海洋酸化對(duì)泥蚶精子運(yùn)動(dòng)的影響及作用機(jī)理初探

施 巍 韓 毓 閆茂倉(cāng) 黃賢克 胡利華 柴雪良 劉廣緒

(1. 浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院, 杭州 310058; 2. 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所, 溫州 325005)

自工業(yè)革命以來(lái), 人類大量使用化石燃料以及森林的砍伐等活動(dòng)導(dǎo)致大氣中二氧化碳(CO2)濃度不斷上升。據(jù)統(tǒng)計(jì), 大氣中的CO2濃度已從工業(yè)革命前的280 ppm(標(biāo)準(zhǔn)大氣壓比)增長(zhǎng)了約40%, 目前已達(dá)到了近400 ppm[1,2]。由于海洋與大氣間存在著持續(xù)不斷的氣體交換, 大氣中的CO2會(huì)不斷溶入海洋, 進(jìn)而造成海水變酸, 即“海洋酸化”現(xiàn)象[3]。根據(jù)聯(lián)合國(guó)政府間氣候變化專門委員會(huì)(Intergovernmental Panel on Climate Change, IPCC)預(yù)測(cè), 如果不能大幅度減少CO2的排放速度, 全球表層海水的pH會(huì)在本世紀(jì)末降至7.8, 而這一數(shù)值將在2300年繼續(xù)降到7.4[3]。由于棲息于更易受空氣CO2濃度變化影響的近岸環(huán)境, 海洋貝類尤其是潮間帶雙殼貝類被認(rèn)為是最先和最容易受到海洋酸化影響的物種之一, 因此這些物種對(duì)海洋酸化的響應(yīng)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[4—6]。目前的相關(guān)研究表明,未來(lái)海洋酸化情景能對(duì)海洋貝類的受精、胚胎發(fā)育、生物鈣化和生理代謝等諸多生命過(guò)程產(chǎn)生不利影響, 進(jìn)而對(duì)海洋貝類及其所處的生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成嚴(yán)重威脅[7—9]。

大多數(shù)海洋雙殼貝類通過(guò)廣播式體外受精進(jìn)行繁殖, 其直接將配子排放到開放的水體中, 受精率主要依賴于配子在水體中的相互作用[10]。根據(jù)海洋無(wú)脊椎動(dòng)物受精動(dòng)力學(xué)模型, 貝類精子的游動(dòng)速度越快也就意味著單位時(shí)間內(nèi)其與水體中卵子相遇的概率越大, 受精的幾率更高[11,12]。雖然之前的研究表明, 海洋酸化顯著抑制海洋貝類精子的運(yùn)動(dòng)能力, 但迄今為止該影響的細(xì)胞與分子作用機(jī)理仍知之甚少[7,13]。

眾所周知, 精子運(yùn)動(dòng)主要依靠ATP供能, 而精子細(xì)胞內(nèi)絕大部分ATP是由線粒體通過(guò)三羧酸循環(huán)經(jīng)無(wú)氧糖酵解途徑產(chǎn)生的[14]。糖酵解效率由每一步反應(yīng)對(duì)應(yīng)的催化酶調(diào)控, 而這些酶的活性和催化能力大多都與細(xì)胞內(nèi)的pH密切相關(guān)。此外, 精子尾部存在大量Ca2+-ATP酶(Ca2+-ATPase), 該酶調(diào)節(jié)了精子內(nèi)Ca2+水平和精子生理功能[15,16]。之前的研究表明, Ca2+-ATPase的缺失或活力降低都將導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)能力的衰減[15,16]。盡管海洋酸化已被證實(shí)會(huì)影響到海洋生物細(xì)胞內(nèi)的pH和離子平衡[8], 但海洋酸化是否通過(guò)影響海洋貝類精子ATP合成及Ca2+-ATPase酶活, 進(jìn)而導(dǎo)致精子活力降低, 還有待進(jìn)一步研究證明。

泥蚶(Tegillarca granosaLinnaeus), 俗稱“血蚶”, 屬軟體動(dòng)物門(Mollusca), 瓣鰓綱(Lamellibranchia), 列齒目(Taxodonta), 蚶科(Arcidae), 廣泛分布于印度洋與西太平洋近岸海域, 是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類物種之一[17—19]。針對(duì)海洋酸化影響精子運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞與分子機(jī)理尚不明晰的現(xiàn)狀, 本研究以泥蚶為研究對(duì)象, 根據(jù)IPCC所預(yù)測(cè)的2100年和2300年海洋酸化情景, 分析了未來(lái)海洋酸化條件(pH7.8和7.4)對(duì)泥蚶精子運(yùn)動(dòng)的影響, 并通過(guò)對(duì)比不同海洋酸化條件下泥蚶精子ATP合成中關(guān)鍵酶及Ca2+-ATPase酶活力等指標(biāo), 探討了其影響精子運(yùn)動(dòng)的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 泥蚶的采集與暫養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用的性成熟泥蚶[殼長(zhǎng)(35.6±4.33) mm]于2014年6月取自浙江省溫州市樂清灣(東經(jīng)121°,北緯28°), 隨后被轉(zhuǎn)移至浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所(清江試驗(yàn)站)。經(jīng)海水小心沖洗除去殼表污物后, 將泥蚶于室內(nèi)2000 L大桶中流水暫養(yǎng)一周[海水pH為8.07±0.07, 鹽度為(21.2±0.1)‰, 溫度為(26±3)℃]。在暫養(yǎng)過(guò)程中, 桶內(nèi)海水保持連續(xù)充氣, 每日早中晚定時(shí)投喂活體扁藻(Platymonas subcordiformis，密度為2×104個(gè)/mL)三次, 以保證泥蚶處于適宜的性成熟狀態(tài)。

1.2 海洋酸化模擬與參數(shù)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)pH海水處理組, 其中對(duì)照組使用正常海水(pH8.1), 另根據(jù)IPCC的預(yù)測(cè)設(shè)置兩個(gè)海洋酸化模擬實(shí)驗(yàn)組(pH分別為7.8和7.4)。對(duì)照組充入除濕后的空氣, 而酸化海水則通過(guò)加富CO2的方式制備[9,20]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, 海水的pH通過(guò)Sartorius PB-10型pH計(jì)監(jiān)測(cè), 溫度和鹽度使用WTW Multi 3410型多參數(shù)水質(zhì)分析儀測(cè)得。同時(shí)實(shí)驗(yàn)期間每半小時(shí)使用電位滴定法測(cè)定一次實(shí)驗(yàn)海水的總堿度[21]。利用實(shí)驗(yàn)測(cè)得的海水pH、鹽度、總堿度和溫度, 結(jié)合部分已知常量, 使用開源軟件CO2SYS計(jì)算得出實(shí)驗(yàn)過(guò)程中海水的碳酸鹽體系組分和文石(Ωara)與方解石飽和度(Ωcal)參數(shù)[22]。各組海水的理化參數(shù)如表1所示。

1.3 泥蚶精子的收集與酸化處理

根據(jù)之前報(bào)道的催產(chǎn)方法, 泥蚶精子通過(guò)陰干和溫度刺激法獲得[9,23]。在實(shí)驗(yàn)前一晚, 將大小均一的泥蚶從暫養(yǎng)桶內(nèi)撈出, 沖刷干凈后置于23℃的空調(diào)房陰干過(guò)夜。次日將每個(gè)泥蚶個(gè)體單獨(dú)置于裝有500 mL過(guò)濾海水的燒杯中進(jìn)行催產(chǎn), 期間燒杯中保持持續(xù)充氣。待泥蚶開始排放配子后停止充氣, 待大約45min后收集精子懸浮液, 在顯微鏡(Nikon,Eclipse E600)下檢查精子質(zhì)量, 并用血球計(jì)數(shù)板測(cè)量精子濃度。每份精子樣品均至少測(cè)定三次以減少取樣誤差[24]。為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性, 實(shí)驗(yàn)中舍棄活力低下和濃度過(guò)低的精子樣品。

為避免泥蚶個(gè)體差異帶來(lái)誤差, 實(shí)驗(yàn)中將來(lái)自同一個(gè)泥蚶個(gè)體的精子樣品均分為三份, 然后分別施以對(duì)照或酸化處理。酸化處理1h后, 取各組精子樣品用于后續(xù)對(duì)比分析。

1.4 精子運(yùn)動(dòng)速度分析

相應(yīng)實(shí)驗(yàn)處理1h后, 取100 μL精子懸液置于單凹載玻片上, 并蓋上載玻片以減少器壁效應(yīng)(Walleffect)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[25]。隨后樣品置于裝有錄像系統(tǒng)(DXM1200F, Nikon)的顯微鏡(Eclipse E600,Nikon)下以200×放大倍數(shù)進(jìn)行觀察并對(duì)精子運(yùn)動(dòng)情況進(jìn)行錄像(至少30s)。使用開源軟件ImageJ(版本1.46r)中的計(jì)算機(jī)輔助精子分析(Computer Aided Sperm Analysis, CASA)插件, 對(duì)錄像數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。通過(guò)測(cè)定精子在不同時(shí)間點(diǎn)的位置坐標(biāo), 構(gòu)建運(yùn)動(dòng)軌跡, 進(jìn)而計(jì)算得到各組精子運(yùn)動(dòng)的曲線運(yùn)動(dòng)速度(VCL)、平均路徑速度(VAP)和直線速度(VSL)[10,12]。本研究共檢測(cè)了來(lái)自15個(gè)泥蚶個(gè)體的精子樣品在不同處理后的運(yùn)動(dòng)情況(共計(jì)45份精子樣品)。

表1 對(duì)照組與酸化實(shí)驗(yàn)組的海水理化參數(shù)值(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab. 1 Chemical parameters of seawater in the control and experiment groups (Mean±SE)

1.5 泥蚶精子ATP含量測(cè)定

經(jīng)酸化處理1h后, 每個(gè)處理組取90 mL精子樣品置于離心管中, 于離心機(jī)(5810R, Eppendorf)中以3000 r/min離心2min, 棄上清獲得精子用于ATP含量測(cè)定。首先采用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0006, 碧云天), 按照試劑盒提供的方法對(duì)泥蚶精子蛋白濃度進(jìn)行定量。隨后使用ATP含量測(cè)定試劑盒(A095-1, 南京建成), 利用分光光度計(jì)(UV-2100, 上海菁華)測(cè)量樣品在636 nm波長(zhǎng)處0.5 cm光徑的吸光度值, 并按照以下公式計(jì)算得到各樣品的ATP濃度值(μmol/g prot)。

1.6 精子丙酮酸激酶(PK)和磷酸果糖激酶(PFK)酶活測(cè)定

本研究使用丙酮酸激酶測(cè)定試劑盒(A076-1,南京建成)對(duì)不同處理組泥蚶精子的丙酮酸激酶(PK)活力進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)試劑盒的操作要求加樣并混勻后, 在340 nm波長(zhǎng)0.5 cm光徑處測(cè)定樣品在30s時(shí)初始吸光值(A1)。隨后加入反應(yīng)液, 37℃水浴15min, 測(cè)定反應(yīng)后樣品的吸光值(A2)。按照以下公式計(jì)算PK酶活力。

將37℃下每克組織蛋白每分鐘將1 μmol的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)轉(zhuǎn)變成丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位(UPK)。

與之類似, 利用磷酸果糖激酶測(cè)試盒(A129, 南京建成)對(duì)樣品的磷酸果糖激酶(PFK)活力進(jìn)行測(cè)定。按照試劑盒說(shuō)明書操作要求加入試劑于1 mL比色皿后, 記錄樣品在340 nm波長(zhǎng)下20s時(shí)的初始吸光值(A1)和10min 20s時(shí)的吸光值(A2)。隨后按照以下公式計(jì)算PFK酶活力。

1.7 泥蚶精子Ca2+-ATPase酶活測(cè)定

本研究使用超微量Ca2+-ATPase酶測(cè)定試劑盒(A070-4, 南京建成)對(duì)不同處理后的泥蚶精子Ca2+-ATPase活性進(jìn)行測(cè)定。按照試劑盒所述的操作步驟, 加樣完畢后, 利用分光光度計(jì)測(cè)定對(duì)照與樣品在636 nm波長(zhǎng)處0.5 cm光徑的吸光值, 并通過(guò)以下公式計(jì)算得到Ca2+-ATPase酶活值。

將每小時(shí)每毫克細(xì)胞蛋白的細(xì)胞中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無(wú)機(jī)磷的量定義為一個(gè)ATP酶活力單位, 即μmol磷/ g (prot ·h,) UATPase。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Levene檢驗(yàn)和Shapiro-Wilk檢驗(yàn)來(lái)分別判斷數(shù)據(jù)是否符合方差齊性和正態(tài)性分布, 對(duì)不符合的數(shù)據(jù)進(jìn)行平方根反正弦變換以滿足相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析要求。通過(guò)單因素方差分析(One-way ANOVA)檢測(cè)泥蚶精子的運(yùn)動(dòng)速度、ATP含量及PK、PFK和Ca2+-ATPase酶活力在各實(shí)驗(yàn)組間的差異。并通過(guò)Tukey檢驗(yàn)(Post-hoc Tukey tests)進(jìn)行多重比對(duì),明確組間的顯著性差異。所有統(tǒng)計(jì)分析均在R統(tǒng)計(jì)分析軟件(Rdevelopment Core Team, 2012)中進(jìn)行,以P＜0.05作為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 海洋酸化對(duì)泥蚶精子運(yùn)動(dòng)速度的影響

與對(duì)照相比, 海洋酸化處理導(dǎo)致泥蚶精子運(yùn)動(dòng)速度顯著降低(P＜0.05), 且該影響隨著酸化程度的提高而顯著增強(qiáng)。經(jīng)過(guò)pH7.8的酸化海水處理后,泥蚶精子的VCL、VAP和VSL分別降至對(duì)照組的82.5%、62.8%和76.2%。隨著海水pH的進(jìn)一步下降(pH7.4), 泥蚶精子VCL、VAP和VSL分別進(jìn)一步降至僅為對(duì)照組的66.9%、53.3%和54.7%(表2)。

2.2 海洋酸化對(duì)泥蚶精子ATP含量的影響

單因素方差分析結(jié)果顯示, 海洋酸化導(dǎo)致泥蚶精子ATP含量顯著下降(P＜0.05)。如圖1所示, 經(jīng)海洋酸化處理1h后, 泥蚶精子ATP含量在pH7.8和7.4處理組中分別下降至對(duì)照組的62.9%和35.6%,說(shuō)明泥蚶精子供能在海洋酸化的條件下被顯著抑制。

2.3 海洋酸化對(duì)磷酸果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PK)酶活的影響

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明, 海洋酸化顯著抑制了泥蚶精子PFK和PK的酶活力(P＜0.05)。ANOVA與Tukey檢驗(yàn)顯示pH7.8和7.4酸化實(shí)驗(yàn)組的泥蚶精子PFK活力顯著低于對(duì)照組, 分別只有對(duì)照組的76.9%和45.8%(圖2)。與之類似, 在經(jīng)pH7.8和7.4的海水酸化處理1h后, 泥蚶精子的PK酶活力也分別相較于對(duì)照組顯著下降了33.1%和50.0%(圖3)。

表2 海洋酸化對(duì)泥蚶精子運(yùn)動(dòng)速度的影響(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab. 2 Effects of ocean acidification on the sperm motility of T.granosa (Mean±SE)

圖1 海洋酸化對(duì)泥蚶精子ATP含量的影響(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Fig. 1 Effects of ocean acidification on the ATP content in T.granosa sperm (Mean±SE)

圖2 海洋酸化對(duì)泥蚶精子磷酸果糖激酶(PFK)酶活力的影響(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Fig. 2 Effects of ocean acidification on the on the activities of 6-phosphofructokinase (PFK) in T. granosa sperm (Mean±SE)

圖3 海洋酸化對(duì)泥蚶精子丙酮酸激酶(PK)酶活力的影響(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Fig. 3 Effects of ocean acidification on the activities of pyruvate kinase (PK) in T. granosa sperm (Mean±SE)

2.4 海洋酸化對(duì)泥蚶精子Ca2+-ATP酶活的影響

單因素方差分析顯示, 海洋酸化處理顯著抑制了泥蚶精子Ca2+-ATPase活力(P＜0.05)。雖然與對(duì)照相比, 泥蚶精子Ca2+-ATPase活力在經(jīng)pH7.8的酸化海水處理后并未發(fā)生顯著性變化(P＞0.05), 但pH7.4的海水酸化處理后導(dǎo)致泥蚶精子Ca2+-ATPase活力顯著下降了60.2%(P＜0.05, 圖4)。

圖4 海洋酸化對(duì)泥蚶精子Ca2+-ATPase酶活影響(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Fig. 4 Effects of ocean acidification on the activities of Ca2+-ATPase in T. granosa sperm (Mean±SE)

3 討論

無(wú)論是在哺乳動(dòng)物或者海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中, 精子運(yùn)動(dòng)速度都是衡量雄性生育能力的一個(gè)重要指標(biāo)[11,26]。本研究發(fā)現(xiàn), 未來(lái)海洋酸化情景能顯著削弱泥蚶精子的運(yùn)動(dòng)速度(包括VCL、VSL和VAP)。根據(jù)受精動(dòng)力學(xué)模型, 泥蚶精子運(yùn)動(dòng)速度的降低意味著其與散布在三維水體內(nèi)的卵子相遇幾率的下降,這無(wú)疑會(huì)導(dǎo)致其受精率的降低[10,12]。盡管類似的結(jié)果在太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)、紫海膽(Heliocidaris erythrogramma)和指形鹿角珊瑚(Acropora digitifera)等物種中已有報(bào)道[27,28,39], 但海洋酸化影響海洋無(wú)脊椎動(dòng)物精子運(yùn)動(dòng)能力的作用機(jī)理一直沒有定論。根據(jù)本研究所得到的結(jié)果, 海洋酸化影響泥蚶精子運(yùn)動(dòng)能力的原因可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行初步解釋。

首先, 海洋酸化可能通過(guò)阻礙泥蚶精子的激活來(lái)?yè)p害其運(yùn)動(dòng)能力。體外受精的魚類、貝類的精子在精巢或精漿內(nèi)一般處于靜止?fàn)顟B(tài), 只有當(dāng)釋放到適宜的水體環(huán)境中才被激活[30,31]。因此, 水體環(huán)境鹽度、溫度和pH等理化條件的變化有可能造成精子激活失敗和運(yùn)動(dòng)能力減弱[32,33]。已有研究證實(shí), 泥蚶精子的激活同樣受到外界海水pH的調(diào)節(jié)和影響。例如, 當(dāng)環(huán)境水體的pH由8下降到7.5時(shí), 泥蚶精子的激活率、總運(yùn)動(dòng)時(shí)間和激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間都會(huì)明顯降低[34]。鑒于此, 海洋酸化很可能會(huì)干擾泥蚶精子的正常激活, 從而導(dǎo)致其運(yùn)動(dòng)能力的下降。

其次, 海洋酸化能影響精子供能系統(tǒng), 阻礙精子尾部的擺動(dòng), 最終削弱精子的游動(dòng)能力。眾所周知, 精子的運(yùn)動(dòng)時(shí)主要是由其細(xì)胞內(nèi)的線粒體產(chǎn)生ATP以供給能量, 因此精子線粒體ATP的合成效率對(duì)保障其活力至關(guān)重要。之前有研究報(bào)道, 海膽(Centrostephanus rodgersii)精子的線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential, MMP)在海洋酸化的條件下會(huì)顯著降低, 這將導(dǎo)致精子的ATP合成酶在酸化條件下無(wú)法利用質(zhì)子梯度的勢(shì)能偶聯(lián)合成ATP[35]。本研究也發(fā)現(xiàn), 經(jīng)酸化處理后的泥蚶精子ATP含量較對(duì)照組有顯著下降。同時(shí), 由于PFK和PK是糖酵解的關(guān)鍵酶, 對(duì)糖酵解合成ATP速率的控制和調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵的作用[36,37], 因此本研究中發(fā)現(xiàn)的酸化導(dǎo)致PFK和PK活力顯著降低, 將無(wú)疑會(huì)抑制精子ATP的合成并進(jìn)而影響精子的運(yùn)動(dòng)。

此外, 海洋酸化還可能干擾了精子的胞內(nèi)Ca2+調(diào)控, 從而影響了其運(yùn)動(dòng)能力。大量研究證實(shí),Ca2+通過(guò)介導(dǎo)精子質(zhì)膜表面的Ca2+通道對(duì)精子運(yùn)動(dòng)進(jìn)行調(diào)控, 隨后通過(guò)改變動(dòng)力蛋白臂的滑動(dòng), 使精子鞭毛不停擺動(dòng)并調(diào)節(jié)其運(yùn)動(dòng)的對(duì)稱性[16,38—40]。根據(jù)報(bào)道, 胞外pH水平能影響Ca2+的內(nèi)流及其胞內(nèi)濃度[8,41]。例如, 當(dāng)外界的pH由7.5降至6.5時(shí), 小鼠突觸小體中Ca2+的內(nèi)流會(huì)被顯著抑制[41]。同樣的,在海洋酸化的條件下, 泥蚶血淋巴內(nèi)的Ca2+濃度也會(huì)隨著海水pH的下降而明顯降低[8]。因此, 海洋酸化也很有可能導(dǎo)致精子胞內(nèi)Ca2+紊亂, 從而削弱其運(yùn)動(dòng)能力[41]。另一方面, Ca2+-ATPase在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的精子中維持著胞內(nèi)Ca2+濃度的穩(wěn)定, 并在精子的運(yùn)動(dòng)及受精過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[42]。例如, 用Ca2+-ATPase抑制劑5(6)-carboxyeosin處理海膽精子會(huì)導(dǎo)致精子胞內(nèi)Ca2+濃度變化并造成鞭毛運(yùn)動(dòng)能力喪失[42]。在本研究中, 海洋酸化處理后的泥蚶精子的Ca2+-ATPase活力顯著下降, 這意味著海洋酸化很有可能會(huì)因此打破精子胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài), 干擾其對(duì)本已有限的ATP能量的利用, 從而導(dǎo)致其運(yùn)動(dòng)能力的顯著下降。

綜上所述, 本研究表明海洋酸化可能通過(guò)阻礙精子供能以及干擾精子運(yùn)動(dòng)調(diào)控, 進(jìn)而抑制泥蚶精子的運(yùn)動(dòng)能力, 繼而降低泥蚶精卵碰撞的概率, 最終影響泥蚶的受精過(guò)程及其種群繁衍。