發(fā)酵前咖啡酸和迷迭香酸添加對(duì)干紅葡萄酒顏色與香氣的影響

李寧寧，張波*，牛見(jiàn)明，史肖，馬騰臻，韓舜愈*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州，730070) 3(甘肅省葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州，730070)

在葡萄酒的購(gòu)買(mǎi)和消費(fèi)過(guò)程中，人們常會(huì)選擇色度較深、氣味較濃郁的產(chǎn)品，所以顏色和香氣成為評(píng)價(jià)紅葡萄酒品質(zhì)的重要指標(biāo)[1-2]。但是紅葡萄酒中的色素性質(zhì)不穩(wěn)定，并且呈香物質(zhì)易揮發(fā)，使得葡萄酒在陳釀過(guò)程中常會(huì)出現(xiàn)色澤質(zhì)量降低和香氣物質(zhì)流失的現(xiàn)象。因此，為了提升葡萄酒的品質(zhì)，通常會(huì)通過(guò)優(yōu)化釀造工藝等手段對(duì)葡萄酒的顏色和香氣做調(diào)整[3]。

研究表明，輔色反應(yīng)是一種天然有效提升葡萄酒色澤的方式[4]。其中，酚類(lèi)化合物作為常見(jiàn)的輔色素物質(zhì)，借助其自身結(jié)構(gòu)中所含的π電子系統(tǒng)，可與缺少電子的花色苷烊鹽離子結(jié)合，形成“酚類(lèi)-花色苷”復(fù)合物，從而保護(hù)花色苷結(jié)構(gòu)，達(dá)到穩(wěn)定和增強(qiáng)顏色的效果[5]。LAMBERT等[6]通過(guò)向模擬紅葡萄酒體系中加入黃酮醇和酚酸進(jìn)行處理，與不加酚類(lèi)物質(zhì)的對(duì)照相比，添加處理的試驗(yàn)組樣品能夠使花色苷的色澤強(qiáng)度提高46%，穩(wěn)定性提升41%。而在酒精發(fā)酵前加入鞣花酸可使所釀造的干紅葡萄酒顏色穩(wěn)定性大幅提升，并且由于酚類(lèi)物質(zhì)的加入，使得紅酒體系中花色苷等多酚浸出率也得到加強(qiáng)[7]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，不同結(jié)構(gòu)類(lèi)型酚類(lèi)物質(zhì)的輔色效果亦有差異，這其中黃酮醇類(lèi)在所測(cè)化合物中的輔色能力最強(qiáng)，酚酸次之，而黃烷醇類(lèi)化合物的輔色效果相對(duì)較弱[8]。不過(guò)，TEIXEIRA等[9]在模擬試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，盡管黃烷醇類(lèi)物質(zhì)的輔色能力不佳，但依然能引起處理樣品在視覺(jué)上的顏色變化。

在酚類(lèi)物質(zhì)改善紅葡萄酒色澤的同時(shí)，有研究人員觀(guān)察到某些多酚類(lèi)物質(zhì)還可與酒中的香氣化合物作用，影響后者在體系中的溶解度和揮發(fā)性，進(jìn)而改變其感知程度[10]。ARONSON等[11]發(fā)現(xiàn)，柚皮苷和沒(méi)食子酸2種多酚在水溶液中可抑制香氣物質(zhì)的擴(kuò)散。而通過(guò)在體積分?jǐn)?shù)10%的水-醇溶液中加入一定量的兒茶素(>2 g/L)，可使己酸乙酯在體系氣相中的分配系數(shù)明顯降低[12]。類(lèi)似的結(jié)果在添加兒茶素等物質(zhì)的飲料貯藏試驗(yàn)中也有報(bào)道[13]。CHEN等[14]還檢測(cè)到，酚類(lèi)物質(zhì)處理能有效改善葡萄酒的香氣復(fù)雜性和感官特性。同時(shí)，研究認(rèn)為，酚類(lèi)物質(zhì)和香氣化合物的作用程度可能與反應(yīng)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān)[15]。

伴隨著葡萄酒科學(xué)研究的進(jìn)展，相關(guān)的檢測(cè)技術(shù)和測(cè)試手段也在不斷改善和發(fā)展。除利用感官評(píng)價(jià)或是較為簡(jiǎn)單的儀器對(duì)葡萄酒的品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定和分析外，一些性能優(yōu)良、靈敏度高的分析設(shè)備也逐漸被應(yīng)用，這其中以超高效液相色譜-質(zhì)譜(ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UHPLC-MS)，以及氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)等為代表的檢測(cè)儀器是目前在葡萄酒顏色分析和香氣測(cè)定過(guò)程中較為先進(jìn)的技術(shù)工具[16-17]。曹鵬等[18]利用UHPLC-MS方法對(duì)陳釀前添加酚類(lèi)輔色素的干紅葡萄酒進(jìn)行了測(cè)定，其數(shù)據(jù)結(jié)果除可反映葡萄酒中單體、?；⑦拎突ㄉ盏姆N類(lèi)和含量外，還能對(duì)酒中的其他酚類(lèi)化合物質(zhì)(黃酮醇、黃烷醇和酚酸等)進(jìn)行判斷。而GC-MS在應(yīng)用到葡萄酒香氣分析以來(lái)，已有1 300多種物質(zhì)被明確的定性檢測(cè)出[19]。這些科研結(jié)果為揭示葡萄酒研究中的未解問(wèn)題奠定了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

但是，盡管有上述研究發(fā)現(xiàn)和技術(shù)手段的支持，到目前為止，有關(guān)酚類(lèi)化合物參與的輔色化過(guò)程，以及對(duì)香氣的影響機(jī)制仍有很多疑問(wèn)亟待闡明，特別是大量的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)自于模擬反應(yīng)體系，與真實(shí)的發(fā)酵條件有較大的區(qū)別。因此，研究酚類(lèi)物質(zhì)在葡萄酒釀造過(guò)程中對(duì)顏色和香氣品質(zhì)的影響，將為相關(guān)的科研工作提供參考和幫助，對(duì)提升干紅葡萄酒的品質(zhì)有重要意義?？Х人崾瞧咸丫浦兄饕姆宇?lèi)化合物，迷迭香酸是咖啡酸的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物(由咖啡酸和丹參素酯化形成)，二者在結(jié)構(gòu)上相似，并且在自然界中均屬常見(jiàn)的多酚物質(zhì)。本試驗(yàn)擬通過(guò)發(fā)酵前添加上述酚類(lèi)化合物來(lái)研究其對(duì)干紅葡萄酒呈色效果及香氣物質(zhì)的影響，以期為進(jìn)一步開(kāi)展酚類(lèi)物質(zhì)在葡萄酒生產(chǎn)中的應(yīng)用提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄(VitisviniferaL., cv. Cabernet Sauvignon)，甘肅武威莫高釀酒葡萄種植基地，含糖量為23.3～24.0 °Brix。

釀酒酵母(D254)、乳酸菌(Oenococcusoeni)，法國(guó)Laffort公司；果膠酶，法國(guó)Lallemand公司；咖啡酸、迷迭香酸(食品級(jí))，陜西潤(rùn)生生物科技有限公司；二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、2-辛醇、甲酸、甲醇、乙腈(色譜純)，美國(guó)Sigma公司；L-蘋(píng)果酸、L-乳酸(色譜純)，上海源葉科技有限公司；乙醛、偏重亞硫酸鉀、沒(méi)食子酸、Na2CO3、NaOH、I2、KI、淀粉(分析純)，上海源葉生物科技有限公司；KCl、HCl、乙酸鈉、乙酸、NaCl(分析純)，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。費(fèi)林試劑、次甲基藍(lán)指示劑及酚酞指示劑等，均按GB/T 603—2002化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備進(jìn)行配制。

1.2 儀器與設(shè)備

1290超高效液相色譜、6460三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜、色譜柱(Poroshell 120 EC-C18，150 mm×2.1 mm×2.7 μm；DB-WAX，60 m×2.5 mm×0.25 μm)，美國(guó)Agilent Technologies公司；TRACE 1310氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；固相微萃取裝置、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅萃取頭，美國(guó)Surpelco公司；TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PHS-3EpH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 干紅葡萄酒的釀制

赤霞珠葡萄，經(jīng)人工粒選去除霉?fàn)€及生青果實(shí)；除梗破碎后均勻分裝在9個(gè)20 L的不銹鋼罐中，添加60 mg/L SO2，20 mg/kg果膠酶，并進(jìn)行未加酚酸、添加150 mg/L咖啡酸、添加150 mg/L迷迭香酸的處理[試驗(yàn)前參考已有文獻(xiàn)報(bào)道[7]，并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)添加的酚類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量濃度(100、150、200 mg/L)]進(jìn)行了篩選，最終確定使用量為150 mg/L)，每個(gè)處理3個(gè)平行；發(fā)酵前樣品先在4 ℃條件下恒溫冷浸漬48 h，之后解除溫度控制自然回溫至17 ℃，添加釀酒酵母啟動(dòng)酒精發(fā)酵；待酒精發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)行皮渣分離，添加商業(yè)乳酸菌啟動(dòng)蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵直到發(fā)酵結(jié)束；裝瓶陳釀6個(gè)月后取樣測(cè)定。

1.3.2 干紅葡萄酒理化指標(biāo)測(cè)定

酒精度，總糖，揮發(fā)酸，總酸，pH，游離SO2和總SO2參照GB/T 15038—2006葡萄酒、果酒通用分析方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 干紅葡萄酒理化指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 CIELAB顏色參數(shù)測(cè)定

利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，以蒸餾水為參比，使用2 mm光程比色皿測(cè)定，儀器掃描范圍為400～700 nm，掃描間隔為1 nm。在D65標(biāo)準(zhǔn)白光源和10°觀(guān)察者視場(chǎng)條件下，計(jì)算CIELAB顏色參數(shù)L*(亮度)，a*(紅/綠色度)，b*(黃/藍(lán)色度)。同時(shí)根據(jù)公式(1)～公式(5)計(jì)算色差(ΔEab*)、亮度變化率(ΔL)、色飽和度變化率(ΔC)和色調(diào)變化率(ΔH)[21]：

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

1.3.3.2 各類(lèi)型花色苷比率測(cè)定

參照BOULTON[20]的方法測(cè)定輔色花色苷比率(CA)、游離花色苷比率(FA)和聚合花色苷比率(PA)。葡萄酒樣品先調(diào)節(jié)pH值為3.60，使用2 mm光程比色皿，采用分光光度計(jì)在520 nm下測(cè)定，并利用公式(6)～公式(8)計(jì)算各類(lèi)型花色苷比率:

(6)

(7)

(8)

式中：Aacet為2 mL葡萄酒中加入20 μL 200 g/L乙醛，并避光靜置約45 min后的吸光值；ASO2為2 mL葡萄酒樣品中加入160 μL 50g/L SO2后的吸光值；Awine為100 μL葡萄酒樣品中加入1 900 μL模擬酒溶液后的吸光值(測(cè)量值乘以20，進(jìn)行稀釋校正)；各吸光值測(cè)定前通過(guò)配有濾膜(0.45 μm孔徑)的微型注射器進(jìn)行膜過(guò)濾。

1.3.3.3 總酚含量的測(cè)定

取1 mL樣品稀釋至10 mL，再取0.1 mL稀釋的樣品于10 mL的容量瓶中，加入6 mL純凈水，0.5 mL的福林-肖卡試劑，1.5 mL 200g/L的Na2CO3定容到10 mL。將配好的溶液在20 ℃下放置2 h，測(cè)定其在765 nm處的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(Y=0.001 2X+0.042 4，R2=0.997 5)計(jì)算總酚含量，結(jié)果以沒(méi)食子酸計(jì)(mg/L)。

1.3.3.4 總花色苷含量的測(cè)定

吸取0.5 mL的葡萄酒，用pH=1.0的緩沖液[V(0.2 mol/L KCl)∶V(0.2 mol/L HCl)=25∶67]定容至10 mL，在室溫下平衡10 min后，測(cè)定其在521、700 nm處的吸光值，分別表示為A521、A700。用同樣的方法測(cè)定樣品在pH=4.5緩沖液[V(0.2 mol/L 乙酸鈉)∶V(0.02 mol/L 乙酸)=1∶1]下的吸光值，利用公式(9)、公式(10)計(jì)算總花色苷含量：

(9)

A=(A521-A700)pH1.0-(A521-A700)pH4.5

(10)

式中：M為二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的分子量，493.2 g/mol；DF為稀釋倍數(shù)；比色皿光程為1 cm；ε為摩爾消光系數(shù)，28 000 L/(mol·cm)。

1.3.3.5 花色苷的UHPLC-MS測(cè)定

參照陳欣然等[21]的方法，采用UHPLC-MS聯(lián)用技術(shù)，樣品經(jīng)0.45 μm濾膜的注射器過(guò)濾后直接進(jìn)樣。使用Poroshell 120 EC-C18色譜柱，以V(甲酸)∶V(水)=0.2∶100作為流動(dòng)相A，V(甲酸)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=0.2∶50∶50作為流動(dòng)相B。洗脫程序?yàn)?～27 min，90%A～10%B；27～28 min，44%A～56%B；28～33 min，90%A～10%B；洗脫時(shí)間均為3 min。ESI正離子模式下，離子源溫度350 ℃，霧化器壓力35 psi，干燥氣流速12 L/min，干燥氣溫度350 ℃，掃描范圍m/z100～1 000。

花色苷的定性通過(guò)樣品圖譜信息與保留時(shí)間信息對(duì)比進(jìn)行判定?；ㄉ盏亩恳远谆ù渌?3-O-葡萄糖苷作為標(biāo)準(zhǔn)物，采用外標(biāo)法定量計(jì)算其他花色苷含量(mg/L)。

1.3.4 干紅葡萄酒香氣指標(biāo)測(cè)定

香氣物質(zhì)的檢測(cè)參照魯榕榕等[22]的方法，采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)。

香氣化合物的萃?。喝? mL酒樣于15 mL頂空瓶中，加入2.5 g NaCl和20 μL內(nèi)標(biāo)物(2-辛醇，88.2 mg/L)，加磁力攪拌轉(zhuǎn)子后迅速密封，然后將樣品置于恒溫磁力攪拌器中，在40 ℃水浴中平衡30 min后繼續(xù)進(jìn)行30 min頂空萃取。

GC-MS條件：使用DB-WAX色譜柱，升溫程序?yàn)槌鯗?0 ℃保持5 min，之后以4 ℃/min升至180 ℃保持15 min，載氣流速1 mL/min，進(jìn)樣口溫度240 ℃，采用不分流進(jìn)樣；電子轟擊離子源(EI)，電子能量70 eV，傳輸桿溫度180 ℃，離子源溫度200 ℃，質(zhì)譜掃描范圍m/z35～350。

香氣成分分析：香氣成分的定性采用質(zhì)譜信息、NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)對(duì)比，以及參考相關(guān)文獻(xiàn)相結(jié)合的方法進(jìn)行定性分析；香氣成分的定量采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析，各香氣成分含量(μg/L)=(各組分的峰面積×內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量)/(內(nèi)標(biāo)物峰面積×進(jìn)樣量)。

1.3.5 干紅葡萄酒感官評(píng)價(jià)

選擇10名具有一定釀酒經(jīng)驗(yàn)和經(jīng)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)的人員(6名女性和4名男性)對(duì)3款所釀葡萄酒進(jìn)行感官評(píng)定。供試酒樣以隨機(jī)順序提供給品嘗者。品鑒從視覺(jué)(顏色)，香氣(香氣強(qiáng)度、花香、果香)和風(fēng)味(甜味、酸味、酒體、余味長(zhǎng)短、異味)共9個(gè)屬性方面進(jìn)行，用8分結(jié)構(gòu)化數(shù)值進(jìn)行量化，0代表沒(méi)有感覺(jué)，8表示感覺(jué)最為強(qiáng)烈。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2013對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素方差分析(Duncan法，P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霞珠干紅葡萄酒的理化指標(biāo)

由表1可知，3種供試樣品的總糖含量均<4 g/L，酒精度在14.17%vol～14.42%vol，表明試驗(yàn)所釀制的紅葡萄酒符合國(guó)標(biāo)中干型葡萄酒的基本要求。同時(shí)，各樣品的揮發(fā)酸質(zhì)量濃度在0.43～0.47 g/L，總酸質(zhì)量濃度為3.73～5.52 g/L，pH在3.84～4.01水平，游離SO2和總SO2質(zhì)量濃度分別在17.10～19.90 mg/L和93.90～102.40 mg/L，以上指標(biāo)均符合國(guó)家GB/T 15037——2006的質(zhì)量規(guī)定。

表1 供試樣品的基本理化指標(biāo)Table 1 The basic physicochemical indexes of samples

注：表中同行不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 咖啡酸和迷迭香酸對(duì)赤霞珠干紅葡萄酒顏色的影響

2.2.1 CIELAB參數(shù)

試驗(yàn)采用CIELAB系統(tǒng)對(duì)供試干紅葡萄酒的顏色情況進(jìn)行了研究。由表2可知，發(fā)酵前添加酚類(lèi)物質(zhì)處理的樣品其L*值降低了0.9～1.5 a.u.，使得處理酒樣具有較深的顏色狀態(tài)(P<0.05)。同時(shí)，樣品的a*值也反映出添加酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)酒體紅色色度的加強(qiáng)。與對(duì)照相比，咖啡酸和迷迭香酸處理樣品的a*值分別提高了1.0和1.3 a.u.，這一現(xiàn)象與先前的研究結(jié)論相似[7]。與a*值變化相反，各處理葡萄酒的b*值總體呈現(xiàn)下降的變化(2.3～4.2 a.u.)，表現(xiàn)出添加酚酸可有效減弱酒體黃化的效果(P<0.05)。一般認(rèn)為，色素溶液中a*值的升高，以及L*和b*值的下降可能是輔色化過(guò)程中增色效應(yīng)和紅移變化的結(jié)果[23]。因此，這可能是導(dǎo)致處理樣品顏色提升的一種原因。另外，對(duì)比2個(gè)處理樣品發(fā)現(xiàn)，添加迷迭香酸樣品的b*值要遠(yuǎn)低于咖啡酸樣品11.5%(P<0.05)，表現(xiàn)為更加有效減緩酒體黃化速度的效果。

表2 供試樣品顏色參數(shù)、不同類(lèi)型花色苷比率以及總酚和總花色苷含量Table 2 The color parameters, ratio of different types of anthocyanins, and the content of total phenols and anthocyanins

注：-表示無(wú)

由表2可知，2個(gè)處理樣品的ΔEab*為2.5～2.7 a.u.。盡管ΔEab*在數(shù)值上<3.0，表明添加處理在此時(shí)還未能造成視覺(jué)上可辨別的顏色差異，但是結(jié)合上文中的其他顏色指標(biāo)，咖啡酸和迷迭香酸的處理仍對(duì)干紅葡萄酒的亮度和色調(diào)的改善產(chǎn)生影響。同時(shí)，比較添加兩酚類(lèi)物質(zhì)的樣品，我們還發(fā)現(xiàn)迷迭香酸的作用效果要優(yōu)于咖啡酸處理，例如其L*值比后者低0.6 a.u.，a*和ΔEab*比后者高0.3和0.3 a.u.，呈現(xiàn)出較深的紅色狀態(tài)。而通過(guò)計(jì)算樣品的輔色花色苷比率可以看到，迷迭香酸樣品的CA%要顯著高于對(duì)照和咖啡酸樣品(87.7%和61.3%，P<0.05)，從而證實(shí)在顏色差異上的判斷。分析造成ΔEab*的原因可以看出，由色飽和度變化率(ΔC)和亮度變化率(ΔL)引起的顏色差異較為重要(ΔC+ΔL=85.6%～86.0%)(表2)。相比之下，由色調(diào)變化率(ΔH)引起的顏色差異表現(xiàn)出較弱的影響效果(<14.4%)。研究認(rèn)為，ΔC和ΔL反映了ΔEab*的量變因素，而ΔH則主要與ΔEab*的質(zhì)變相關(guān)[24]。因此，添加酚類(lèi)處理造成的溶液ΔEab*改變，可能與其量變因素有關(guān)。

2.2.2 總酚和總花色苷含量

酚類(lèi)物質(zhì)的添加對(duì)樣品的總酚含量，特別是總花色苷含量有明顯的提升和穩(wěn)定作用[7]。陳釀起始時(shí)，各樣品總酚的平均含量為2 397 mg/L，經(jīng)過(guò)6個(gè)月的陳釀貯存后，雖然含量較試驗(yàn)之初有所降低，但處理樣品其含量仍顯著高于對(duì)照(平均高出約580 mg/L)，與所加入的150 mg/L添加量比較，我們可以看到處理在發(fā)酵過(guò)程中加強(qiáng)多酚物質(zhì)浸出的效果；同時(shí)，咖啡酸和迷迭香酸的添加將促進(jìn)輔色復(fù)合體的形成，并且上述物質(zhì)還可作為抗氧化劑進(jìn)一步減少花色苷的氧化降解，降低陳釀期間花色苷的損失(處理較對(duì)照高出46.4～92.7 mg/L)，這可能是處理樣品顏色效果提升的原因之一。不過(guò)具體的花色苷變化情況還需要我們做進(jìn)一步的分析。

2.2.3 花色苷的UHPLC-MS測(cè)定

利用UHPLC-MS方法在酒樣中可初步測(cè)定出5種單糖花色苷，10種?；突ㄉ蘸?5種吡喃型花色苷(表3)。其中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷及其衍生物在所檢測(cè)出的花色苷中含量最高，這與一些學(xué)者報(bào)道的有關(guān)歐亞種葡萄的色素含量特征相似[25]。比較樣品各花色苷類(lèi)型含量可知，單糖苷及酰化型花色苷占比較高，分別是50.9%～51.0%和34.1%～44.1%(圖1)，而吡喃型花色苷盡管在種類(lèi)數(shù)量上較優(yōu)(占總檢出數(shù)的50%，表3)，但是其含量卻相對(duì)有限(4.9%～14.0%)，考慮可能與較短的陳釀時(shí)間有關(guān)[22]。

圖1 供試樣品各類(lèi)型花色苷含量Fig.1 The concentration of different types of anthocyanins注：同類(lèi)型的不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(P<0.05)

在5種單糖花色苷中，各樣品的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷分別為25.1 mg/L(對(duì)照組)、29.6 mg/L(咖啡酸)和32.9 mg/L(迷迭香酸)?？梢钥闯觯砑犹幚砜捎行Х€(wěn)定二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量(處理較對(duì)照高出18.2%～31.4%)。同樣，其他4種單糖花色苷也不同程度地表現(xiàn)出處理對(duì)減少其含量降低的效果(5.9%～100.5%，除花青素和甲基花青素-3-O-葡萄糖苷的咖啡酸處理)。研究發(fā)現(xiàn)，在紅葡萄酒陳釀過(guò)程中，單糖花色苷等游離態(tài)色素會(huì)發(fā)生降解、聚合、沉淀或與其他物質(zhì)反應(yīng)導(dǎo)致其含量的下降[18]。而本試驗(yàn)中單糖花色苷較高的保留量說(shuō)明添加酚類(lèi)處理對(duì)陳釀過(guò)程中花色苷有保護(hù)和穩(wěn)定作用，這與ALCALDE-EON等[26]的研究結(jié)果類(lèi)似。

花色苷的糖分子上可酰化有機(jī)酸基團(tuán)，形成較為穩(wěn)定的?；突ㄉ?。常見(jiàn)的酰化基團(tuán)主要為羥基肉桂酸類(lèi)化合物。另外，乙酸、草酸、丙二酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸也是較為常見(jiàn)的酰化分子[25]。供試樣品中共檢測(cè)到10種?；突ㄉ眨謩e是乙酰和香豆?；衔铩Ｅc單糖苷類(lèi)花色苷呈現(xiàn)的趨勢(shì)相似，添加酚類(lèi)物質(zhì)的樣品也在一定程度上出現(xiàn)了酰化型花色苷含量維持在較高水平的特點(diǎn)(咖啡酸和迷迭香酸處理較對(duì)照高出0.6%～81.0%)。特別是迷迭香酸處理，其二甲花翠素乙?；?3-O-葡萄糖苷含量是對(duì)照的1.5倍，表現(xiàn)出明顯的差異(P<0.05)。

表3 供試樣品中花色苷質(zhì)量濃度 單位：mg/L

試驗(yàn)還檢測(cè)到乙烯類(lèi)、乙醛類(lèi)、乙烯基苯酚類(lèi)、乙烯基兒茶酚類(lèi)、乙烯基愈創(chuàng)木酚類(lèi)5種吡喃型花色苷。盡管其含量相對(duì)較低，但有研究顯示，游離態(tài)的花色苷在經(jīng)過(guò)吡喃化后可具有更強(qiáng)的顏色穩(wěn)定性[21]。例如，當(dāng)pH在1.0～5.0變化時(shí)，非吡喃化的游離態(tài)色苷色度會(huì)降低80%左右，而吡喃花色苷的色度卻沒(méi)有太大波動(dòng)[25]。對(duì)比表3可知，處理樣品的吡喃型花色苷在質(zhì)量濃度方面沒(méi)有類(lèi)似于前述花色苷的變化，其總質(zhì)量濃度分別是11.1 mg/L(對(duì)照組)、14.2 mg/L(咖啡酸)和5.7 mg/L(迷迭香酸)，考慮這可能與處理樣品較高的輔色化程度(13.4%～21.6%)，以及較短的貯藏時(shí)間有關(guān)。

2.3 咖啡酸和迷迭香酸對(duì)赤霞珠干紅葡萄酒香氣的影響

試驗(yàn)采用頂空萃取和GC-MS技術(shù)對(duì)各酒樣香氣物質(zhì)進(jìn)行了分析。由表4可知，共檢出74種香氣物質(zhì)，涉及酯類(lèi)(31種)，醇類(lèi)(20種)，酸類(lèi)(11種)，萜烯類(lèi)(8種)和醛類(lèi)(4種)5種類(lèi)型。

表4 供試樣品中香氣物質(zhì)含量 單位：μg/L

續(xù)表4

化合物閾值對(duì)照咖啡酸處理迷迭香酸處理香氣描述葉醇17.3±2.5b18.9±0.3b9.8±0.5a2,3-丁二醇1200022.2±3.5a34.6±6.3b44.4±1.8c黃油、乳酪正辛醇80032.8±1.2a72.9±1.8c38.6±2.7b茉莉香、檸檬味壬醇600126.6±4.7b88.8±0.0a126.9±1.6b水果、薔薇香癸醇50055.6±6.1b65.1±0.0c47.3±0.0a芐醇41301.9±3.9c127.9±9.5a218.2±6.1b苯乙醇110015356.5±130.4b19677.0±1.9c3482.9±71.2a玫瑰、花粉香異戊醇300009997.7±211.1b-3057.9±59.5a3-己烯-1-醇0.421.3±5.5a25.8±4.0b18.2±5.2a庚醇250030.9±3.7a27.9±4.8a-油膩味正丙醇50000-16.8±3.7b11.7±0.7a酒精味、成熟果香正丁醇--9.4±1.6小計(jì)32528.7±474.2c29051.1±162.6b11357.4±278.2a酸類(lèi)乙酸2000061.3±13.2a159.3±78.5c105.7±25.2b醋酸味辛酸1000929.5±47.9b1318.9±167.7c369.6±185.1a奶油味丁酸25009.8±4.6a11.5±0.5a-癸酸30000126.5±4.8b453.3±57.7c54.9±8.5a酸腐味、脂肪味異丁酸42012.7±1.7b-7.3±1.8a黃油、乳酪、餿味2-甲基己酸50149.2±8.8--3-羥基月桂酸-27.8±5.0b6.3±1.9a庚酸-15.2±0.0-2-羥基肉豆蔻酸-3.4±0.6-反式-3-己烯酸--470.4±0.0異辛酸--13.2±4.5小計(jì)1289.0±80.9b1989.4±310.0c1027.4±226.9a萜烯類(lèi)薄荷醇45.5±9.7--香茅醇40140.5±12.1c123.7±13.9b52.0±9.0a檸檬、柑橘香芳樟醇1530.7±2.4b26.9±3.2b18.0±2.7a玫瑰香、柑橘味γ-萜品醇16.5±1.3b33.7±3.7c9.4±3.4a反式-橙花叔醇70053.2±13.2b38.5±7.2a63.0±7.1c玫瑰、蘋(píng)果、青草味L-薄荷醇-27.7±1.1a37.1±3.7bβ-大馬士酮203.9±11.4a365.9±5.9c215.7±19.7b花香、果香、紫丁香香葉基丙酮60-57.1±7.1b29.9±1.9a青草味、果香味小計(jì)490.2±50.1b673.3±42.0c425.0±47.6a醛類(lèi)苯甲醛210098.5±3.6b43.4±0.0a129.1±12.1c烘烤味、杏仁味壬醛-15.2±0.7b10.3±0.0a8.0±2.0a糠醛-35.4±2.0b37.4±0.0b17.6±8.0a癸醛1017.0±1.6a15.7±0.0a-香皂、橙皮味小計(jì)166.0±7.9b106.8±0.0a154.7±22.0b總計(jì)58734.1±525.6b59207.4±615.3b38922.2±458.9a

注：-表示樣品中未檢出該物質(zhì)；表中閾值來(lái)源于相關(guān)文獻(xiàn)[27-28]

酯類(lèi)物質(zhì)是葡萄酒中最主要的一類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)，其賦予葡萄酒濃郁的花香、果香。通常認(rèn)為酯類(lèi)物質(zhì)主要是由脂肪酸氧化、氨基酸代謝以及醇醛酯化等反應(yīng)途徑生成[27]。由表4可知，本試驗(yàn)所測(cè)酒樣共檢出酯類(lèi)物質(zhì)31種(對(duì)照25種、咖啡酸29種、迷迭香酸25種)。結(jié)合酯類(lèi)物質(zhì)的香氣描述可知，乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、琥珀酸二乙酯和月桂酸乙酯等表現(xiàn)果香、花香氣味的酯類(lèi)物質(zhì)在各樣品中均具有較高含量水平(都高于各自對(duì)應(yīng)的閾值)，對(duì)葡萄酒的香氣有較大貢獻(xiàn)。但與對(duì)照相比，咖啡酸處理酒樣中的這些酯類(lèi)物質(zhì)含量有所增加(14.2%)，表現(xiàn)出更加明顯的氣味特征，這與本實(shí)驗(yàn)中的感官評(píng)價(jià)結(jié)果相一致(圖2)。而迷迭香酸處理酒樣卻與前者效果相異，盡管其全部酯類(lèi)化合物總含量較對(duì)照樣品高出7.0%，但上述的酯類(lèi)物質(zhì)卻呈現(xiàn)含量減少的現(xiàn)象(63.6%)，這一差異直接導(dǎo)致迷迭香酸處理樣品在感官評(píng)價(jià)中與咖啡酸的不同(圖2)。

葡萄酒中的醇類(lèi)化合物主要由酵母細(xì)胞酒精發(fā)酵過(guò)程中的糖代謝以及由氨基酸脫羧、脫氫產(chǎn)生，也是葡萄酒香氣物質(zhì)的重要組成[28]。盡管處理樣品中正丙醇、正辛醇等具有花香、果香氣味的醇類(lèi)含量有較大程度的增加(P<0.05)，但是處理酒樣的醇類(lèi)物質(zhì)總量卻明顯降低(咖啡酸和迷迭香酸處理分別較對(duì)照降低了10.7%和65.1%)。從檢測(cè)到的16種醇類(lèi)物質(zhì)含量來(lái)看，正戊醇、異戊醇、正己醇和苯乙醇等香氣化合物的含量相對(duì)較高(占醇類(lèi)物質(zhì)總量的95.1%～98.0%)。其中具有草本植物和青草味的正己醇在處理樣品中的含量明顯降低(較對(duì)照降低了11.8%～18.1%)，考慮這將有助于弱化酒樣的生青感。同時(shí)，具有玫瑰樣氣味的苯乙醇在咖啡酸處理樣品中維持較高水平(是對(duì)照樣品含量的1.3倍)，這有可能在一定程度上提升其香氣的整體品質(zhì)。

葡萄酒中的脂肪酸類(lèi)化合物來(lái)源于酵母菌和乳酸菌代謝的副產(chǎn)物。少量的酸類(lèi)有助于改善葡萄酒的風(fēng)味，但其含量過(guò)高時(shí)則一般具有油脂、酸腐以及奶酪的氣息，會(huì)產(chǎn)生令人不愉快的感覺(jué)[28]。各試驗(yàn)酒樣酸類(lèi)化合物的種類(lèi)數(shù)目無(wú)明顯差異，但經(jīng)咖啡酸和迷迭香酸處理酒樣其酸類(lèi)物質(zhì)總含量相較對(duì)照有顯著差別(P<0.05)。其中咖啡酸處理樣品中的酸類(lèi)物質(zhì)含量增加了54.3%，而迷迭香酸處理卻降低了20.3%。例如，咖啡酸處理中辛酸(有奶油氣味)含量分別高于對(duì)照和迷迭香酸處理41.9%和256.8%，且超過(guò)閾值水平，考慮這將會(huì)對(duì)咖啡酸處理樣品帶來(lái)一定的負(fù)面影響。

萜烯類(lèi)化合物作為葡萄酒的品種香氣，主要以鍵合態(tài)的形式存在，釀造過(guò)程可在糖苷酶的作用下將其轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)的香氣物質(zhì)，從而賦予葡萄酒濃郁的花香和果香[28]。試驗(yàn)共定性出8種萜烯類(lèi)化合物，其中咖啡酸處理可明顯提高酒中萜烯類(lèi)化合物含量(較對(duì)照高出37.3%)，推測(cè)可賦予該處理葡萄酒樣品強(qiáng)烈的花香、果香，從而增強(qiáng)其酒體香氣的復(fù)雜性。此外，試驗(yàn)還初步定性出4種醛類(lèi)物質(zhì)，其中苯甲醛在迷迭香酸處理中含量相對(duì)較高(分別是對(duì)照和咖啡酸處理的1.3和2.9倍)，結(jié)合香氣描述，推測(cè)可賦予產(chǎn)品一定的烘烤和杏仁風(fēng)味。

2.4 感官品質(zhì)分析

對(duì)所有酒樣進(jìn)行感官分析，各處理酒樣在余味長(zhǎng)短和酒體方面得分無(wú)顯著性差異(圖2)。從顏色方面來(lái)看，咖啡酸和迷迭香酸處理的酒樣擁有較好的色度、色調(diào)特點(diǎn)。在香氣方面，咖啡酸處理的酒樣花香、果香較為突出，而迷迭香酸處理的樣品卻在酸度、甜度、花香、果香得分較低。

圖2 感官分析雷達(dá)圖Fig.2 Radar chart of sensory analysis

3 討論

本試驗(yàn)中咖啡酸和迷迭香酸的添加提升了葡萄酒的整體顏色質(zhì)量以及總酚、總花色苷的含量。這主要是與咖啡酸和迷迭香酸作為輔色素同酒中花色苷發(fā)生輔色作用，促進(jìn)酚類(lèi)物質(zhì)浸提，保護(hù)花色苷的降解有關(guān)。酚類(lèi)輔色素苯環(huán)中的共軛C=C雙鍵結(jié)構(gòu)，可以增強(qiáng)其與花色苷之間的π-電子離域，使得花色苷的吸收光譜發(fā)生變化，產(chǎn)生增色和紅移效應(yīng)[29]，考慮這可能是造成咖啡酸和迷迭香酸處理酒樣具有較好顏色狀態(tài)的主要原因之一。另外，反應(yīng)體系中不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的輔色素將對(duì)花色苷的有色質(zhì)子化程度產(chǎn)生影響，抑制因水化和去質(zhì)子化反應(yīng)產(chǎn)生的無(wú)色化合物生成，形成不同的顏色效果[20]。觀(guān)察迷迭香酸的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，相比于咖啡酸，其結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)多酚平面，且2個(gè)酚環(huán)之間有較長(zhǎng)碳鏈，使其在與花色苷發(fā)生輔色作用時(shí)能夠更靈活的調(diào)整其空間構(gòu)象，這可能是造成迷迭香酸輔色能力較強(qiáng)的原因之一[23]。

試驗(yàn)檢測(cè)出的各類(lèi)花色苷中，咖啡酸和迷迭香酸處理酒樣的單糖花色苷比對(duì)照酒樣分別高出了11.8%和28.6%，?；ㄉ辗謩e高出0.9%和49.9%。單糖花色苷是賦予新鮮葡萄酒色澤的主要成分，酚類(lèi)物質(zhì)添加可促進(jìn)發(fā)酵階段單糖花色苷的提取并降低其在陳釀期間的降解，這一結(jié)果與張波等[4]的研究結(jié)論一致。此外，酒樣中較高含量的?；突ㄉ湛蛇M(jìn)一步提高花色苷的穩(wěn)定性，影響葡萄酒的陳釀潛能，改善葡萄酒的感官特性，使得樣品具有更好的顏色狀態(tài)[30]。因此，在陳釀過(guò)程中紅葡萄酒顏色的變化除可部分歸因于輔色作用對(duì)花色苷類(lèi)物質(zhì)的穩(wěn)定效果外，?；突ㄉ蛰^高的含量水平以及自身的穩(wěn)定特性也是導(dǎo)致其顏色增強(qiáng)的原因。

目前為止，酚類(lèi)物質(zhì)是如何影響揮發(fā)性化合物的研究還鮮有報(bào)道。本研究中添加咖啡酸和迷迭香酸處理對(duì)赤霞珠葡萄酒中香氣物質(zhì)的含量具有不同效果。其中，經(jīng)咖啡酸處理的酒樣香氣物質(zhì)種類(lèi)和含量均有所增加，賦予樣品復(fù)雜的香氣特點(diǎn)，這與CHEN等[14]的研究結(jié)果相似，其認(rèn)為酚類(lèi)物質(zhì)可改變葡萄酒的香氣復(fù)雜性，防止顏色損失并增強(qiáng)葡萄酒的圓潤(rùn)度。同時(shí)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸處理酒樣的香氣化合物與對(duì)照相比減少了33.7%，造成這種差異的原因可能與咖啡酸和迷迭香酸分子本身的化學(xué)屬性有關(guān)，但這2種物質(zhì)與揮發(fā)性化合物之間具體的互作關(guān)系尚不清楚，因此酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)揮發(fā)性化合物的影響還需從機(jī)理上做進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

發(fā)酵前添加150 mg/L咖啡酸和迷迭香酸處理均可增強(qiáng)赤霞珠干紅葡萄酒的顏色強(qiáng)度，顯著增加樣品中總酚和總花色苷含量，且迷迭香酸處理效果要優(yōu)于咖啡酸。

花色苷類(lèi)物質(zhì)的UHPLC-MS分析發(fā)現(xiàn)，樣品中共有30種花色苷被檢出(包括5種單糖花色苷，10種酰化型花色苷和15種吡喃型花色苷)，供試樣品在各類(lèi)花色苷物質(zhì)種類(lèi)上無(wú)差異，但發(fā)酵前添加酚類(lèi)物質(zhì)均可提高葡萄酒中花色苷的含量，特別是迷迭香酸處理后的?；突ㄉ?。

香氣物質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，咖啡酸處理提升了葡萄酒中酯類(lèi)、酸類(lèi)、萜烯類(lèi)化合物的含量，降低了醇類(lèi)和醛類(lèi)化合物的濃度。迷迭香酸處理的葡萄酒中酯類(lèi)化合物含量升高，但醇類(lèi)、酸類(lèi)、萜烯類(lèi)和醛類(lèi)卻有所降低。感官分析可知，咖啡酸處理提升了酒體香氣的復(fù)雜性，使其具有濃郁的花香、果香氣味和較低的生青感，而迷迭香酸處理的樣品卻在酸度、甜度、花香、果香方面表現(xiàn)較差。