太赫茲頻域光譜用于土壤中敵百蟲的檢測

王 昀，秦堅源，賈生堯，王燕杰，吳 霞

中國計量大學機電工程學院，浙江 杭州 310018

引 言

農藥是指以促成農作物成長，保障農作物健康為目標而生產出的化合物。近年來農藥中毒事件頻出，引發(fā)人們的持續(xù)關注。敵百蟲(Trichlorfon)，是一種適用于谷類作物上咀嚼式口器害蟲防治的有機磷農藥，它能抑制膽堿酯酶，造成神經生理功能紊亂，兼有觸殺作用和滲透活性[1]。若敵百蟲的過量使用，會造成農藥的殘留污染，對人畜安全構成一定威脅，影響人體的器官功能，甚至會增加畸形、基因突變和DNA損傷的發(fā)病率，同時對哺乳動物的生殖及神經細胞具有明顯的毒副作用[2]。

為了保證土壤和食品的安全，現(xiàn)已開發(fā)出多種檢測各種基質中農藥殘留的方法，其中以免疫法和色譜-質譜聯(lián)用法的使用較為常見。Liu等[3]使用免疫法測定了果蔬中的敵百蟲和毒死蜱，敵百蟲的檢出限達到了19 μg·L-1，添加回收率為77.8%～92.0%。Sun等[4]使用色譜-質譜聯(lián)用法測定了6種常見的有機磷農藥(敵百蟲、滅線磷、樂果、殺螟硫磷、對硫磷和倍硫磷)，該方法對敵百蟲的檢出限為0.12 μg·L-1，定量限為0.41 μg·L-1。這些方法需要復雜的預處理和專業(yè)人員的操作，耗時耗力的同時還會對實驗樣品造成損害。因此，急需探索一種簡單、快速及無損的農藥殘留檢測方法用于敵百蟲殘留的檢測。

太赫茲波，在電磁波譜中處在微波和紅外線之間，其頻率范圍為0.1～10 THz，對應的波長范圍是30～3 000 μm。太赫茲輻射的能量很低，不會引起待測物的有害電離反應，從而為化學和生物樣品的無損檢測提供了可能[5]。此外，許多分子的轉動和振動模式都位于太赫茲波段，因此太赫茲光譜包含了豐富的分子結構信息[6]。由于太赫茲波的獨特性質，目前，太赫茲光譜已被應用于生物醫(yī)學診斷[7]、環(huán)境檢測[8]和食品分析[9]等多個領域。太赫茲時域光譜技術是太赫茲光譜中最常用的一種分析方法，已被應用于葡萄糖[10]、鹽酸[11]、氨基酸[12]和抗生素[13]等方面的檢測。太赫茲頻域光譜是近兩年才發(fā)展起來的一種太赫茲光譜技術。相比太赫茲時域光譜技術，太赫茲頻域光譜具有能夠直接記錄樣品的透射信號、無需傅里葉變換和分辨率相對較高的優(yōu)點。因此，太赫茲頻域光譜在檢測領域更具應用潛力。

本研究使用太赫茲頻域光譜檢測了土壤中的敵百蟲。首先采集敵百蟲純品在0.9～2.1 THz頻段的光譜，分析得到了它在該頻段的三個特征吸收峰(1.18，1.55和1.91 THz)。同時借助密度泛函理論計算敵百蟲分子的振動頻率，并與實驗結果進行比對驗證，從而對敵百蟲特征吸收峰的來源進行了解釋。采集了土壤中不同含量敵百蟲的太赫茲光譜，并利用化學計量學中的偏最小二乘算法建模，通過相關系數(shù)，校正均方根誤差、預測均方根誤差和交叉驗證均方根誤差來評價模型的性能，證明了太赫茲頻域光譜技術結合化學計量法對土壤中敵百蟲含量檢測的可行性。

1 實驗部分

實驗所用敵百蟲樣品(99%，CAS：52-68-6)購置于廣州市左克生物科技發(fā)展有限公司，土壤樣品取自青島嶗山。

敵百蟲純品壓片的制備：稱量一定量的敵百蟲樣品，轉移至研缽中充分研磨，然后稱取200 mg樣品，使用壓片機(HY-12，天津天光光學有限公司)在12 MPa的壓力下持續(xù)施壓兩分鐘使其成為厚度約1 mm直徑為13 mm的圓形薄片。

土壤純品壓片的制備：稱量一定量的土壤樣品，轉移至研缽中充分研磨后稱取200 mg樣品，使用壓片機在12 MPa的壓力下持續(xù)施壓兩分鐘使其成為厚度約1 mm直徑為13 mm的圓形薄片。

敵百蟲-土壤混合物壓片的制備：稱量一定量的敵百蟲樣品，轉移至研缽中充分研磨，備用；稱量一定量的土壤樣品，轉移至研缽中充分研磨，備用。分別稱量一定量的研磨后的敵百蟲樣品和土壤樣品，充分混合均勻，使得混合物的總質量為200 mg，且其中敵百蟲的含量分別為0.5%，1%，5%，10%，20%，30%，40%和50%。將每一份的混合物樣品用壓片機在12 MPa的壓力下持續(xù)施壓兩分鐘使其成為厚度約1 mm直徑為13 mm的圓形薄片。為了減少操作誤差，每個含量的混合物樣品制備三個壓片。

采用太赫茲頻域光譜系統(tǒng)(TERASCAN 1550,TOPTICA Photonics Inc,Germany)來對樣品進行光譜測量。該系統(tǒng)主要由DLC智能電子設備、光纖耦合銦鎵砷光混頻器和分布式反饋二極管激光器等組成。如圖1所示，太赫茲信號通過連續(xù)拍頻產生，從拋物面鏡準直，再透過被測樣品被拋物面鏡聚焦到接收器上，然后轉移至信號處理系統(tǒng)加以處理即可得到樣品的相關光譜信息。選擇頻率范圍為0.86～2.26 THz，掃描步長為0.04 GHz。由于水對太赫茲光的強烈吸收，整個實驗過程在室溫狀態(tài)室內濕度保持在4.0%以下。

圖1 太赫茲頻域光譜系統(tǒng)原理圖Fig.1 The schematic diagram of THz-FDS system

樣品的吸收率α可由式(1)得到

α=-lgT

(1)

其中，T為透過率，可由樣品和參考的光電流振幅比較計算所得。

分子的太赫茲吸收峰來源于太赫茲波與分子中原子或官能團的振動/旋轉之間的共振吸收[14]?；诿芏确汉碚摰睦碚撚嬎悖梢杂^察每個吸收峰對應的振動/轉動模式，從而對吸收峰進行解釋。因此利用密度泛函理論的B3LYP/6-31G(d)基組對敵百蟲分子進行了計算，以研究敵百蟲吸收峰的來源。

化學計量學是指利用運用數(shù)學、統(tǒng)計學以及其他相關學科的理論和知識，來完成實驗設計與優(yōu)化和樣品的檢測與分析[15]。使用化學計量學中的偏最小二乘法算法(partial least squares,PLS)建立模型[16]，將所有樣品用于校正集和預測集，通過模型的相關系數(shù)，校正均方根誤差、預測均方根誤差和交叉驗證均方根誤差來評判模型的性能。良好的模型應該具有較為接近1的相關系數(shù)，較低的校正均方根誤差、預測均方根誤差和交叉驗證均方根誤差。

2 結果與討論

采用Gaussian軟件對敵百蟲分子建立結構如圖2所示。為了借助可視化窗口對敵百蟲分子進行吸收峰的來源分析，我們先對敵百蟲分子中所有原子進行標號，其中，序號1，8，9和17為碳原子，序號5，7，13和15為氧原子，序號2，3，4，10，11，12，14和16為氫原子，序號18，19和20為氯原子，序號6為磷原子。

圖3(a)為通過理論計算得到的敵百蟲分子的振動模式(紅線)以及通過實驗測試得到的敵百蟲壓片的吸收光譜(黑線)。其中，紅線的高度代表了振動的強弱。圖3(a)可見，在理論計算中，敵百蟲分子有兩個振動模式，分別位于1.59和1.94 THz處，其中1.59 THz處的振動較強。而實驗測試得到敵百蟲存在三個特征吸收峰，分別位于1.18，1.55和1.91 THz處，其中1.18 THz處的特征峰的強度最大，吸光度達到約2.95；1.91 THz處特征峰的強度次之，吸光度為2.04；而1.55 THz處的特征峰的強度最弱，吸光度只有1.90。對比理論和實驗計算結果可以發(fā)現(xiàn)，理論計算得到的1.59 THz對應于實驗測試得到的1.55 THz處的吸收峰；理論計算得到的1.94 THz對應于實驗測試得到的1.91 THz處的吸收峰。通過Gaussian軟件可視化窗口觀察發(fā)現(xiàn)1.59 THz處的振動模式來源于9，10，11與12號原子組成的甲基的搖擺振動；而1.94 THz處的振動模式來源于17，18，19與20號原子的旋轉振動。值得注意的是，實驗得到的1.18 THz處的吸收峰在理論計算中沒有得到，分析認為原因是理論計算的模型是單分子結構，得到的振動模式是分子內的作用力形成的；而實驗的對象是晶體結構，得到的吸收峰除了分子內作用力，還有分子間作用力的影響。因此，可以推測實驗中1.18 THz處的吸收峰是由分子間的相互作用力形成的。此外，在理論計算中1.94 THz處的振動較1.59 THz處的強一些，但是實驗中1.91 THz處的吸收峰稍弱于1.55 THz處的吸收峰，該現(xiàn)象也歸因于上述原因。由以上結果分析可知，敵百蟲在該頻段的三個特征吸收峰比較明顯的(1.18，1.55和1.91 THz)，可以作為對敵百蟲的定性檢測的依據(jù)。土壤純品壓片的吸收譜如圖3(b)所示。分析認為，土壤在0.9～2.1 THz頻段沒有出現(xiàn)特征吸收峰。隨著頻率的增加，土壤的吸光度也逐漸增加，吸光度值的范圍在0.87～2.33。整條譜線呈現(xiàn)傾斜的背景，這是因為土壤顆粒對太赫茲散射的影響[17]。因為在1.0～1.5 THz頻段，敵百蟲是有特征吸收峰的，而土壤沒有表現(xiàn)處吸收峰，因此推測，在土壤基質中鑒別敵百蟲是可以實現(xiàn)的。

圖2 敵百蟲分子結構圖Fig.2 Molecular structure of trichlorfon

圖3 敵百蟲純品(a)與土壤基質(b)的吸收譜Fig.3 Absorption spectra of (a) trichlorfon and (b) soil

為了驗證太赫茲頻域光譜技術可以實現(xiàn)土壤中的敵百蟲殘留檢測的設想，采集了敵百蟲-土壤混合物壓片的吸收光譜。由于1.18 THz處的吸收峰相比其他兩個吸收峰較清晰而又易于辨認，因此選擇該吸收峰附近的1～1.5 THz頻段對敵百蟲-土壤混合物壓片的吸收光譜進行分析，如圖4所示。在1～1.5 THz范圍內，所有光譜都有傾斜的背景基線，這是因為土壤的吸收導致的。在整個頻段內，可以清楚區(qū)分敵百蟲含量大于或等于20%的壓片樣品，且隨著含量的增加，吸光度增加。在1.18 THz處，可以清楚區(qū)分敵百蟲含量大于或等于10%的壓片樣品，且隨著含量的增加，峰值處的吸光度增加。而敵百蟲含量低于或等于5%的壓片樣品的吸收光譜沒有出現(xiàn)1.18 THz處的特征吸收峰，吸光度值的變化也沒有規(guī)律。分析認為在敵百蟲含量低的壓片中，土壤在混合樣品中占據(jù)主導地位，而由圖3可知土壤的吸光度高于敵百蟲的吸光度，從而土壤的光譜特性掩蓋了敵百蟲的吸收特性，因此無法鑒別土壤中敵百蟲含量低于或等于5%的壓片樣品。

圖4 不同濃度敵百蟲在土壤中的吸收光譜Fig.4 The absorption spectrum of different contents of trichlorfon in soil

研究中借助化學計量學方法來進一步對土壤中敵百蟲含量進行分析。由于實驗環(huán)境的微小變化和其他情況都可能對實驗結果造成影響，對全部實驗結果加以研究可能導致誤差或者增加額外的工作量，因此選取主成分分析方法來降低數(shù)據(jù)的維數(shù)?？紤]到敵百蟲的特征峰和高信噪比信號，選取1 174.44～1 193.24 THz頻段的光譜進行偏最小二乘法建模，如圖4虛線框所示。該模型包含8個含量的24個壓片樣本。

圖5 偏最小二乘法模型對土壤中的敵百蟲含量的預測Fig.5 Content prediction of trichlorfon in soil by PLS model

其中17個樣本(8個濃度，0.5%，1%，5%，10%，20%，30%，40%和50%)作為校正集，剩余7個樣本(5個濃度，5%，10%，20%，30%和40%)作為預測集。模型分析結果如圖5所示。圖5(a)中，對角虛線表示為預測值和實際值差值為0，模型的預測集和校正集均靠近對角虛線，表現(xiàn)了預測集和校正集之間良好的線性關系。圖5(b)，虛線表示零誤差線，誤差度范圍為-0.04～0.04，模型的誤差較小。該模型具有相對較高的相關系數(shù)(>0.993 04)，較低的校正均方根誤差(<0.021 9)、預測均方根誤差(<0.024 6)和交叉驗證均方根誤差(<0.028 6)。

3 結 論

提出了一種基于太赫茲頻域光譜技術結合化學計量學檢測土壤中敵百蟲含量的新方法。通過使用太赫茲頻域光譜技術得到了敵百蟲樣品的吸收峰分別為1.18，1.55和1.91 THz，其中吸光度最大的吸收峰在1.18 THz，在1.55 THz的吸收峰吸光強度最弱。將敵百蟲分子的理論計算的吸收峰與實驗吸收峰進行了比對，對敵百蟲的吸收峰來源進行了解釋，證實了實驗的準確性。對不同含量的敵百蟲-土壤混合樣品光譜的研究發(fā)現(xiàn)，1.18 THz處的吸光度隨著敵百蟲的含量的增加而增大，對混合樣品使用偏最小二乘法建模，模型獲得了滿意的結果(R>0.993 04，RMSEC<0.021 9，RMSEP<0.024 6，RMSECV<0.028 6)。結果表明，該方法可以有效對土壤中的敵百蟲進行定性和定量分析。證明了太赫茲頻域光譜技術結合化學計量學方法在土壤的農藥殘留檢測中極具應用潛力，從而為環(huán)境檢測提供了一種新思路。