廣西部分地區(qū)警犬狂犬病血清中和抗體調(diào)查

徐 陶 杜曉鵬 毛愛(ài)國(guó) 萬(wàn)九生

狂犬?。≧abies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）感染引起的一種致死性人獸共患病，病死率幾乎達(dá)到100%。目前，對(duì)狂犬病尚無(wú)有效的治療方法，而對(duì)犬接種狂犬病疫苗是預(yù)防狂犬病的最有效措施之一。犬的狂犬病免疫覆蓋率低于70%，是誘發(fā)人類(lèi)狂犬病發(fā)生的主要原因。2017年全國(guó)共報(bào)告502例人類(lèi)狂犬病死亡病例，西南及東南地區(qū)是我國(guó)人和動(dòng)物狂犬病高發(fā)區(qū)域，其中廣西發(fā)生41例狂犬病死亡病例，位居全國(guó)第四。

為了解廣西區(qū)警犬狂犬病疫苗免疫效果，分析影響警犬免疫合格率的因素，制定適合的警犬免疫程序，提高免疫合格率，本研究對(duì)廣西區(qū)南寧市、桂林市、梧州市、玉林市等4個(gè)地區(qū)警犬狂犬病疫苗免疫覆蓋率及血清中和抗體進(jìn)行調(diào)查。通過(guò)隨機(jī)抽樣獲得有效樣本93份，采用熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（FAVN）檢測(cè)了警犬血清中RABV中和抗體效價(jià)。

一、調(diào)查對(duì)象

根據(jù)廣西區(qū)警犬工作布局情況，選取毗鄰湖南的桂林，與廣東接壤的梧州、玉林，以及省會(huì)城市南寧4個(gè)地區(qū)進(jìn)行采樣。按照7月齡以上訓(xùn)練犬與工作犬總數(shù)量的10%進(jìn)行抽樣：每個(gè)性別組按照10%的比例進(jìn)行間隔抽樣；當(dāng)超過(guò)20頭時(shí)，可按照隔2抽1、隔3抽1的原則抽樣，以此類(lèi)推。共選取了以上4個(gè)地區(qū)的93頭身體健康的警犬作為調(diào)查對(duì)象。

（一）檢測(cè)單位分布與警犬?dāng)?shù)量分布

南寧選取2個(gè)訓(xùn)練單位31頭警犬，桂林選取5個(gè)訓(xùn)練單位26頭警犬，梧州選取8個(gè)訓(xùn)練單位17頭警犬，玉林選取5個(gè)訓(xùn)練單位19頭警犬。

（二）警犬免疫程序與免疫覆蓋率

1.警犬免疫程序

所有警犬均使用統(tǒng)一的狂犬病免疫程序。即在犬出生3月齡時(shí)，接種狂犬病滅活疫苗一劑；此后每年加強(qiáng)免疫一次，接種狂犬病滅活疫苗一劑。

2.免疫覆蓋率

經(jīng)查閱檔案調(diào)查，檢測(cè)單位警犬狂犬病疫苗免疫覆蓋率為100%。

（三）疫苗種類(lèi)

南寧、桂林、玉林3個(gè)地區(qū)，以及梧州部分單位選用疫苗為A品牌，犬、貓狂犬病滅活疫苗（Pasteur RIV株，至少2IU）；梧州另有3個(gè)單位分別選用B品牌狂犬病滅活疫苗（HCP-SAD株，滅活前不少于106.3FAID50/mL）、C品牌狂犬病弱毒疫苗（Rb/E3株≥105.0LD50/0.03ml）、D品牌狂犬病滅活疫苗（G52株，每頭份至少為1IU）。

（四）犬種體型

檢測(cè)的犬種包括德國(guó)牧羊犬、馬里努阿犬、昆明犬、羅威納犬、拉布拉多犬、史賓格犬、尋血獵犬、維茲拉犬與昆馬雜交犬，按照中國(guó)工作犬管理協(xié)會(huì)（CWDMA）的犬種分組表，將檢測(cè)犬分為大型犬（55cm以上）、中型犬（35.1～54.9cm）與小型犬（35cm以下）。本研究涉及的犬種均為中型犬種或大型犬種。

二、材料與方法

（一）待檢血清

在警犬狂犬病滅活疫苗免疫后28天，從待檢犬前肢頭靜脈采血至少3mL，靜置2h，1500rmp/min離心30min，分離血清，冷凍保存或冷鏈運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，備用。出現(xiàn)溶血需重新采取血樣并分離血清。

（二）檢測(cè)試劑

1.標(biāo)準(zhǔn)血清

購(gòu)自法國(guó)歐盟狂犬病血清學(xué)參考實(shí)驗(yàn)室，效價(jià)為5.92IU/mL。

2. 陰性血清

采集自未免疫健康犬，由軍事獸醫(yī)研究所世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）狂犬病參考實(shí)驗(yàn)制備。

3. 熒光抗體

FITC熒光素標(biāo)記的抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體購(gòu)自Fujiribio公司。

4. 狂犬病病毒CVS-11細(xì)胞毒

軍事獸醫(yī)研究所保存，滴度為106.67TCID50/mL。

（三）檢測(cè)方法

1. 樣本處理

待檢血清分別在56℃滅活30min。

2. 檢測(cè)

采用OIE《陸生動(dòng)物診斷測(cè)試和免疫手冊(cè)》2013版直接免疫熒光病毒中和試驗(yàn)（FAVN）對(duì)待檢血清中狂犬病病毒中和抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)。首先對(duì)標(biāo)準(zhǔn)血清和待檢血清進(jìn)行3倍梯度稀釋，稀釋區(qū)域第一列各孔內(nèi)預(yù)先加入100μL培養(yǎng)液，每孔加入血清50μL，混勻后吸取50μL加入第二列，依此稀釋。取預(yù)先確定滴度的狂犬病病毒CVS-11，以MEM培養(yǎng)液稀釋至30-300TCID50/50μL，除細(xì)胞及培養(yǎng)液對(duì)照孔外每孔加入50μL，置37℃中和60min。BHK-21細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、分散、計(jì)數(shù)，稀釋至4×105/mL，除培養(yǎng)液對(duì)照孔外每孔加入50μL細(xì)胞懸液，于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入50μL冷丙酮-20℃固定細(xì)胞1h，PBST洗滌后，將狂犬病病毒核蛋白熒光抗體稀釋至工作濃度，每孔加入50μL工作液，37℃孵育1h。PBST洗滌，熒光顯微鏡下觀察每個(gè)孔，孔內(nèi)有熒光細(xì)胞即記為感染，為陽(yáng)性；無(wú)熒光細(xì)胞為完全中和，為陰性。基于Spearman-Karber公式的推導(dǎo)公式計(jì)算待檢血清狂犬病病毒中和效價(jià)。

以犬免疫后血清狂犬病病毒中和抗體效價(jià)≥0.50IU/mL為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到或超過(guò)0.50IU/mL即具有效保護(hù)水平。

（四）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

檢測(cè)數(shù)據(jù)，采用SPSS18.0及Excel2007進(jìn)行分析處理。

三、結(jié)果與分析

（一） 93頭警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表1）。

93頭警犬中和抗體陽(yáng)性57頭，整體免疫合格率為61.29%。其中，南寧地區(qū)免疫合格率最高，為67.74%；梧州地區(qū)最低，為52.94%。兩者之間差異顯著（P<0.05）。

表1 93頭警犬RABV中和抗體檢效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

（二） 不同年齡的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表2）。

本次檢測(cè)將93頭警犬分成7～12月齡、1～2歲、3～6歲、6歲以上4個(gè)年齡組，其免疫合格率分別為75.00%、42.86%、64.91%、61.11%；分析表明：1～2歲的免疫合格率最低，僅為42.86%，明顯低于7～12月齡、3歲以上犬的免疫合格率，它們之間差異極顯著（P<0.01）。

表2 不同年齡的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

（三） 不同免疫次數(shù)的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表3）。

對(duì)93頭警犬，按照免疫次數(shù)分為免疫1次、免疫2～3次、免疫4次及以上3個(gè)組，其免疫合格率分別為46.67%、68.00%、62.26%。分析顯示，免疫1次的合格率與免疫2～3次、免疫4次及以上之間差異極顯著（P<0.01）。

（四） 不同疫苗免疫的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表4）。

使用A疫苗免疫的86頭警犬，陽(yáng)性54份，免疫合格率為62.79%。使用B疫苗免疫的警犬，合格率為75.00%；選用C疫苗、D疫苗的免疫合格率為0%。由于使用B、C、D疫苗的警犬?dāng)?shù)量分別為4頭、2頭、1頭，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)于不同疫苗之間的免疫效果不做統(tǒng)計(jì)分析。

（五） 不同體型犬種的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表5）。

本次檢測(cè)分析的警犬為中型犬種和大型犬種，結(jié)果顯示：中型犬的免疫合格率為53.33%，大型犬的免疫合格率為65.08%，兩者之間差異顯著（P<0.05）。

（六） 不同性別的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表6）。

結(jié)果顯示：檢測(cè)的62頭公犬，陽(yáng)性38份，免疫合格率為61.29%；檢測(cè)的31頭母犬，陽(yáng)性19份，免疫合格率為61.29%，兩者之間沒(méi)有差異。

（七） 不同采樣時(shí)間的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表7）。

表3 不同免疫次數(shù)的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

表4 不同疫苗免疫的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果 單位：份

表5 不同體型的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

表6 不同性別的警犬RABV中和效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

表7 不同采樣時(shí)間的警犬RABV中和效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

免疫后90d內(nèi)采樣，其免疫合格率可以達(dá)到95.65%（22/23）；而在免疫后100d采樣，其免疫合格率將出現(xiàn)下降，免疫后120～300d，免疫合格率為25.00%（5/20），免疫后 300d 以上為 60.00%（30/50）。

四、 討論

（一） 廣西區(qū)警犬狂犬病疫苗免疫合格率偏低。檢測(cè)的93頭警犬，其總體免疫合格率為61.29%，梧州的免疫合格率僅為52.94%。這一結(jié)果低于貴州（68.35%）、四川（76.06%）、海南（74.19%）的狂犬病疫苗免疫合格率。說(shuō)明需要加強(qiáng)該地區(qū)警犬狂犬病疫苗的免疫接種工作。

（二）無(wú)效免疫是導(dǎo)致免疫失敗的重要原因。廣西區(qū)3歲以上的檢測(cè)警犬共計(jì)75頭，免疫不合格數(shù)量則達(dá)到27頭，其中有10頭不合格警犬為南寧某警犬訓(xùn)練單位的全部被檢警犬，占不合格警犬?dāng)?shù)總數(shù)的37.04%，其抗體滴度則分布在0.03～0.10IU/mL之間。研究顯示：犬的中和抗體水平與免疫次數(shù)成正比，免疫次數(shù)越多，抗體水平越高，免疫合格率也就越高。而上述免疫不合格的10頭警犬，均按照規(guī)定的免疫程序至少有3～7次的狂犬病疫苗接種，檢測(cè)結(jié)果則說(shuō)明，該單位過(guò)去幾年的狂犬病免疫是無(wú)效免疫，未能達(dá)到有效的保護(hù)。需要進(jìn)一步地查找免疫失敗的原因，盡快調(diào)整免疫程序，以達(dá)到切實(shí)有效的免疫接種。

（三）采樣時(shí)間與采樣數(shù)量對(duì)免疫合格率有影響。本次調(diào)查結(jié)果顯示，在最后一次狂犬病疫苗免疫后的34d與60d采樣，免疫合格率均達(dá)到100.00%，而在免疫后90～360d采樣，中和抗體水平則出現(xiàn)不同程度的下降，免疫合格率相應(yīng)下降。到免疫330天以后抗體合格率以降至60%左右，說(shuō)明每年進(jìn)行一次狂犬病疫苗的加強(qiáng)免疫是必要的。

（四） 犬的體型大小對(duì)免疫合格率有影響。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)象包括大型犬種與中型犬種，其免疫合格率分別為65.08%、53.33%，差異顯著（P<0.05）。有研究證明：犬的體型大小和抗體反應(yīng)水平之間存在一種普遍的關(guān)系，體型較小的犬比體型較大的犬能產(chǎn)生更高的抗體水平。這可能的原因是相同劑量的疫苗，體型越小，抗體反應(yīng)就越強(qiáng)。本次試驗(yàn)中大型犬的免疫合格率高于中型犬的免疫合格率，這可能與采樣的數(shù)量及采樣時(shí)間距離免疫時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)。

（五） 犬的性別與免疫合格率沒(méi)有關(guān)系。本次調(diào)查中，公犬的免疫合格率為61.29%（38/62），母犬的為61.29%（19/31），兩者之間沒(méi)有差異，這與國(guó)外相關(guān)的研究結(jié)果一致，說(shuō)明犬的性別與免疫合格率沒(méi)有關(guān)系。

五、結(jié)論

本次調(diào)查結(jié)果顯示：應(yīng)加強(qiáng)廣西區(qū)警犬狂犬病疫苗接種工作，減少無(wú)效免疫；警犬的免疫合格率與采樣時(shí)間、采樣數(shù)量、免疫次數(shù)和體型大小有關(guān)，與性別沒(méi)有關(guān)系。