肌間刺缺失對斑馬魚骨骼發(fā)育的影響

楊 建 佟廣香 鄭先虎 孫志鵬 呂偉華 孫效文 匡友誼

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所, 哈爾濱 150070; 2. 上海海洋大學水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心, 上海 201306)

與其他脊椎動物相同, 斑馬魚(Danio rerio)的骨骼也是由軟骨和硬骨兩種組織組成的, 其中軟骨是由軟骨細胞組成, 硬骨則是由成骨細胞和破骨細胞構成。軟骨細胞和成骨細胞均起源于間充質(zhì)細胞, 破骨細胞起源于髓單核細胞系[1]。間充質(zhì)細胞在接收到分子信號后, 遷移至特定的部位, 隨后這些間充質(zhì)細胞緊密濃縮形成成骨、軟骨的原基。在骨骼發(fā)育過程中, 這些原基會分泌一些轉(zhuǎn)錄因子,如TGF-β家族的多肽等, 用于起始和調(diào)控早期骨骼發(fā)育相關因子的表達[2—4]。其中, 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins, BMPs)是TGF-β超家族的一類生長因子。bmp2a、bmp4是BMPs家族的成員,bmp2a可促進間充質(zhì)細胞分化形成成骨骨細胞, 缺少bmp2a會抑制骨祖細胞向骨細胞的分化;bmp4是軟骨內(nèi)骨化的早期因子, 在原始間充質(zhì)細胞、軟骨細胞和骨膜形成層、骨髓腔等部位均有表達[5—7]。此外, SMADs蛋白家族(Mothers against decapentaplegic protein, SMADs)是TGF-β超家族的重要細胞因子。研究認為BMPs信號通路的調(diào)控主要是依賴SMAD基因家族來引發(fā)細胞應答[8—10]; 其中,smad1是BMPs的通路受體底物, 能被BMP-I型受體磷酸化而被激活, 磷酸化的R-SMADs與受體分離, 而與smad4結合形成復合物, 隨后這一蛋白異二聚體進入核內(nèi), 與相關的轉(zhuǎn)錄基因結合并調(diào)控下游基因的表達[11—13], 如runx2a(runt-related transcription factor 2a)。runx2a是一種成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子,其表達是間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化的重要標志。研究認為, 成骨細胞分化初期, runx2a起始骨基質(zhì)蛋白的生成, 從而使成骨細胞向骨細胞轉(zhuǎn)化[14,15]。sp7(也稱osterix)是成骨細胞分化和骨骼形成的標記基因,runx2a能夠促進sp7基因的表達[14]。

肌間刺是影響鯉科魚類品質(zhì)的重要因素之一,是鯉科魚類遺傳育種的重要目標性狀, 但因肌間刺位于體內(nèi), 科學家認為其起到支撐肌肉和力量傳遞的作用, 對肌間刺是否能進行選育, 以及肌間刺缺失后是影響否生長、脂肪酸、肌纖維等其他性狀的形成仍存在疑問。為探討這些問題, 本實驗室采用基因敲除和遺傳篩選技術, 獲得了1個可穩(wěn)定遺傳的斑馬魚肌間刺完全缺失突變系, 本研究利用該突變系和野生型斑馬魚, 從胚胎發(fā)育5個發(fā)育時期(3、6、12、24和72hpf)和胚后5個生長階段(15、30、45、60和75dpf), 對比分析了6個骨骼發(fā)育相關基因(bmp2a、bmp4、smad1、smad4a、runx2a和sp7)的表達差異; 并結合胚后發(fā)育兩種肌間刺表型骨骼發(fā)育的情況, 初步評估了肌間刺缺失對斑馬魚除肌間刺外, 其他骨骼發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗魚準備

為了去除遺傳背景不同帶來的影響, 將基因敲除后獲得的斑馬魚肌間刺完全缺失突變型個體與野生型AB系個體雜交, 構建F2代家系。F2代家系自交可分別獲得25%的野生型、25%的突變型純合個體和50%雜合個體。將野生型個體和純合突變個體分別按雌∶雄比例1∶1構建實驗家系, 分別獲得14個突變型家系和13個野生型家系。養(yǎng)殖3個月后達到性成熟, 按家系配對繁殖并將受精卵置于28℃培養(yǎng)箱中孵化。破膜4d(即8dpf)后的仔魚置于靜水中養(yǎng)殖, 用草履蟲飼喂至20dpf, 轉(zhuǎn)入斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中, 并用豐年蟲投喂, 養(yǎng)殖水溫(27±1)℃, 光周期14 L∶10 D。

1.2 骨骼染色觀察

選擇3個野生型家系和3個突變型家系, 用于骨骼染色試驗。自8dpf開始, 至56dpf截止, 每隔6d采樣一次, 各家系隨機選擇5尾試驗魚用多聚甲醛固定。其中, 8—26dpf仔稚魚用4%多聚甲醛固定,32—56dpf幼魚用2%多聚甲醛固定, 避光保存2d。

采用阿爾新藍—茜素紅雙染色法進行骨骼染色。操作步驟如下: (1)8—26dpf 仔稚魚: a)脫水: 去除固定液, 用50%乙醇脫水, 輕微搖勻10min; b)染色: 將浸泡過的樣本用阿爾新藍-茜素紅混合液 (10 μL 0.5%的茜素紅溶液加入到1 mL 0.4%的阿爾新藍工作液混合) 染色過夜; c)漂白: 去除染液, 用蒸餾水洗去浮色, 加入漂白液(3%雙氧水, 2%氫氧化鉀溶液等體積混合配制), 室溫放置20min; d)透明: 去除漂白液, 用硬毛筆輕輕剝離魚體表面鱗片, 用透明劑Ⅰ(40%甘油與0.5%氫氧化鉀溶液等體積混勻配制)處理至魚體透明, 用透明劑Ⅱ(甘油與0.5%氫氧化鉀溶液等體積混勻配制)透明至透明劑不再變色;e)保存: 透明后的樣本于50%甘油和0.1%氫氧化鉀混合液中4℃長期保存。(2)32—56dpf 幼魚: a)脫水: 與仔稚魚相同; b)阿爾新藍染色: 去除50%乙醇, 用0.4%阿爾新藍染色1d; c)復水: 用50%和30%乙醇分別復水10min, 用去離子水清洗2h; d)消化: 用50 mg/mL的胰蛋白酶溶液消化過夜, 至日光燈下可見脊椎骨為宜; e)漂白: 同仔稚魚; f)透明與保存: 同仔稚魚。

用Olympus SZX2-TR30顯微成像系統(tǒng)觀察斑馬魚在不同生長階段骨骼發(fā)育情況。

1.3 基因表達檢測

胚胎發(fā)育階段: 按照斑馬魚胚胎發(fā)育分期[16],并結合鏡檢結果, 在受精后3(囊胚期)、6(原腸胚期)、12(體節(jié)期)、24(咽囊期)和72hpf(孵化期)5個發(fā)育時期采集胚胎樣本。隨機選擇3個突變型家系與3個野生型家系, 每個家系隨機選取發(fā)育正常的受精卵50粒, 用于總RNA的提取。胚后生長階段:隨機選擇3個野生型家系和3個突變型家系分5個生長階段(15、30、45、60和75dpf)進行骨骼樣品采集, 各家系子代隨機選擇3尾試驗魚, 冰凍處死后于冰上去除內(nèi)臟、皮膚和肌肉等組織, 每個家系做1個混樣, 用于總RNA提取。采用Trizol法提取(Invitrogen, USA)總RNA, 采用High Capacity cDNA Reverse Transcription kits(Roache, USA)合成cDNA。

采用qRT-PCR方法檢測6個基因(bmp2a、bmp4、smad1、smad4a、runx2a和sp7)的表達水平,擴增引物采用Primer3 plus設計(表1)。采用10 μL反應體系進行qRT-PCR實驗, 包括: 5 μL 2×Luna Universal qPCR Master Mix(NEB, USA), 0.25 μL 10 μmol/L的正向、反向引物, 1 μL 50 ng/μL cDNA,3.5 μL nuclease-free水。擴增條件為: 95℃預變性60s; 之后, 95℃變性15s, 60℃延伸30s, 循環(huán)40次。以gapdh為內(nèi)參基因。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法[17]評估6個骨骼發(fā)育相關基因的表達水平, 采用T檢驗評估肌間刺缺失突變型個體和野生型個體間6個基因在胚胎發(fā)育和胚后發(fā)育每個時期中的表達水平和時序表達差異(P＜0.05)。

表1 骨骼發(fā)育相關基因引物設計Tab. 1 Skeletal development related gene primers for qRT-PCR

2 結果

2.1 骨骼染色

染色結果顯示, 斑馬魚野生型與突變型個體除肌間刺外, 其他骨骼的發(fā)育基本保持一致。

(1)8dpf: 耳石已經(jīng)骨化; 頭部骨骼、脊椎仍為軟骨狀態(tài), 脊椎四周有規(guī)則的凹凸, 髓弓、脈弓和尾椎以軟骨形式出現(xiàn), 并由頭部向尾部發(fā)展(圖版Ⅰ-1、2)。(2)14dpf: 部分脊椎硬骨化, 并由頭部向尾部發(fā)展, 硬骨化的椎體約5—8個; 頭部骨骼如下咽骨開始出現(xiàn)部分硬骨化(圖版Ⅰ-3、4)。(3)20dpf:硬骨化的脊椎向尾部增加至20個左右, 頭部下咽骨硬骨化范圍增大, 前上頜骨和鰓蓋邊緣開始硬骨化(圖版Ⅰ-5、6)。(4)26dpf: 脊椎硬骨化的范圍擴大至約30個椎體, 前部骨節(jié)肋骨開始骨化, 尾鰭的鰭條基骨和鰭條骨也逐步開始硬骨化; 頭部鰓弓, 眼眶骨, 開始硬骨化(圖版Ⅰ-7、8)。(5)32dpf: 椎骨基本完成硬骨化, 肋骨、髓棘和脈棘骨化長度變大,尾鰭鰭條骨骨化完成, 背鰭和臀鰭的鰭條骨也開始逐步骨化, 棘和支鰭骨仍呈軟骨狀態(tài), 頭部上頜弓、前鰓蓋骨、鰓蓋骨和方骨等基本完成骨化(圖版Ⅰ-9、10)。(6)38dpf: 尾鰭骨化基本完成, 背鰭和臀鰭的鰭條和深入肌肉的棘硬骨化變長, 胸鰭開始骨化, 突變型腹鰭骨化早于野生型; 頭部前上頜骨、下咽骨、上眶骨、淚骨、眶骨、方骨、鰓蓋骨、下腮蓋骨、鰓條骨、前鰓骨等均已骨化, 頂部額骨、顱頂骨、外枕骨等仍未完全骨化(圖版Ⅰ-11、12)。(7)44dpf: 背鰭、臀鰭和腹鰭鰭條骨骨化基本完成, 僅余鰭條骨與支鰭骨連接的部位未骨化;野生型個體頭部僅剩顱頂骨未完全骨化, 突變型頭部骨化基本完成; 野生型個體肌間刺由尾部向魚體前部逐步骨化, 腹部骨化快于背部, 突變型斑馬魚無肌間刺骨化現(xiàn)象(圖版Ⅰ-13、14)。(8)50dpf: 野生型個體顱頂骨完全硬骨化, 腹部肌間刺基本骨化完成, 背部肌間刺骨化至背鰭前, 突變型斑馬魚肌間刺未出現(xiàn)骨化現(xiàn)象(圖版Ⅰ-15、16)。(9)56dpf:全身骨骼基本骨化完成, 僅剩背鰭、臀鰭、尾鰭少數(shù)支鰭骨未骨化, 野生型斑馬魚的肌間刺骨化也基本完成(圖版Ⅰ-17), 而突變型斑馬魚未有肌間刺形成(圖版Ⅰ-18)。

2.2 胚胎發(fā)育時期骨骼發(fā)育相關基因的表達

結果顯示,bmp2a、bmp4、smad1、smad4a在野生型和突變性個體中的表達, 及sp7基因在突變型個體中的表達均呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢, 且在體節(jié)期(12hpf)達到最高表達水平; 而runx2a基因在野生型和突變型個體中的表達, 以及sp7基因在野生型個體中的表達則表現(xiàn)為逐漸上升的趨勢。對6個基因在野生型和突變型胚胎發(fā)育時期的表達水平進行對比分析發(fā)現(xiàn), 在囊胚期(3hpf)和原腸胚期(6hpf)6個基因在兩種肌間刺表型間表達量無明顯差異, 在體節(jié)期(12hpf)、咽囊期(24hpf)和孵化期(72hpf)bmp2a的表達水平在兩種肌間刺表型間無明顯差異, 野生型個體bmp4、smad1、smad4a、runx2a基因在體節(jié)期(12hpf)、咽囊期(24hpf)和孵化期(72hpf)的表達水平明顯高于突變型, 而sp7基因則表現(xiàn)為突變型明顯高于野生型(圖1)。

2.3 胚后發(fā)育階段骨骼發(fā)育相關基因的表達

結果顯示,bmp2a、bmp4、smad1、smad4a、runx2a和sp7基因在野生型和突變型斑馬魚個體5個胚后生長階段(15、30、45、60和75dpf)的表達均基本呈現(xiàn)出逐漸下降的的趨勢。兩種肌間刺表型間6個基因的表達在個別時期存在差異, 其中,bmp2a在45dpf時野生型個體表達量明顯高于突變型, 而bmp4則與之相反;smad1和smad4a則分別在30和15dpf表達量表現(xiàn)為野生型低于突變型; 此外,runx2a在15dpf時, 野生型個體在15和60dpf時的表達量表現(xiàn)為野生型高于突變型, 而sp7在15、30和45dpf 3個生長階段亦表現(xiàn)為野生型個體表達量顯著高于突變型(圖2)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn), 斑馬魚的骨骼發(fā)育具有特定的時空順序, 頭骨、脊椎骨和魚鰭骨骼基本遵循由頭部向尾部依次骨化的規(guī)律, 而肌間刺的發(fā)育則是由尾部向頭部依次骨化, 且腹部肌間刺的骨化快于背部;鰭條骨骼順序為尾鰭、背鰭、臀鰭、腹鰭、胸鰭。斑馬魚骨骼的骨化方式與其他脊椎動物相同,有軟骨內(nèi)骨化和膜內(nèi)骨化兩種方式[18—20], 斑馬魚的大部分骨骼(頭骨、脊椎骨和魚鰭骨骼等)均為需要經(jīng)過軟骨階段的軟骨內(nèi)骨化, 肌間刺不經(jīng)過軟骨階段而由骨膜直接骨化形成。對于斑馬魚骨骼發(fā)育的研究, 許多國內(nèi)外研究人員已經(jīng)做了大量的工作。Cubbage和Mabee[21]對斑馬魚幼魚和成魚頭蓋骨和側鱗的骨化進行過了報道, Du等[18]對斑馬魚23dpf內(nèi)個體縱軸骨骼的鈣化進行了描述, Yao等[22]則對斑馬魚肌間刺的發(fā)育模式進行了觀察。本研究觀察分析了斑馬魚骨骼從8dpf到52dpf的連續(xù)發(fā)育過程, 結論與已有文獻一致。此外, 本研究通過比較兩種肌間刺表型骨骼的發(fā)育過程發(fā)現(xiàn), 頭骨、脊椎骨和魚鰭骨骼的發(fā)育基本保持一致, 故初步推測肌間刺的缺失不影響斑馬魚其他骨骼的發(fā)育。

圖1 胚胎發(fā)育階段不同肌間刺表型斑馬魚6個骨骼發(fā)育相關基因的表達Fig. 1 Expression of 6 skeleton development related genes in different embryonic development stages

研究發(fā)現(xiàn), 斑馬魚胚胎發(fā)育至48—52hpf的胚胎中就已存在未發(fā)育的由軟骨因子組成的骨架, 具有基舌骨等頭部骨骼, 脊索僅為軸向支撐結構[23,24]。這與本研究中野生型斑馬魚6個骨骼發(fā)育相關基因的表達變化相一致。胚胎發(fā)育時,bmp2a、bmp4、smad1和smad4a基因相繼激活并發(fā)揮作用[4,13]。骨骼發(fā)育的結果發(fā)現(xiàn), 野生型和突變型斑馬魚bmp2a、bmp4基因在胚胎發(fā)育5個發(fā)育階段的變化趨勢分別與smad1、smad4a相一致; 胚后發(fā)育過程5個生長階段的變化趨勢也基本呈現(xiàn)一致的變化趨勢, 這一結果與已有文獻一致[8,25]。此外, 野生型斑馬魚個體中runx2a和sp7基因的表達也呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢, 雖然bmp2a基因的表達水平在12hpf后有所下降, 但仍保持較高的表達水平; 胚后發(fā)育過程中,runx2a與sp7基因的表達水平則隨著BMPs家族基因和SMAD家族基因表達水平的降低而隨之下降, 與已有文獻報道一致[8,9]。

胚胎發(fā)育階段, 兩種肌間刺表型6個基因在在囊胚期(3hpf)和原腸胚期(6hpf)表達量無明顯差異,在體節(jié)期(12hpf)、咽囊期(24hpf)和孵化期(72hpf)bmp2a基因表達無明顯差異,bmp4、smad1、smad4a、runx2a基因表現(xiàn)為野生型明顯高于突變型, 而sp7基因則表現(xiàn)為突變型明顯高于野生型, 表明肌間刺的缺失對6個基因的表達存在一定程度的影響; 胚后生長階段, 6個基因的表達水平僅在個別生長階段差異顯著。綜合基因表達與骨骼染色情況發(fā)現(xiàn), 雖然在胚胎發(fā)育和胚后發(fā)育階段, 骨骼發(fā)育相關基因的表達在兩種肌間刺表型間存在一定的差異, 但是骨骼染色結果顯示兩種表型骨骼發(fā)育并無明顯差異, 推測肌間刺發(fā)育關鍵基因的突變對骨骼發(fā)育的影響主要在胚胎發(fā)育階段。此外, 在胚胎發(fā)育過程中,runx2a的表達趨勢為野生型個體高于突變型,而sp7則剛好與之相反; 在胚后生長階段個別時期(15dpf)則表現(xiàn)為表達趨勢相同, 推測在胚胎發(fā)育過程肌間刺關鍵基因的突變導致的runx2a基因的表達下調(diào)由sp7的高表達進行了補償; 而在胚后階段runx2a和sp7基因在突變型中的低水平表達并未影響骨骼發(fā)育過程, 可能是由于其他調(diào)控途徑激活了smad1和smad4a基因的上調(diào), 補償了runx2a和sp7基因的表達下調(diào)。綜上, 肌間刺發(fā)育關鍵基因的突變對斑馬魚骨骼發(fā)育無顯著影響, 而對于肌間刺關鍵基因的缺失的影響及表達調(diào)控仍需進一步研究證實。

圖2 胚后生長階段不同肌間刺表型斑馬魚6個骨骼發(fā)育相關基因的表達Fig. 2 Expression of 6 skeleton development related genes in different postembryonic development stages

圖版 Ⅰ 野生型與突變型斑馬魚骨骼發(fā)育過程Plate Ⅰ Development of the wildtype and mutant zebrafish skeleton