miR-149-3p靶向FOXM1抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901生長(zhǎng)和遷移

林志金 張長(zhǎng)青 陳新琦 許伯明 李穎怡 陳雅妮

(泉州市第一醫(yī)院消化內(nèi)科,泉州 362000)

胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一[1]，該疾病早期起病隱匿，且無(wú)明顯的臨床癥狀，當(dāng)患者被確診時(shí)已錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)間，導(dǎo)致胃癌成為預(yù)后差、病死率較高的疾病之一[2]。近年來(lái)研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(non-coding RNA,lncRNA) 在調(diào)控癌癥的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[3,4]。凌斌勛等[5]研究表明miR-149和FOXM1具有靶向性，可以有效抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。趙濤等[6]研究表明miR-149通過(guò)靶向FOXM1抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲，發(fā)揮抑癌基因的作用。但目前關(guān)于miR-149-3p靶向FOXM1抑制人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的機(jī)制研究較少。本文旨在探究miR-149-3p靶向FOXM1抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901生長(zhǎng)和遷移的作用機(jī)制，從而為胃癌患者治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞SGC-7901購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑與儀器 TRAIL購(gòu)自英國(guó)Pepro Tech 公司；磷酸緩沖液PBS購(gòu)自天津科密歐有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自廣州威佳科技有限公司；青霉素鈉購(gòu)自哈藥集團(tuán)制藥總廠；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自默沙克有限公司；N-cadherin、E-cadherin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；MMP-9、MMP-2抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；PCNA抗體購(gòu)自Sino Biolocgical公司；FOXM1、p21抗體購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。低溫離心機(jī)購(gòu)自湖南恒諾離心機(jī)有限公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自上海儀電分析儀器有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Forma公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；TRIzol試劑盒購(gòu)自賽默飛公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人胃癌細(xì)胞SGC-7901培養(yǎng)于含10%FBS、100 U/ml 青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞傳三代培養(yǎng)于6孔板中，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3RT-PCR 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，用TRIzol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，PCR擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參按照試劑盒操作方法檢測(cè)各RNA表達(dá)水平。

1.2.4熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 利用生物信息預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-149-3p和FOXM1的結(jié)合片段，用RT-PCR擴(kuò)增miR-149-3p上兩者的結(jié)合片段，構(gòu)建FOXM1野生質(zhì)粒，再利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)突變，構(gòu)建FOXM1突變質(zhì)粒。用FOXM1野生質(zhì)粒、FOXM1突變質(zhì)粒和miR-149-3p分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用Dual Luciferase報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)各組熒光素酶活性。

1.2.5Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h 后加入各需要檢測(cè)蛋白的一抗，二抗，孵育2 h，TBS洗凈，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，顯色液顯色后進(jìn)行吸光度分析，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6CCK-8檢測(cè)胃癌抑制率 取上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于96個(gè)孔板中(100 μl/孔)。放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，待細(xì)胞貼壁后，分別培養(yǎng) 0、1、2、3 d 后加入 10 μl CCK-8 溶液培養(yǎng) 2 h后使用酶標(biāo)儀測(cè)定 450 nm 處各孔的吸光度值，計(jì)算胃癌細(xì)胞的抑制率。

1.2.7體外侵襲實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞密度調(diào)整為：1×105個(gè)/ml，恒溫培養(yǎng)1 d后用結(jié)晶紫對(duì)侵襲至小室下層的細(xì)胞進(jìn)行染色，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。

1.2.8劃痕實(shí)驗(yàn) 單層細(xì)胞使用槍頭劃?rùn)M線，培養(yǎng)1 d后顯微鏡下再次觀察拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究數(shù)據(jù)分析和作圖采用SPSS22.0和GraphPad Prism5，方差分析使用單因素方差分析，當(dāng)組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，采用SNK方法進(jìn)行進(jìn)一步的比較；使用單因素方差分析時(shí)，若P<0.05則表明數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1不同組織中miR-149-3p和FOXM1 mRNA的表達(dá)水平及關(guān)系 由圖1可知，相比正常組織，原位腫瘤組織miR-149-3p表達(dá)顯著降低、FOXM1 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)，相比原位腫瘤組織，轉(zhuǎn)移后腫瘤組織miR-149-3p表達(dá)顯著降低、FOXM1 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)；隨著miR-149-3p表達(dá)的升高FOXM1 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)。

2.2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-149-3p和FOXM1 mRNA的表達(dá)水平 由圖2可知，相比空白組，陰性對(duì)照組miR-149-3p和FOXM1 mRNA的表達(dá)水平無(wú)顯著變化(P>0.05)；而mimic組miR-149-3p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；FOXM1 mRNA的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

圖1 不同組織中miR-149-3p和FOXM1 mRNA的表達(dá)水平及關(guān)系Fig.1 Expression levels and relationship of miR-149-3p and FOXM1 mRNA in different tissuesNote: A.Expression of miR-149-3p in each group； B.Expression of FOXM1 mRNA in each group； C.Linear relationship between expression of miR-149-3p and FOXM1 mRNA.1.Normol tissues；2.Tumor tissues in situ；3.Metastatic tumor tissues.

圖2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-149-3p和FOXM1 mRNA的表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of miR-149-3p and FOXM1 mRNA in cells after transfectionNote: A.The expression of miR-149-3p in each group；B.The expression of FOXM1 mRNA in each group.Compared with blank control group, **.P<0.01.

2.3miR-149-3p與FOXM1的靶向關(guān)系驗(yàn)證結(jié)果 由圖3熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，野生型純合子FOXM1和miR-149-3p存在互補(bǔ)配對(duì)的堿基。相比陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染組野生型純合子FOXM1 熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；兩組純合子FOXM1 熒光素酶活性無(wú)顯著差別(P>0.05)。

2.4細(xì)胞增殖及相關(guān)增殖蛋白檢測(cè)結(jié)果 由圖4可知，0～2 d內(nèi)，各組細(xì)胞增長(zhǎng)無(wú)顯著差別(P>0.05)，3 d時(shí)，相比空白對(duì)照組，miR-149-3p過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增長(zhǎng)顯著降低(P<0.05)；相比FOXM1過(guò)表達(dá)組，miR-149-3p+pLV-FOXM1組細(xì)胞增長(zhǎng)顯著降低。由圖4B可知，相比空白對(duì)照組，miR-149-3p mimic組FOXM1、P21蛋白表達(dá)顯著升高，PCNA表達(dá)顯著降低(P>0.05)；相比空白對(duì)照組，pLV-FOXM1組FOXM1、P21蛋白表達(dá)顯著降低，PCNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)；相比pLV-FOXM1組，miR-149-3p+pLV-FOXM1組FOXM1、P21蛋白表達(dá)顯升高，PCNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

圖3 miR-149-3p與FOXM1的靶向關(guān)系驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 Verification results of targeting relationship between miR-149-3p and FOXM1Note: A.Image of complementary base pairing； B.Test result of luciferase activity.Compared with negative control group, **.P<0.01.

圖4 細(xì)胞增殖及相關(guān)增殖蛋白檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Test results of cell proliferation and related prolifer-ation proteinsNote: A.Cells proliferation；B.Expression of proliferation-related proteins.Compared with blank control group，**.P<0.01；compared with pLV-FOXM1 group, ##.P<0.01.

2.5細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 由圖5可知，相比空白對(duì)照組，miR-149-3p mimic組單位面積細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著降低(P<0.05)，pLV-FOXM1組單位面積細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著升高(P<0.05)；相比pL-VFOXM1組，miR-149-3p+pLV-FOXM1組單位面積細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著降低(P<0.05)。

圖5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Test results of cell invasion experimentsNote: Compared with blank control group **.P<0.01;compared with pLV-FOXM1 group, ##.P<0.01.

圖6 細(xì)胞遷移檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Test results of cell migrationNote: Compared with blank control group **.P<0.01.Compared with pLV-FOXM1 group, ##.P<0.01.

圖7 細(xì)胞侵襲、遷移相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Test results of cell invasion and migration related proteinsNote: Compared with blank control group **.P<0.01;compared with pLV-FOXM1 group, ##.P<0.01.

2.6細(xì)胞遷移檢測(cè)結(jié)果 由圖6可知，相比空白對(duì)照組，miR-149-3p mimic組細(xì)胞遷移水平顯著降低，pLV-FOXM1組細(xì)胞遷移水平顯著升高(P<0.05)；相比pLV-FOXM1組，miR-149-3p+pLV-FOXM1組細(xì)胞遷移水平顯著降低(P<0.05)。

2.7細(xì)胞侵襲、遷移相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果 由圖7可以看出，相比空白對(duì)照組，miR-149-3p mimic組N-cadherin、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；相比空白對(duì)照組，pLV-FOXM1組N-cadherin、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；相比pLV-FOXM1組，miR-149-3p+pLV-FOXM1組N-cadherin、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

3 討論

細(xì)胞的增殖和分化受到相關(guān)的蛋白調(diào)控，目前研究較多的調(diào)控細(xì)胞增殖的蛋白包括：增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑家族成員P21和FOXM1。Boehm等[7]研究表明PNCA是細(xì)胞增殖分化的重要蛋白之一。牛建新等[8]研究表明PNCA指數(shù)越高，細(xì)胞的分裂增殖越快，最終會(huì)讓細(xì)胞獲得無(wú)限增殖的能力并使細(xì)胞在形態(tài)和結(jié)構(gòu)機(jī)能上改變，達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果。P21是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白[9,10]，能夠?qū)⒓?xì)胞阻滯在G1期，促進(jìn)輕度損傷的DNA自我修復(fù)，或者促進(jìn)重度難以修復(fù)的DNA進(jìn)入凋亡，防止細(xì)胞發(fā)生異常突變。FOXM1是叉頭框(forkhead box，F(xiàn)ox)蛋白家族成員之一[11]。FOXM1主要依靠調(diào)控細(xì)胞增生和有絲分裂調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖。FOXM1普遍表達(dá)于所有的胚胎組織中，但在成年人中它只在增殖活躍的細(xì)胞中表達(dá)，例如腫瘤細(xì)胞[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，相比空白對(duì)照組，miR-149-3p mimic組FOXM1、P21蛋白表達(dá)顯著升高，PCNA表達(dá)顯著降低，說(shuō)明過(guò)表達(dá)的miR-149-3p可以顯著降低胃癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。相比pLV-FOXM1組，miR-149-3p+pLV-FOXM1組FOXM1、P21蛋白表達(dá)顯升高，PCNA表達(dá)顯著降低，說(shuō)明miR-149-3p可以靶向結(jié)合pLV-FOXM1使得增殖相關(guān)的蛋白表達(dá)降低，有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞的侵襲和遷移受到上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithe-lial mesenchyml transition，EMT)的調(diào)節(jié)[13]。EMT是指上皮細(xì)胞能暫時(shí)喪失細(xì)胞極性獲得間質(zhì)細(xì)胞移動(dòng)能力。腫瘤細(xì)胞能夠通過(guò)細(xì)胞極性喪失，改變自身細(xì)胞形態(tài)與其他細(xì)胞分離[14,15]；同時(shí)通過(guò)下調(diào)細(xì)胞黏附因子E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)的表達(dá)[16]，將角蛋白細(xì)胞骨架變?yōu)椴ㄐ渭?xì)胞骨架，促進(jìn)細(xì)胞穿透胞間連接，增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力[17]。腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移過(guò)程中，需要水解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，腫瘤細(xì)胞跨越基底膜屏障進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，才能向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo protien-ase，MMPs)是一種能降解細(xì)胞外基質(zhì)，預(yù)防腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的一種金屬離子蛋白水解酶[18]，其中比較常見(jiàn)的為：MMP-2、MMP-9，這兩種蛋白可以降解細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白，使得卵巢癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移受到抑制；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比空白對(duì)照組，miR-149-3p mimic組N-cadherin、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明miR-149-3p的表達(dá)可以影響細(xì)胞侵襲遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)從而影響細(xì)胞的侵襲和遷移。相比pLV-FOXM1組，miR-149-3p+pLV-FOXM1組N-cadherin、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明miR-149-3p可以靶向結(jié)合pLV-FOXM1。本實(shí)驗(yàn)證明miR-149-3p靶向FOXM1抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲和遷移。葉小娟等[19]研究表明RNA-320a 通過(guò)靶向 FOXM1調(diào)控肝癌細(xì)胞遷移，與本研究得出的結(jié)論相類似。

綜上所述，miR-149-3p可以靶向FOXM1抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901生長(zhǎng)侵襲和遷移，其機(jī)制與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)侵襲和遷移的蛋白有關(guān)。但調(diào)控胃癌細(xì)胞SGC-7901生長(zhǎng)侵襲和遷移的信號(hào)通路較多，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可以進(jìn)一步探討miR-149-3p靶向作用FOXM1對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901生長(zhǎng)侵襲和遷移信號(hào)通路的影響。