sn-2長鏈多不飽和脂肪酸單甘酯的制備及其影響因素研究

王強，謝躍杰，李園園，魏華恒，賀稚非，李洪軍*

1(西南大學 食品科學學院，重慶,400715)2(重慶第二師范學院,脂質資源與兒童日化品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶,400067)

脂肪酸在甘油骨架上的位置分布是影響脂類物理行為和代謝的主要原因之一[1]。通常情況下，脂肪酸只有在消化甘油三酯后以非酯化的游離脂肪酸或2-MAG的形式才能被吸收，如果將生物活性功能更高的脂肪酸接入至甘油三酯的sn-2位則有利于此類脂肪酸對健康發(fā)揮更大的作用[2]。DHA等n-3長鏈多不飽和脂肪酸(n-3 LC-PUFA)已被廣泛用作液體和固體強化食品(如嬰兒配方奶粉等)中的重要功能性成分，其對神經(jīng)系統(tǒng)以及心血管預防等方便具有廣泛的功能作用。有研究表明[3-4]，富含n-3 LC-PUFA的2-MAG易被吸收，當PUFA位于sn-2位置時，其吸收效果要優(yōu)于位于sn-1,3位置或隨機分布狀態(tài)。因此，如何將n-3 LC-PUFA接入甘三酯的sn-2位就成為能夠提高n-3 L-CPUFA穩(wěn)定性及腸道消化吸收的最佳方案。

現(xiàn)有化學法合成2-MAG需要較高的溫度和較長的反應時間，高溫會促使2-MAG發(fā)生?；w移并誘發(fā)n-3 LC-PUFA的氧化，所以富含DHA的2-MAG需要更溫和的反應方式及條件。由于酶促反應是在溫和的條件下進行的，減少了對溫度敏感的底物和產(chǎn)品原有性能的損失[5]，因此酶法制備對2-二十二碳六烯基單甘脂(2D-MAG)具有積極作用。由于商業(yè)化的脂肪酶要么是sn-1,3特異性的，要么是非特異性的，因此只有通過對甘油三酯的特異性酶催化醇解反應才能制備出產(chǎn)率高、副產(chǎn)物少的2-MAG[6]。

魚油和藻油均是DHA目前主要的來源途徑，由于魚油脂肪酸組成復雜，除了DHA以外其EPA的含量也較高，這增加了魚油單體PUFA組成及濃度測定的難度。相比之下，藻油中含有豐富的DHA(EPA含量較低)，且藻油在工業(yè)規(guī)模上很容易培養(yǎng)，是結構脂理想的高度純DHA供給體。本研究以藻油為原料，擬通過乙醇分解法合成2D-MAG并用溶劑萃取法進行純化富集，通過脂肪酶種類(Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM、Novozym 435、Lipase AK、Lipase AY 和Newlase F)、藻油與乙醇的底物摩爾比、反應時間、反應溫度和脂肪酶重復利用次數(shù)等影響條件研究2D-MAG酶法合成的最佳制備方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藻油，青島科源海洋生物有限公司Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM、Novozym 435、Lipase AK、Lipase AY、Newlase F，諾維信(中國)生物技術有限公司;脂肪酸甲酯標準品(色譜純，37種)、二油酸甘二脂、2-油酰甘一酯、1-油酰甘一酯,Sigma(上海)公司;正己烷、異丙醇、無水乙醇、乙腈均為色譜純，上海阿拉丁生化科技公司；其余試劑均為分析純。

7890A氣相色譜儀，安捷倫科技(上海)有限公司；S25磁力攪拌器，德國IKA；TG1650-WS臺式高速離心機，上海盧湘儀離心機儀器公司；R-1002旋轉蒸發(fā)儀，鄭州長城儀器有限公司；AR1140電子分析天平，美國奧豪斯貿(mào)易公司；DSY-III氮吹儀，金科精華苑科技有限公司；DHG-9202-2SA恒溫烘箱，常州一諾儀器制造有限公司；UPLC LC-30A超高效液相色譜儀，日本Shimadzu儀器有限公司；AVANCE 500MHz核磁共振譜儀，瑞士Bruker儀器有限公司

1.2 實驗方法

1.2.1 單甘脂的酶法制備

單甘脂的制備方法按照MUNIO等[7]方法并做適當?shù)男薷模悍Q取0.9 g海藻油和適量無水乙醇加入至50 mL具塞錐形瓶中，加入0.4 g的固定化脂肪酶(4%～16%，底物質量分數(shù))，在轉速為200 r/min、30～55 ℃反應條件下進行磁力攪拌4～16 h。將反應混合物離心后過濾除去脂肪酶。取一定量離心樣品，加入30 mL正己烷和10 mL 0.8 mol/L的KOH醇溶液(30%乙醇)，劇烈振蕩2 min后靜置5 min。下層醇-水溶液中加入15 mL正己烷進行二次提取，劇烈振蕩2 min后靜置分層。形成兩層后收集富含2D-MAG的乙醇相，以相同體積的正己烷洗滌2次。合并2次萃取所得上清液，在40 ℃水浴溫度下旋轉蒸發(fā)去除有機溶劑，所得樣品稱質量后置于-20 ℃冰箱保存用于后續(xù)分析。另外收集固定化酶，用無水乙醇/正己烷(體積比1∶1)洗滌3次后，對回收的固定化酶進行真空處理，去除有機溶劑稱重后計算得率。用相同流程分別考察反應時間、反應摩爾比、脂肪酶負載、反應溫度等參數(shù)下2D-MAG的得率。

1.2.3 單甘脂的TLC分析

參考TURON等[8]方法用薄層色譜 (TLC)分析反應產(chǎn)物脂肪酸乙酯(fatty acid ethyl esters, FAEEs),甘油三酯(triacylglycerols，TAGs), 游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FAs), 甘油二酯(diacylglycerols, DAGs),甘油一酯(monoacylglycerols，MAGs)：薄層色譜硅膠板預先在105 ℃烘箱中預先活化1 h。用200 μL正己烷-二乙醚溶液(體積比84∶16)稀釋10 μL反應樣品，用毛細管將1 μL樣品點在活化后的薄層板上，置于爐溫為120 ℃烘箱中5 min以揮發(fā)溶劑。將V(正己烷)∶V(二乙醚)∶V(甲酸)=84∶16∶0.04混合溶液噴涂在薄層板上展開，用碘蒸氣顯色，根據(jù)各反應物的條帶和比移值確定油脂類型。用5%硼酸-甲醇溶液浸潤薄層色譜板以防止2-MAG和1-MAG由于?；w移形成的異構化。將目標條帶刮下用氣相色譜法分析2D-MAG脂肪酸組成。

1.2.4 UPLC-MS/MS分析單甘脂組成

用超高效液相色譜—三重四級桿串聯(lián)質譜對反應產(chǎn)物的組成進行分析。將2 μL樣品注入至超高效液相色譜進行檢測。在分析過程中，流速保持在0.4 mL/min；柱溫60 ℃；樣品室溫度4 ℃。流動相A：V(水)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1∶1(含5 mmol/L NH4Ac)；流動相B：V(異丙醇)∶V(乙腈)=5∶1。梯度洗脫條件： 0.5 min，20% B相；1.5 min，40% B相；3 min，60% B相；13 min，98% B相； 13.1 min，20% B相；17 min，20% B相。

質譜條件：AB Sciex Triple TOF 6600，離子化方式：電噴霧離子化源，檢測方式正離子檢測；一級質譜采集的質量數(shù)范圍為m/z50～1 200，質譜條件如下：氣簾氣壓力0.24 MPa；離子源氣體1(N2)壓力為0.34 MPa；離子源氣體2(N2)壓力為0.34 MPa；離子噴霧電壓5.5 kV；噴霧器溫度 600 ℃。

1.2.5 GC-FID法測定單甘脂脂肪酸組成

脂肪酸甲酯化采用WANG等[9]方法進行分析：用2 mL 0.5 mol/L NaOH-CH3OH與3 g樣品在60 ℃下皂化30 min，并在60 ℃下與14%三氟化硼反應5 min。反應完成后，用約2 mL己烷萃取脂肪酸甲酯，然后計算所得的MAGsn-2位置上脂肪酸組成的摩爾百分比。

氣相色譜條件：色譜柱為FFAP 毛細管柱(Agilent，30 mm×0.25 mm×0.5 μm); 檢測器為FID。載氣為N2，流速設定為1.0 mL/min，進樣口壓力為0.24 MPa，分流比設定為30∶1。初始爐溫設置為140 ℃保持1 min，然后以10 ℃/min的速度增加到230 ℃并保持8 min。檢測器的溫度保持在280 ℃。根據(jù)脂肪酸的標準分析，峰值時間和相對峰面積將用于脂肪酸甲酯的定量和定性分析。

1.2.6 單甘脂的純化

在ESTEBAN等[10]提出的優(yōu)化方法基礎上，采用溶劑萃取法對2-MAG進行純化。將1 g無溶劑產(chǎn)物溶解于15 mL正己烷中，然后加入10 mL 85%乙醇水溶液，將混合溶液轉移到分離漏斗中靜置分層。形成兩層后，去除含有酯類和未反應甘油三酯殘基上層，保留含2D-MAG的萃取層。將下層有機相在40 ℃水浴條件下旋轉蒸發(fā)揮干其他有機相，然后將樣品加入至V(乙醇)∶V(正己烷)=90∶10溶液中以3 500 r/min的速度離心5 min，吸取上層2D-MAG的己烷相，置于-18 ℃冰箱中用于后續(xù)的定性定量分析及酯化反應。

1.2.7 單甘脂的定量分析[11]

加入2-油酸單甘脂作為外標，根據(jù)其出峰面積對目標單甘脂峰面積進行比較，含量計算如公式(1)所示：

(1)

式中：WS，2D-MAG百分含量，Ri，外標物峰面積：P標，標樣質量濃度，mg/mL；AS，樣品中2-MAG峰面積；A標，外標物2-油酸單甘脂峰面積；MS，樣品質量，mg。

1.2.8 統(tǒng)計學方法

所有試驗均使用現(xiàn)制備的樣品、重復進行3次。采用SPSS 17數(shù)據(jù)處理軟件，各組數(shù)據(jù)結果均以平均值±SD(n=3)表示，并進行方差分析，LSD法進行多重比較，P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結果與分析

2.1 藻油總脂肪酸及sn-2位脂肪酸組成分析

通過對藻油脂肪酸組成(表1)進行分析可知，C22∶6(44.37%)和C16∶0(27.5%)是藻油主要的脂肪酸成分，除此以外，C22∶5、C14∶0和C18∶1含量也較多，分別達到7.42%，6.21%和5.37%。在藻油總脂肪酸中，多不飽和脂肪酸大多數(shù)是具有生理活性的n-3 PUFA，其含量約占藻油PUFA含量的85.38%。在藻油甘油三酯的sn-2位置上DHA含量最高(47.38%)，其次是C16∶0(18.85%)和C22∶5(11.34%)。PUFA在藻油sn-2位的比例高達64.29%，這表明藻油是sn-2長鏈多不飽和脂肪酸結構脂較為理想的制備原料。目前，已有多個商品化的DHA藻油上市，其中主要以裂壺藻和吳肯氏藻種類居多，本實驗選用的吳肯氏藻油通常被用于DHA的供體來源，盡管不同藻類脂肪酸組成有所差異，但大多數(shù)藻油的DHA含量均較其他來源高，是僅次于魚油提供豐富DHA的理想來源[12]。

2.2 單甘脂合成脂肪酶的篩選

與化學法制備2-MAG相比，脂肪酶催化具有位置專一、反應條件溫和、產(chǎn)物不殘留有機溶劑等優(yōu)勢，更適宜于長鏈多不飽和脂肪酸單甘脂的制備。由于脂肪酶的來源不同，其穩(wěn)定性、催化活性和底物專一性也有較大的差異。為了篩選出最適宜催化2D-MAG的特異性脂肪酶，本研究對分別來自于南極假絲酵母(Candidaantarctica)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosa)、雪白根霉(Rhizopusniveus)、皺褶假絲酵母(Candidarugosa)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的6種不同商業(yè)脂肪酶Novozym 435、Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM、Newlase F、Lipase AY和Lipase AK進行篩選和測試。

表1 藻油總脂肪酸及sn-2位脂肪酸含量Table 1 The composition and positional of fatty acid of algae oil

注：NF表示未檢出

由圖1可知，在酶催化藻油的醇解反應中，不同酶催化2D-MAG含量具有較大差異。6種脂肪酶催化生成2D-MAG的活性由高到低依次為：Lipozyme RM IM >Novozym 435 >Lipozyme TL IM >Newlase F > Lipase AK > Lipase AY。其中，Lipozyme RM IM 和Novozym 435催化形成2D-MAG的含量相對較高，分別為34.7%和28.1%，這反映出Lipozyme RM IM較其他脂肪酶的催化能力更強。Lipozyme TL IM及Lipase AK和Newlase F催化藻油形成2D-MAG的含量分別為13.3%, 9.6%和11.3%，顯著低于Lipozyme RM IM 和Novozym 435(P<0.05)。有研究[13]發(fā)現(xiàn)Novozym 435在過量乙醇溶液中能夠有效提高其對結構脂的催化能力。但是對于Lipozyme RM IM而言，適當?shù)乃軌蚓S持其催化活性，過量的乙醇反而會奪取Lipozyme RM IM活性位點周圍的水分子從而導致其催化能力下降[14]，這表明脂肪酶在不同反應溶劑體系中的催化能力是有差異的。由于脂肪酶具有蛋白結構，蛋白質在乙醇存在的環(huán)境中發(fā)生變性的閾值會受到環(huán)境因素的改變而存在差異，這或許是解釋為何同樣是特異性脂肪酶，但其催化能力在不同含水環(huán)境中有明顯不同的主要原因。

圖1 不同種類脂肪酶對藻油2D-MAG含量的影響Fig.1 The effect of different lipases on the production of 2D-MAG注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

甘油三酯上sn-2?；恢镁哂休^大的空間位阻，sn-2位置較sn-1,3更難以?；?。因此，具有相同特異性脂肪酶的催化效果受空間位阻及脂肪酸結構的影響較大。與脂肪酶Novozym 435和LipozymeTL IM相比，Lipozyme RM IM是具有特異性的固定化商業(yè)化脂肪酶，能區(qū)域和立體選擇性催化甘油三酯sn-1,3位發(fā)生水解、酯化和酯交換反應，價格更低且催化2D-MAG能力較好，故本實驗采用Lipozyme RM IM制備2D-MAG。

2.3 單甘脂的合成及純化

薄層色譜(TLC)是一種簡單的反應產(chǎn)物定性方法，它能夠利用各組分在固定相分離差異的不同簡單、快速的對產(chǎn)物進行定性。本實驗分別對藻油、2D-MAG及純化后2D-MAG進行了TLC分析。根據(jù)薄層色譜中斑點的比移值(Rf)對各組分進行了初步判斷(圖2)，結果顯示藻油中分別含有單甘脂(Rf≈0.05)、游離脂肪酸(Rf≈0.1～0.4)、甘油二酯(Rf=0.48)和甘油三酯(Rf≈0.70)。通過酶法催化藻油與乙醇反應得到的2D-MAG在TLC板中僅出現(xiàn)1個斑點(Rf≈0.06)，初步斷定實驗制備的最終產(chǎn)物中單甘脂含量較多。由于產(chǎn)物未經(jīng)純化，因此TLC的斑點有拖尾現(xiàn)象。通過對2D-MAG進一步萃取純化后，2D-MAG的斑點拖尾現(xiàn)象消失且斑點更加集中，表明本實驗用Lipozyme RM IM催化藻油醇解形成了單甘脂，且純化方法提高了單甘脂的純度，但單甘脂的組成及類型還有待于用其他手段加以表征。

圖2 不同種類結構脂薄層色譜圖Fig.2 The TLC of different structural lipids

2.4 單甘脂的定性定量分析

圖3顯示的是2D-MAG樣品在純化前和純化后的HPLC結果。2D-MAG分別在4.9 min和5.5 min有最大樣品峰出現(xiàn)，表明同時存在2種單甘脂或分子內發(fā)生了?；D移現(xiàn)象。一般條件下單甘酯是1-MAG和2-MAG的混合物，這是由于分子內酰基轉移的活化能比較低[15-16]。經(jīng)過純化處理后，2D-MAG僅在5.5 min處有最大樣品峰且未見4.9 min的樣品峰，這表明本研究采用的溶劑萃取法能夠在低溫條件下結晶分離得到純度為88.5%的2D-MAG，通過結構脂的TLC和HPLC均證明了該制備方法和純化方法是可靠有效的。

圖3 純化前后樣品中2D-MAG液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of 2D-MAG in crude reaction mixture and after purification.

圖4 純化后樣品中2D-MAG的13C NMR譜圖Fig.4 13C NMR spectrum of synthetic 2D-MAG after purification.

通過對13C的譜圖(圖4)分析不難看出，NMR的結果為13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 14.4, 20.68,22.74, 25.66, 25.71, 25.76, 33.99, 34.12, 62.29, 69.15, 77.23, 77.48, 127.14, 127.76, 127.98, 128.09, 128.18, 128.35, 128.37, 128.43, 128.66, 129.58, 129.6, 132.1, 172.55，其中，飽和碳的化學位移在核磁圖譜中的高場區(qū)域，在14.4～77.48 ppm，其中連接羥基的碳的化學位移在77.23 ppm與77.48 ppm處。烯基碳的化學位移在127.14～132.1 ppm，羰基碳的化學位移在核磁圖譜的低場區(qū)，其化學位移為172.55 ppm。根據(jù)13C NMR結果可證實2D-MAG的結構符合預期。

2.5 反應底物摩爾比對單甘脂合成產(chǎn)物的影響

在酶法催化合成2D-MAG反應過程中，底物物質的摩爾比(藻油與乙醇, 摩爾比)、加酶量、反應時間、反應溫度均會影響反應進程及產(chǎn)物得率。在脂肪酶催化甘三酯醇解反應中，反應達到平衡后產(chǎn)物的組成與底物物質的摩爾比有密切關系。由圖5可知，隨著底物中藻油與乙醇摩爾比的升高，2D-MAG 的生成率顯著增加(P<0.05)，當藻油與乙醇摩爾比為1∶80時2D-MAG的生成比例為37.2%，均高于其他實驗組(P<0.05)。理論上講，生成1 mol 2D-MAG需要1 mol甘油三酯和2 mol乙醇，但實際上當藻油與乙醇摩爾比為1∶2時2D-MAG的生成量僅為4.4%。IRIMESCU等[17]和ZHANG等[18]均發(fā)現(xiàn)在較低藻油乙醇比例時，無論是1-MAG或是2-MAG得率均較低，這被推測是由于大部分甘油完全脫酰并轉化為乙酯(EEs)和甘油。隨著底物物質摩爾比的升高，1,2-DAG的生成量顯著提高，當藻油與乙醇摩爾比為1∶40時，1,2-DAG的生成量開始下降至12%。IRIMESCU等[17]研究發(fā)現(xiàn)當溫度或溶劑發(fā)生較大改變時，1,2-DAG、1,3-DAG與2-MAG之間存在?；D移的現(xiàn)象，且這種現(xiàn)象與不飽和脂肪酸?；忻黠@的相關性[17]。與1,2-DAG相比1,3-DAG穩(wěn)定性較差，容易受到外界條件的改變呈現(xiàn)下降趨勢。由圖5可以看出，1,3-DAG含量在藻油與乙醇摩爾比為1∶2時最高(14%)，隨著底物摩爾比升高其含量快速下降，潛在的原因在于當?shù)孜餄舛炔辉偈敲复呋钸m比例時，Lipozyme RM IM可特異性催化1,3-DAG的sn-1,3位?；鶎е缕浜肯陆?，TAGs比例隨底物摩爾比的變化趨勢也能夠印證這一推測。

圖5 底物比率(藻油與乙醇摩爾比)對2D-MAG合成率的影響Fig.5 Effect of substrate molar ratio of algal oil to ethanol on 2D-MAG.注：反應條件為溫度35℃，Lipozyme RM IM酶量10%(質量分數(shù))，轉速200 r/min，時間4 h

有證據(jù)表明，在乙醇分解反應中水含量的降低會避免結構脂發(fā)生?；w移[19]。ZHANG等[20]研究表明，與96%的乙醇相比無水乙醇會顯著提高對TAG的酯化程度，且生成2-MAG和FFAs的比例較高，這表明無水乙醇可以避免?；倪w移，有利于2-MAG的催化合成。在催化反應中，Lipozyme RM IM由于乙醇溶劑相對含量的增加，反應產(chǎn)物2D-MAG不但沒有降低，反而有所提高。這一結果也表明Lipozyme RM IM與Novozym 435一樣具有在過量乙醇存在的環(huán)境中保持對結構脂的較高催化能力。本研究推測，當存在有高含量的游離脂肪酸時會產(chǎn)生大量的羧酸基團，此類基團會從脂肪酶表面奪取部分必需水，從而間接提高了醇的相對含量進而提高反應效率[21]。然而，從經(jīng)濟效益等方面考慮，較高的底物比率不僅會增加整個反應的生產(chǎn)成本，而且會為后續(xù)產(chǎn)物純化及副產(chǎn)物分離帶來影響。因此，選擇藻油與乙醇摩爾比為1∶40較為經(jīng)濟環(huán)保。

2.6 反應溫度對單甘脂合成產(chǎn)物的影響

2-MAG的生成是酶催化反應的結果，如果反應過程溫度適中，將有利于脂肪酶發(fā)揮最大活性。一般而言，反應溫度的升高會加快反應速度，縮短反應時間，但過高的溫度則會降低脂肪酶活性和反應物的穩(wěn)定性。由圖6可知，2D-MAG的合成率變化分為2個階段，當反應溫度從30 ℃升高至35 ℃時，DHA-2-MAG合成率由33.5增加至35.8%，當反應體系繼續(xù)由35 ℃升溫至55 ℃后，合成率則出現(xiàn)下降趨勢。這表明35 ℃是Lipozyme RM IM酶催化合成2D-MAG的最適溫度，該溫度下2D-MAG的得率最高。但是，Lipozyme RM IM酶催化溫度范圍較大，2D-MAG合成率的降低并不是完全由于溫度過高而誘發(fā)蛋白質變性導致酶失活引起的。ZHANG等[18]研究顯示，隨著溫度的升高，反應中2-MAG的含量降低而1-MAG的含量有所增加，說明反應溫度升高會導致2-MAG發(fā)生?；w移。對照本實驗中反應物乙酯(EEs)含量來看，當溫度高于35 ℃后，EEs由41.5%升高至49.1%(P<0.05)，說明在此過程中形成的1-MAG發(fā)生了脫酰作用并轉化為EEs。鑒于DHA具有較多的不飽和雙鍵，極易受熱氧化，對2D-MAG的合成需要在相對較低的溫度條件下完成，因此35 ℃是合成2D-MAG較為理想的溫度水平。

圖6 反應溫度對2D-MAG合成的影響Fig.6 Effect of reaction temperature on synthesis of 2D-MAG.

2.7 反應時間對單甘脂合成產(chǎn)物的影響

大多數(shù)酶的最適溫度不是完全固定的，它與作用時間長短有關，當反應時間延長時酶的最適溫度會向反應所需溫度數(shù)值較低的方向移動。由圖7可知，隨著反應的持續(xù)TAG由最高值91.3%逐漸降低至2.5 h后的3.4%(P<0.05)，這表明酶催化反應在0～3 h內反應速率較高。在此期間，2D-MAG和1,2-DAG逐漸升高，其中2D-MAG在第3 h后達到最高值41.2%(P<0.05)，表明TAG醇解反應速度在0～3 h較快，隨著反應的持續(xù)進行2D-MAG含量開始下降，6 h后降至19%(P<0.05)。結構脂酯化反應是一個可逆反應，在反應開始時反應物濃度較高會促使正反應速度加快，2D-MAG合成率大幅度提高。當反應到達一定階段(3 h)后，隨著產(chǎn)物2D-MAG濃度的增加，正反應速度逐漸減小而逆反應速度逐漸增大。與此同時，乙酯(EEs)的含量隨反應時間持續(xù)不斷增加，最終在6 h后達到81.3%。有研究顯示[22]，乙酯的存在會抑制脂酶的活性從而降低水解率。過長的醇解反應時間可能會導致大量的游離脂肪酸生成，甚至sn-2位的?；D移生成1-MAG/1,3-DAG之后，被進一步醇解生成甘油和EEs[18]。綜合反應時間及合成產(chǎn)物積累的因素，反應時間為3 h時酯化反應效率最高。

圖7 反應時間對2D-MAG合成的影響Fig.7 Effect of reaction time on synthesis of 2D-MAG.

2.8 酶添加量對單甘脂合成產(chǎn)物的影響

一般情況下，酶作為合成反應催化劑，與反應速率及產(chǎn)物生成量呈正相關關系。本實驗考察了添加4%～16% Lipozyme RM IM酶對DHA-2-MAG合成率的影響。由圖8可知，當Lipozyme RM IM含量從4%增加至10%后，DHA-2-MAG生成量從22.4%增加至39.1%(P<0.05)，這表明加酶量對酶解效果有顯著的影響，此時酯化反應主要表現(xiàn)為酶控制反應。當加酶量超過10%后，2D-MAG生成量由39.1%逐漸下降至33.5%(P<0.05)，說明酶量的增加并沒有進一步提高產(chǎn)物的生成率，此時表現(xiàn)為底物控制反應。酶量的增加只會加快反應速度，而醇解反應是復雜的可逆反應，酯合成反應加快的同時，油脂副水解反應也相應加速，由于酶隨著催化作用的增強，相互水解作用會逐步減少酶對底物的酶解[21]。此外，同一種脂肪酶在不同的溶劑介質中其位置選擇性和催化活性也有較大差別，這種差別通常與溶劑的性質有關[23]。MUNIO等[7]研究發(fā)現(xiàn)Novozym 435在過量乙醇與無乙醇條件下對TAG的sn-1,3特異性有明顯不同。當反應中有水存在時，水環(huán)境也會限制酶的整體構象移動從而抑制酶的活性[21]。鑒于酶的催化效果及經(jīng)濟成本，添加10%的Lipozyme RM IM更為有效和合理。

圖8 酶添加量對2D-MAG合成的影響Fig.8 Effect of enzyme amount on synthesis of 2D-MAG

2.9 脂肪酶重復利用率評價

酶的重復利用率是評價酶在催化反應中的適用性及功能效價的重要指標。為了評價Lipozyme RM IM脂肪酶在催化合成2D-MAG的效價能力，本研究在完成催化反應后，過濾及回收Lipozyme RM IM脂肪酶并測試重復利用率。圖9可知，酶的回收率隨使用次數(shù)的增加呈總體下降趨勢，回收第10次時，Lipozyme RM IM脂肪酶回收率下降至起始值的35.6%，平均單次酶損耗率大約在3.6%，結果表明在2D-MAG合成過程中，Lipozyme RM IM有效載荷為3%～4%。由于酶在催化反應過程中由于與底物接觸面大小有差異，因此并非全部酶參與了酶反應，尚不清楚酶添加量促進產(chǎn)物合成率與酶損耗率降低之間的內在聯(lián)系。Lipozyme RM IM脂肪酶在重復第5次時，2D-MAG的含量從40.1%降至36.5%，沒有發(fā)生顯著的下降，這表明Lipozyme RM IM脂肪酶具有良好的穩(wěn)定性，但是重復使用第6次后，2D-MAG的含量下降趨勢較前5次明顯(P<0.05)，表明盡管Lipozyme RM IM脂肪酶總體催化較穩(wěn)定，但隨著反復利用次數(shù)的增加，其催化活性在后期有顯著弱化現(xiàn)象。ZHANG等[18]報道了Lipozyme 435在酶促醇解反應中重復利用了7次后仍然能夠發(fā)揮酶的活性。但也有研究發(fā)現(xiàn)Lipozyme TL IM在乙醇介質中進行乙醇分解反應可以得到14.70%的2-MAG，但其TL IM在乙醇介質中催化期間攪拌對酶顆粒結構具有破壞作用，致使脂肪酶無法回收?；诖耍诿复俜磻泄潭ㄖ久笇χ久傅闹貜屠眯Ч蟹e極作用。

圖9 Lipozyme RM IM酶重復利用率Fig.9 Reusability of the Lipozyme RM IM

3 結論

本研究以海藻油為原料分別對2D-MAG的酶法制備方法進行了探索，篩選出了合適的脂肪酶，并考察了脂肪酶種類、海藻油與乙醇的底物摩爾比、反應時間、反應溫度和脂肪酶重復利用次數(shù)對2D-MAG合成產(chǎn)物的影響。結果表明含量為46.37%的DHA和31.5%的C16∶0是藻油主要的脂肪酸成分。藻油是合成n-3長鏈多不飽和脂肪酸結構脂2D-MAG較為理想的原料。與固定化生物催化酶Novozym 435和Lipozyme TL IM相比，Lipozyme RM IM價格更低且催化2D-MAG能力最強。此外，當藻油/乙醇底物摩爾比為1∶40、酶添加量為10%(質量分數(shù))，反應時間為3 h、反應溫度為35℃條件下利用Lipozyme RM IM催化藻油醇解更有利于2D-MAG合成產(chǎn)物的積累。