離子交換高效液相色譜法測定嬰幼兒奶粉中的核苷酸

□ 張淑瓊 廈門市食品藥品質(zhì)量檢驗研究院

1 引言

核苷酸（Nucleotide）是一類由嘌呤堿或嘧啶堿、核糖或脫氧核糖，以及磷酸這3種物質(zhì)組成的化合物，又稱核甙酸，其對嬰幼兒免疫功能、腸道功能、睡眠、脂類代謝、體格生長等方面起著重要作用［1］。奶粉中補充外源性核苷酸有助于改善人體腸道菌群、維持腸道的形態(tài)學(xué)及功能、促進生長發(fā)育、提高免疫力等，因此近年來一些國家陸續(xù)允許將核苷酸添加到嬰幼兒奶粉中［2］。我國于2005年開始正式允許將核苷酸作為營養(yǎng)強化劑添加到嬰幼兒配方食品中，主要包括胞嘧啶核苷酸（CMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鳥嘌呤核苷酸（GMP）、次黃嘌呤核苷酸（IMP）等?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品營養(yǎng)強化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 14880-2012）規(guī)定，核苷酸作為嬰幼兒配方食品中的食品營養(yǎng)強化劑時允許使用量為0.12g～0.58g/kg（以核苷酸總量計）。本實驗使用陰離子交換高效液相色譜法對上述5種核苷酸進行了同時測定，希望建立一種靈敏度高、干擾少、定量準(zhǔn)確的測定方法，進而滿足相關(guān)部門對嬰幼兒奶粉中核苷酸檢測的要求。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

儀器：高效液相色譜儀（e2695），美國Waters公司；S220型pH計，瑞士Mettler-Toledo公司；超純水純化系統(tǒng)，美國millipore公司。

試劑：胞嘧啶核苷酸（CMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鳥嘌呤核苷酸（GMP）、次黃嘌呤核苷酸（IMP）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，美國Stanford Chemicals公司；甲醇（色譜純），德國默克公司；冰乙酸、乙酸銨（分析純），國藥集團。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制：分別稱取核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品CMP、AMP、UMP各10mg、GMP和IMP各5mg，用超純水溶解轉(zhuǎn)移至同一個100mL容量瓶中，純水定容至刻度。此標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為：CMP、AMP、UMP各100μg/mL，GMP、IMP 各 50μg/mL。

2.2 試驗方法

2.2.1 樣品前處理

稱取混合均勻的固體試樣約5g（精確至0.1mg）置于100mL錐形瓶中，加入20mL熱水（50～60℃）充分溶解試樣，冷卻至室溫。用10%（V/V）醋酸溶液調(diào)試樣溶液pH值至4.1后，將溶液移入50mL容量瓶中，定容，濾紙過濾，所得濾液用0.45μm微膜過濾備用。

2.2.2 液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SAX（4.6mm×250mm，5μm）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10μL；流動相（梯度流脫）A：50mmol/L磷酸二氫鉀水溶液，流動相B：甲醇；梯度：0～25min、40%～100%A，25.0～2 5.1 mi n、100%～40%A，25.1～30min、40%A。

3 結(jié)果與分析

3.1 液相色譜條件的選擇

核苷酸是一類極性較大的化合物，當(dāng)采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中核苷酸測定》（GB 5413.40-2016）方法中的C18-T反相色譜柱進行分析時，很難達到較好的保留和分離，目標(biāo)化合物的檢測也存在雜峰干擾，影響定量。標(biāo)準(zhǔn)方法采用的流動相含有離子對試劑，長期使用不僅對色譜柱的損害較大，還會影響色譜柱的使用壽命。本實驗通過將試樣溶液的pH值調(diào)節(jié)為弱酸性，適當(dāng)增加了溶液中的氫離子活度，促進了核苷酸的電離反應(yīng)，使其在水溶液中呈離子狀態(tài)，從而適用于離子交換分離模式，更可用離子交換色譜柱進行有效分離。

在流動相的選擇上，本試驗考察了不同pH值和不同濃度的磷酸二氫鉀溶液對分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH值越小、分離越差，原因應(yīng)為流動相酸度過大時，氫離子抑制了核苷酸的電離和流動相的電離，進而降低了洗脫能力。當(dāng)流動相pH值大于5時，核苷酸顯現(xiàn)多種電離形式，出現(xiàn)多于待測核苷酸種類的峰型，使分析變得困難。同時，流動相的洗脫能力會隨流動相濃度的增大而增強。因此，實驗需根據(jù)色譜柱的實際使用情況，優(yōu)化流動相濃度以達到合適的保留時間，并保證足夠的分離度。通過優(yōu)化，本試驗選擇pH值為4.1的50mmol/L磷酸二氫鉀水溶液作為流動相，通過梯度洗脫程序，在26min內(nèi)完成了對5種核苷酸的分離。實際樣品測定時，基質(zhì)出峰較早，不會對目標(biāo)物色譜峰產(chǎn)生干擾（色譜圖見圖1）。

圖1 同時測定5種核苷酸的高效液相色譜圖

3.2 方法的線性及檢出限

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)混合溶液2、4、6、8、10mL加純水定容至50mL，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，并以優(yōu)化的液相色譜條件進入高效液相色譜進行分析。以待測核苷酸的濃度為橫坐標(biāo)（X），待測核苷酸峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進行回歸分析，得到線性回歸方程及各待測核苷酸的線性相關(guān)系數(shù)。配制接近檢出限濃度的UMP、AMP、CMP、IMP、GMP標(biāo)準(zhǔn)溶液，計算信噪比，以3倍信噪比計算檢出限（以稱樣5.0g、定容50mL計），結(jié)果見表1。結(jié)果表明，5種核苷酸在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999，檢出限為0.9～2.0mg/kg，可滿足檢測要求。

3.4 回收率及精密度實驗

以金領(lǐng)冠較大嬰兒配方奶粉（6～12月齡，2段）為本底，進行低、中、高濃度加標(biāo)，按“2.2.1”樣品前處理方法處理樣品，每個加標(biāo)水平平行測定6次，計算3個加標(biāo)水平下的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果如表2所示，對奶粉樣品UMP、AMP、CMP、IMP、GMP的 回 收 率 在 78.2%～113.4%，RSD在0.3%～3.7%。結(jié)果表明，該方法具有良好的回收率和精密度，可以滿足對奶粉產(chǎn)品中上述5種核苷酸日常檢測的要求。

表1 5種核苷酸測定的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

表2 5種待測核苷酸在奶粉中的加標(biāo)回收率和精密度

4結(jié)論

本研究通過優(yōu)化高效液相色譜條件的參數(shù)，建立了一種基于離子交換原理的高效液相色譜法同時測定嬰幼兒奶粉中5種核苷酸的方法。該方法具有前處理簡單、干擾少、分析靈敏度高、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點，可滿足奶粉中核苷酸的檢測需求，能夠為乳制品生產(chǎn)企業(yè)核苷酸含量的質(zhì)量控制及食品安全抽樣檢測提供方法技術(shù)支持。