浮小麥5-二十一烷基間苯二酚提取與測(cè)定方法優(yōu)化及指紋圖譜研究

王鵬飛，劉 嬌，高 速，張 姣，張 晗,2，楊 琳,2，王小平*，白吉慶,2**

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西省中藥原料質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)服務(wù)中心，陜西 咸陽(yáng) 712046)

浮小麥為禾本科植物小麥TriticumaestivumL.的干燥輕浮癟瘦的果實(shí)[1-2]，始載于《本草綱目》[3]，其性涼，味甘咸，入心、脾、腎經(jīng)，具有止汗、除熱、益氣、養(yǎng)心安神的功效，對(duì)自汗、盜汗、骨蒸勞熱、心神不寧、驚悸等疾病有較好的療效[4-7]?，F(xiàn)行2015年版《中國(guó)藥典》四部?jī)H在“成方制劑中本版藥典未收載的藥材飲片”中記載了浮小麥的來(lái)源，未對(duì)浮小麥藥材質(zhì)量控制做進(jìn)一步要求。據(jù)報(bào)道，其含有5-二十一烷基間苯二酚、亞油酸、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖、棉子糖等多種成分[5,8]。其中文獻(xiàn)報(bào)道5-二十一烷基間苯二酚具有止汗，能抑制大鼠足趾部位汗點(diǎn)數(shù)等作用[5,9-10]，與浮小麥的功能主治相一致。基于此，采用HPLC對(duì)14批浮小麥中5-二十一烷基間苯二酚含量進(jìn)行了測(cè)定，并建立了浮小麥的指紋圖譜，為浮小麥的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

戴安Ultimate 3000全自動(dòng)高效液相色譜儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司，包含Ultimate 3000四元梯度泵、Ultimate 3000自動(dòng)進(jìn)樣器、Ultimate 3000二極管陣列檢測(cè)器、chromeleon 6.8色譜工作站)；Discovery DV215CD型雙量程電子分析天平(瑞士賽多利斯集團(tuán)；0.01 mg；0.1 mg)；Direct-Q 3UV純化水機(jī)(默克密理博)；超聲清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；DFT-50A手提式高速粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司制造)。

1.2 試驗(yàn)藥材與試劑

浮小麥經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)白吉慶副教授鑒定為禾本科植物小麥(TriticumaestivumL.)的干燥輕浮癟瘦的果實(shí)，來(lái)源信息見(jiàn)表1；5-二十一烷基間苯二酚對(duì)照品(江西佰草源生物科技有限公司，BCY-01581，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)；乙腈、甲醇(美國(guó)迪馬公司，色譜級(jí))；水為超純水(自制)；其他試劑均為分析純。

表1 浮小麥樣品來(lái)源信息

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取工藝優(yōu)化

以5-二十一烷基間苯二酚含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按L9( 34) 正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)，并進(jìn)行極差和方差分析?？疾旒状紳舛?A) 、超聲時(shí)間(B) 、提取次數(shù)(C)3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平。因素水平表見(jiàn)表2。

表2 浮小麥5-二十一烷基間苯二酚提取工藝因素水平表

Table 2 Factors and levels of extraction technology of 5-heneicosyresorcinol from aestivum

水平因素ABC甲醇濃度/%超聲時(shí)間/min提取次數(shù)1501512703023100453

1.3.2 5-二十一烷基間苯二酚含量測(cè)定

1.3.2.1 色譜條件 Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(95.7∶4.3)，流速為1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取5-二十一烷基間苯二酚對(duì)照品適量，置于25 mL容量瓶中，加甲醇制成0.093 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，備用。

1.3.2.3 供試品溶液制備 取浮小麥粉末0.1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇6 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理(80 W，45 kHz)30 min，放冷，再次稱(chēng)定重量后，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.22 um微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.3.2.4 線性關(guān)系 用甲醇將“2.1.2”項(xiàng)下所制對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.0186、0.02976、0.0372、0.0558、0.0744、0.093 ug·mL-1，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣1 μL測(cè)定，記錄峰面積，以其質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，線性回歸。

1.3.2.5 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“1.3.2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄5-二十一烷基間苯二酚的峰面積。

1.3.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h，按“1.3.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄5-二十一烷基間苯二酚的峰面積。

1.3.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1浮小麥樣品，平行6份，按“1.3.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄5-二十一烷基間苯二酚的峰面積。

1.3.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的浮小麥樣品粉末(S1)6份，每份0.05 g，分別精密加入一定量的5-二十一烷基間苯二酚對(duì)照品，按“1.3.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算平均回收率。

1.3.2.9 樣品含量測(cè)定 取14批浮小麥樣品各0.1 g，按照“1.3.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，供試品和對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1。

1.3.3 指紋圖譜

1.3.3.1 色譜條件 Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)梯度洗脫(0～60 min，70% B；60～80 min，0%B)；流速為1mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm；柱溫40℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“1.3.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以3號(hào)峰為參照峰，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，對(duì)色譜圖進(jìn)行相似度分析。

1.3.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h，按“1.3.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以3號(hào)峰為參照峰，計(jì)算出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，將色譜圖進(jìn)行相似度分析。

1.3.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1浮小麥樣品，平行6份，按“1.3.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以3號(hào)峰為參照峰，計(jì)算出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，將色譜圖進(jìn)行相似度分析。

1.3.3.5 浮小麥指紋圖譜的建立 取14批浮小麥藥材樣品，按“1.3.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄14批浮小麥樣品的色譜圖。導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004A)軟件進(jìn)行分析，以樣品S1的指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.1 s，經(jīng)多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配后生成浮小麥藥材指紋圖譜的共有模式，見(jiàn)圖2。

圖1 浮小麥(A)及5-二十一烷基間苯二酚對(duì)照品(B) HPLC色譜圖Fig.1 HPLC of aestivum (A) and 5-heneicosyresorcinol Reference (B)

圖2 14批浮小麥HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint of 14 batches ofaestivum

2 結(jié)果

2.1 5-二十一烷基間苯二酚提取工藝優(yōu)化

由表3可知，甲醇濃度對(duì)5-二十一烷基間苯二酚的提取有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中甲醇提取5-二十一烷基間苯二酚含量最高；提取時(shí)間和提取次數(shù)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是提取30 min比提取15 min的含量高，提取次數(shù)對(duì)含量影響不大。綜合考慮，即要5-二十一烷基間苯二酚提取含量最高，又要節(jié)約成本，所以確定較佳提取工藝為A3B2C1，即用甲醇超聲30 min提取1次。

表3 優(yōu)化5-二十一烷基間苯二酚提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 5-二十一烷基間苯二酚含量方差分析結(jié)果

2.2 色譜條件的優(yōu)化

采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)指紋圖譜和含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行選擇。結(jié)果表明，檢測(cè)波長(zhǎng)在205 nm處所得各色譜峰譜圖信息量較大，且色譜峰分離度較好，故選用205 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。采用不同的洗脫系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)相的組成進(jìn)行優(yōu)化，5-二十一烷基間苯二酚含量測(cè)定最終選用“1.3.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行等度洗脫。指紋圖譜最終選用“1.3.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行梯度洗脫，各色譜分離度好。

2.3 5-二十一烷基間苯二酚含量測(cè)定

所得回歸方程為：y=39.215x-0.0155，r =0.9996， 5-二十一烷基間苯二酚質(zhì)量在0.0186～0.093 ug·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；精密度試驗(yàn)中5-二十一烷基間苯二酚峰面積的RSD值為1.30%，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)中5-二十一烷基間苯二酚峰面積的RSD值為1.60%，表明24 h內(nèi)供試品的穩(wěn)定性良好；重復(fù)性試驗(yàn)中5-二十一烷基間苯二酚含量的RSD值為1.24%，表明該方法的重復(fù)性良好；計(jì)算平均回收率為101.16%，RSD為0.7%，表明該方法的回收率良好。 14批浮小麥中5-二十一烷基間苯二酚含量分別為3.74、4.51、4.29、 5.02、2.96、2.90、3.38、1.62、3.30、2.35、2.77、2.73、3.17、3.33 mg·g-1。

2.4 指紋圖譜

2.4.1 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)中，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.12%～0.50%，0.17%～2.91%，相似度均大于0.990，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.08%～1.93%，0.45%～2.99%，相似度均大于0.990，表明24 h內(nèi)供試品的穩(wěn)定性良好；重復(fù)性試驗(yàn)中，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.06%～1.04%，0.67%～2.98%，相似度均大于0.990，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.2 共有峰標(biāo)定

根據(jù)14批浮小麥藥材指紋圖譜，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004A)軟件，共確定出18個(gè)共有色譜峰，見(jiàn)圖3。經(jīng)對(duì)照品比對(duì)指認(rèn)了Rt = 60.780 min為5-二十一烷基間苯二酚的色譜峰。在樣品圖譜中選擇峰面積較大3號(hào)色譜峰作為參照峰，以參照峰的保留時(shí)間和峰面積作為1，分別計(jì)算其他各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表5、6。

2.4.3 相似度評(píng)價(jià)

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)體系統(tǒng)》(2004 A)對(duì)14批浮小麥的指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，與共有模式相比較，S11相似度為0.988，其余樣品相似度均達(dá)到0.99以上，表明藥材質(zhì)量穩(wěn)定，差異較小，結(jié)果見(jiàn)表7。

2.4.4 系統(tǒng)聚類(lèi)分析

對(duì)14批浮小麥樣品的HPLC指紋圖譜中18個(gè)共有峰的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用組間聯(lián)接法，以歐式平方距離對(duì)樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析。當(dāng)臨界值為20時(shí)，14個(gè)來(lái)自不同產(chǎn)地的浮小麥樣品可聚為兩類(lèi)：第1類(lèi)為S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S12、S13、S14；第2類(lèi)為S11，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 12-5-二十一烷基間苯二酚浮小麥藥材HPLC指紋圖譜共有模式(A)和5-二十一烷基間苯二酚對(duì)照品色譜圖(B)Fig.3 HPLC fingerprints common model (A) and reference chromatography of 5-heneicosyresorcinol (B)

共有峰相對(duì)保留時(shí)間S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14RSD/%10.7890.7970.7900.7900.7890.7900.7900.7900.7890.7900.7900.7890.7880.7890.2720.9600.9590.9600.9590.9600.9600.9600.9580.9590.9600.9590.9590.9580.9600.013(S)1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0041.4121.4101.4111.4111.4111.4101.4551.4521.4121.4001.4101.4111.4101.4100.8851.7671.7661.7691.7681.7681.7671.7681.7681.7681.7621.7651.7671.7671.7670.1061.8941.8921.8941.8931.8921.8921.8941.8941.8931.8791.8911.8931.8931.8920.2171.9411.9381.9401.9441.9401.9381.9401.9391.9391.9331.9381.9391.9391.9380.1282.402.372.392.392.402.412.402.402.392.392.392.412.402.390.1292.5262.5222.5252.5232.5232.5242.5242.5232.5232.5122.5212.5242.5222.5220.13102.5412.5372.5402.5382.5382.5392.5392.5402.5392.5122.5362.5402.5392.5340.28112.6432.6392.6422.6402.6402.6412.6412.6412.6402.6282.6342.6412.6392.6380.14122.6692.6652.6682.6662.6662.6672.6682.6672.6672.6542.6642.6682.6652.6650.14132.7432.7382.7422.7392.7392.7412.7412.7412.7402.7272.7372.7412.7392.7380.14142.7932.7882.7922.7902.7902.7902.7892.7922.7892.7772.7872.7912.7892.7880.14152.8522.8472.8512.8522.8492.8492.8502.8502.8492.8352.8462.8502.8452.8470.17162.8742.8692.8732.8702.8712.8712.8722.8722.8722.8572.8672.8722.8702.8690.14172.9452.9452.9442.9412.9422.9422.9432.9442.9432.9292.9402.9432.9412.9400.14182.9802.9802.9782.9752.9762.9762.9782.9772.9632.9763.0622.9772.9742.9750.78

表6 14批樣品共有峰的相對(duì)峰面積

續(xù)表6 14批樣品共有峰的相對(duì)峰面積

表7 14批浮小麥相似度分析結(jié)果

圖4 14批浮小麥系統(tǒng)聚類(lèi)分析結(jié)果Fig.4 Dendrogram of hierarchical clustering analysis of 14batches of aestivum

3 討論與結(jié)論

5-二十一烷基間苯二酚是浮小麥中主要活性成分之一，具有止汗、能抑制大鼠足趾部位汗點(diǎn)數(shù)、抑制α-葡萄糖苷酶活性，控制餐后高血糖等作用[9,13]，測(cè)定其含量對(duì)浮小麥的質(zhì)量控制具有重大意義。目前，對(duì)于浮小麥的質(zhì)量控制研究主要集中在葡萄糖、棉子糖、亞油酸等化學(xué)成分的含量測(cè)定[5,11]、生藥學(xué)[4,12]等方面，未見(jiàn)對(duì)浮小麥藥材的指紋圖譜研究。本研究采用HPLC法測(cè)定了14批浮小麥中5-二十一烷基間苯二酚含量在1.62～5.02 mg·g-1之間，平均加樣回收率為101.16%，RSD為0.7%；建立了不同產(chǎn)地浮小麥的HPLC指紋圖譜，標(biāo)定了18個(gè)共有峰，指認(rèn)了5-二十一烷基間苯二酚1個(gè)共有峰。方法學(xué)結(jié)果表明其精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。

從聚類(lèi)分析結(jié)果可知，廣西玉林藥材市場(chǎng)浮小麥(S11)與陜西大多數(shù)產(chǎn)地浮小麥差異較大，說(shuō)明不同省之間浮小麥的質(zhì)量存在差異，而陜西各批浮小麥相似度均在0.99以上，說(shuō)明差異較小，質(zhì)量比較穩(wěn)定。經(jīng)系統(tǒng)聚類(lèi)分析，其結(jié)果與指紋圖譜的相似度分析結(jié)果項(xiàng)一致。

綜上分析，本文建立的浮小麥指紋圖譜及含量測(cè)定方法對(duì)其質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)研究具有重要意義，可為浮小麥藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。