，DIRAS1 在腫瘤組織中的染色強(qiáng)度明顯低于癌旁組織，在睪丸癌中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)。圖E 為免疫組化評(píng)分。猜測(cè)DIRAS1 的下調(diào)減弱了對(duì)ARL4C 的抑制，從而導(dǎo)致睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的生長(zhǎng)及發(fā)展。

圖4 RT-qPCR 和Western blot 驗(yàn)證ARL4C 在不同睪丸細(xì)胞系中的差異表達(dá)Fig 4 Differential expression of ARL4C in diverse testicular cell lines by RT-qPCR and Western blot

圖5 DIRAS1 下調(diào)促進(jìn)ARL4C 表達(dá)從而導(dǎo)致睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的發(fā)展Fig 5 Down-regulation of DIRAS1 promotes ARL4C expression leading to the development of testicular germ cell tumors

3 討論

睪丸生殖細(xì)胞腫瘤占男性腫瘤的1.0%～1.5%，占泌尿科腫瘤的5%[8]，是年輕男性中最常見(jiàn)的腫瘤，最近10 年發(fā)病率不斷上升。 睪丸生殖細(xì)胞腫瘤分為精原細(xì)胞瘤和非精原細(xì)胞瘤或混合型睪丸生殖細(xì)胞腫瘤，它們均起源于生殖細(xì)胞原位增生（原始生殖細(xì)胞發(fā)育不良的結(jié)果）[9-10]。

ADP-核糖基化因子（ARF）是 Ras 相關(guān) GTP 酶的亞家族，ARF 樣蛋白（ARL 蛋白）在進(jìn)化上是保守的，與ARF 蛋白具有40%～60%的氨基酸同一性[11]。由ARL 蛋白調(diào)節(jié)的細(xì)胞過(guò)程包括β-微管蛋白折疊，囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，胚胎發(fā)育期間的神經(jīng)發(fā)生和體節(jié)發(fā)生，以及成人精子發(fā)生的早期階段[12-14]。ARL4C 作為一種小GTP 酶在體內(nèi)參與了多種生理功能，有研究報(bào)道它參與了AI 依賴性膽固醇分泌過(guò)程，Wei 等[15]在人腎癌細(xì)胞中鑒定了ARL4C 與α-微管蛋白之間的相互作用并且其可能參與調(diào)節(jié)微管依賴性細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸過(guò)程，Matsumoto 等[16]發(fā)現(xiàn) Wnt-β-連環(huán)蛋白和表皮生長(zhǎng)因子-絲裂原活化蛋白激酶途徑協(xié)同作用可誘導(dǎo)ARL4C 表達(dá)，ARL4C 通過(guò)YAP/TAZ的核定位促進(jìn)細(xì)胞增殖，細(xì)胞形態(tài)變化，形成上皮細(xì)胞管以及胚胎腎臟中的尿道芽。ARL4C 已被發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌和肺腺癌的腫瘤病變中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，并且ARL4C 表達(dá)在體外和體內(nèi)均促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖[4]。ARL4C 也被證實(shí)與胃癌的腹膜傳播相關(guān)并且它的陽(yáng)性表達(dá)是胃癌的不良預(yù)后因素[17]。

在本研究中，通過(guò)對(duì)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)的挖掘，筆者發(fā)現(xiàn)ARL4C 在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)，之后通過(guò)收集患者臨床和病理信息以及免疫組化驗(yàn)證了ARL4C 在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)明顯升高，并且其升高能顯著影響睪丸生殖細(xì)胞腫瘤患者總的生存時(shí)間，進(jìn)一步分析患者臨床資料發(fā)現(xiàn)，ARL4C 的表達(dá)與腫瘤大小、分化程度、是否伴隨轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，與患者年齡及臨床分期的關(guān)系則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其次筆者對(duì)正常睪丸細(xì)胞系HT、睪丸生殖細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系NT2 及TCam-2 的mRNA 和蛋白質(zhì)進(jìn)行提取和分析，結(jié)果與免疫組化相一致，腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)RL4C 的mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)顯著高于正常細(xì)胞系。利用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)DIRAS1 與ARL4C 具有相互作用，并且二者顯著相關(guān)，對(duì)DIRAS1 進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果顯示它在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)明顯低于癌旁組織。研究報(bào)道，DIRAS1 屬于腫瘤抑制性小GTP 酶，在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，DIRAS1 通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2；MAPK3/1）和 p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK；MAPK14）發(fā)揮信號(hào)作用，觸發(fā)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）2/9 轉(zhuǎn)錄失活從而抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移。另外其表達(dá)可競(jìng)爭(zhēng)性與SmgGDS 結(jié)合并抑制SmgGDS與其他促進(jìn)惡性腫瘤的小GTP 酶的結(jié)合，從而抑制促惡性腫瘤小GTP 酶的活化。筆者猜測(cè)DIRAS1 可能為ARL4C 上游作用靶點(diǎn)，DIRAS1 的下調(diào)導(dǎo)致對(duì)ARL4C 的抑制作用減弱,從而促進(jìn)睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的發(fā)展。以上結(jié)果提示小GTP 酶ARL4C 可能是睪丸生殖細(xì)胞腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中一個(gè)重要的靶點(diǎn)。

ARL4C 在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中的高表達(dá)為分子靶向治療提供了新的思路，但其在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中更多的作用與機(jī)制仍舊未知，需要筆者未來(lái)進(jìn)一步的探索和發(fā)掘。