CRH調(diào)節(jié)妊娠期慢性應激致子代雄性大鼠抑郁

陳 鵬，況 亮，呂逸麗，張 闊，姚余有,2

抑郁癥是一種慢性精神疾病，特點是思維緩慢、反復發(fā)作，嚴重者甚至危及生命。研究[1]發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者海馬、大腦皮層、杏仁核等部位發(fā)生明顯異常。抑郁和焦慮可能與下丘腦分泌過多的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotrophin-releasing hormone，CRH)有關(guān)[2-4]。課題組以往的實驗[5]結(jié)果顯示，妊娠期慢性應激可引發(fā)子代雄鼠抑郁，但目前尚不清楚是否由CRH分泌增多引起。CRH和CRH受體1(CRH receptor 1, CRHR1)廣泛分布于全腦，參與并影響海馬、大腦皮層、杏仁核等部位眾多生理功能[6-7]。因此，現(xiàn)使用慢性不可預測的輕度應激(chronic unpredictable mild stress, CUMS)方式作用于妊娠期大鼠，通過向其子代雄鼠側(cè)腦室微量注射CRHR1拮抗劑(NBI30775)，觀察子代雄鼠行為學和組織病理學改變，并利用體外培養(yǎng)實驗來研究子代雄鼠抑郁的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器CRHR1拮抗劑NBI30775(英國Tocris Bioscience公司)；anti-mTOR、anti-p-mTOR(Ser2448)(美國Cell Signaling Technology公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA)(上海江萊生物有限公司)；MEM(美國Hyclone公司)；馬血清(美國Gibico公司)；插入式微孔濾膜(美國Millipore公司)；強迫游泳實驗分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)；大鼠腦立體定位儀、微量注射器和微量給藥套管(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；Western blot 相關(guān)儀器(北京六一廠)；ELX全自動酶標儀(美國BD公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)。

1.2 動物與分組8周齡SPF級Sprague Dawley大鼠，雌鼠30只，雄鼠15只，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)方法：室溫(24±1) ℃，相對濕度50%，正常提供食物和水，飼養(yǎng)7 d以適應周圍環(huán)境。7 d后，按照雌雄比例2 ∶ 1在20 ∶ 00點合籠，次日早上07 ∶ 00點查陰。標記、稱重查到陰栓的母鼠，單籠飼養(yǎng)并記錄為受孕第1天。為研究不同妊娠期應激時間對子代大鼠行為學的影響，將妊娠期母鼠分為妊娠期正常對照組(CON組)、妊娠中期(7～14 d)處理組(MIDDLE組)、妊娠晚期(15～21 d)處理組(LATE組)和妊娠中晚期(7～21 d)處理組(MID-LATE組)。隨機取出同一組孕鼠孕育的子代雄鼠，于出生后30 d做行為學實驗，選取最強致子代抑郁的應激方式。在上述基礎(chǔ)上重新應激孕鼠(應激時間為7～21 d)。待子鼠出生后，按妊娠期應激與不應激將子代雄鼠分成以下4組：妊娠期正常對照+子代對照組(CON組)、妊娠期正常對照+子代側(cè)腦室注射 CRHR1 拮抗劑組(CON+ANT組)、妊娠期慢性應激+子代側(cè)腦室注射 CRHR1拮抗劑組(CUMS+ANT組)、妊娠期慢性應激+子代對照組(CUMS組)。

1.3 慢性應激方法慢性應激組：正常喂養(yǎng)1周后，受孕第8天起開始慢性不可預知性輕度刺激：夾尾巴(離尾尖5 cm處，5 min)、禁水(24 h)、冰水游泳(水溫4 ℃，15 min)、改變居住環(huán)境(讓鼠在潮濕的墊料上生活24 h)、晝夜顛倒、禁食(24 h)、搖床振蕩等，每天隨機施加1種刺激方式(禁水、禁食除外)，直到大鼠分娩。

1.4 給藥方式產(chǎn)后10 d，用4%的水合氯醛腹腔注射麻醉子鼠，并利用腦立體定位儀定位側(cè)腦室(以前囟為原點，AP-0.7 mm、L2.0 mm、V3.3 mm)，將不銹鋼導管插入側(cè)腦室，用牙托粉和牙托水將其固定。手術(shù)后皮下注射抗生素(0.1×104U/只，每天1次)，持續(xù)注射3 d防止子鼠感染。NBI30775給藥劑量為2.5 mg/(kg·d)，給藥周期為10～30 d。

1.5 抑郁模型大鼠行為學評價

1.5.1強迫游泳實驗(forced swimming test，F(xiàn)ST) 試驗第1天進行預實驗，將大鼠置于直徑20 cm玻璃桶中游泳15 min[水深30 cm，水溫(24±1) ℃]。第2天，將大鼠置于桶中游泳6 min，拍攝大鼠在桶中的運動情況，統(tǒng)計后4 min不動時間總和。

1.5.2糖水偏好實驗(sucrose preference test，SPT) 試驗第1天進行預實驗，在每個籠子兩側(cè)放2瓶1%蔗糖水(50 ml的透明玻璃瓶)。第2天禁食禁水。第3天，每個籠子一側(cè)放1瓶1%蔗糖水，另外一側(cè)放1瓶純凈水。稱重并記錄1%蔗糖水和純凈水消耗量。實驗結(jié)束后，分析得到得數(shù)據(jù)并且計算糖水偏好值 =(糖水前后重量差值/總液體前后重量差值)×100%。

1.6HE染色觀察海馬形態(tài)學改變行為學實驗全部結(jié)束后，取出全腦，4%多聚甲醛固定腦組織。24 h后進行脫水、包埋，做冠狀切片，染色。在顯微鏡(200倍)下拍攝海馬 CA3 區(qū)神經(jīng)細胞，保存圖片。用 Image-Pro Plus軟件的計數(shù)功能標記出神經(jīng)元的數(shù)目并求出平均值。

1.7 ELISA法檢測海馬組織中CRH含量實驗時稱取一定量的海馬組織，按照酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA)使用書的說明進行操作，測定海馬組織CRH的含量，海馬組織CRH的濃度單位用CRH/總蛋白(pg/mg)表示。

1.8 Western blot法檢測海馬組織哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)和p-mTOR(Ser2448)蛋白含量稱量40 mg的海馬組織，加入 PBS輕搖洗滌，勻漿，4 ℃離心后分離上清液，重復1次。灌制8%的膠,電泳(60 V/90 min,120 V/180 min),轉(zhuǎn)膜(250 mA/250 min)，純水洗膜3次后封閉1.5 h，孵育一抗(4 ℃過夜)。TBST洗膜4次后孵育二抗。加適量顯色液顯影并拍照，保存照片分析結(jié)果?？贵w濃度β-actin鼠抗(1 ∶ 2 000)、mTOR兔抗(1 ∶ 2 000)、p-mTOR兔抗(1 ∶ 2 000)、二抗羊抗兔(1 ∶ 5 000)。

1.9 Western blot法檢測體外培養(yǎng)海馬腦片中mTOR蛋白含量取10 d的SD大鼠大腦，制作冠狀切片(180 μm)，切下的腦片置于4 ℃的HBSS中，最后將切片放置在裝有培養(yǎng)基的Millicell-CM微孔膜上。培養(yǎng)基組成成分為50% MEM、25%馬血清、24% HBSS溶液、1%的100 UL/ml青鏈霉素雙抗、6.5 mg/ml葡萄糖，pH 7.25。放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h內(nèi)換液，隨后1周內(nèi)每隔1 d更換1次培養(yǎng)基，以提供海馬腦片充足的營養(yǎng)和適宜的生長環(huán)境。1周以后，將實驗分為1.0×10-6mol/L CRH+0.1×10-6mol/L CRHR1 拮抗劑組(Low組)、1.0×10-6mol/L CRH+1.0×10-6mol/L CRHR1拮抗劑組(Middle組)、1.0×10-6mol/L CRH+10×10-6mol/L CRHR1拮抗劑組(High組)、1.0×10-6mol/L CRH+溶劑對照組(CRH組)和正常對照組(Control 組)。其中CRHR1拮抗劑終濃度設(shè)定為(0.1～10)×10-6mol/L，CRH濃度為1.0×10-6mol/L。

1.10 統(tǒng)計學處理SPSS 23.0統(tǒng)計軟件分析實驗所得數(shù)據(jù)，用單因素方差分析(ANOVA)比較多組間均數(shù)差異，用最小顯著差異法(least significant difference，LSD)作兩兩比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 妊娠期不同應激階段對子代雄鼠的影響如表1所示，與CON組相比，MIDDLE、LATE和MID-LATE組的大鼠糖水偏好率均下降(P<0.05)，強迫游泳不動時間均增長(P<0.05)；與MIDDLE組和LATE組相比，MID-LATE組大鼠強迫游泳不動時間更長(P<0.05)，糖水偏好率下降(P<0.05)。

表1 各組子代大鼠行為學實驗結(jié)果

與CON組比較：*P<0.05；與MIDDLE組、LATE組比較：#P<0.05

2.2 CRHR1拮抗劑對子代雄鼠行為學影響如表2所示，與CON組相比，CUMS組大鼠糖水偏好率下降(P<0.05)，強迫游泳不動時間增長(P<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+ANT組大鼠糖水偏好率上升(P<0.05),強迫游泳不動時間減少(P<0.05)；與CON組相比，CON+ANT組大鼠糖水偏好率和強迫游泳不動時間無明顯變化。

表2 各組子代大鼠行為學實驗結(jié)果

與CON組比較：*P<0.05；與CUMS組比較：#P<0.05

2.3 CRHR1拮抗劑對子代雄鼠海馬病理學影響HE染色結(jié)果顯示，CON組與CON+ANT組海馬CA3區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)量較多，細胞排列緊密，核仁界限清晰、明顯。CUMS組海馬CA3區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)量較少，細胞排列疏松，發(fā)生核固縮的細胞較多。用Image-Pro Plus分析軟件的計數(shù)功能標記海馬CA3區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)量，分析結(jié)果顯示，與CON組(121.01±9.64)相比，CUMS組(83.00±5.24)神經(jīng)元總數(shù)減少(P<0.05)；與CUMS組(83.00±5.24)相比，CUMS+ANT組(101.25±5.91)神經(jīng)元總數(shù)增加(P<0.05)；而CON組與CON+ANT組(125.67±7.51)相比神經(jīng)元總數(shù)無明顯區(qū)別。見圖1。

圖1 各組子代雄鼠海馬CA3區(qū)HE染色圖 ×200

A:CON組；B:CON+ANT組；C:CUMS組；D:CUMS+ANT組

2.4 CRHR1拮抗劑對子代雄鼠海馬組織中CRH水平影響ELISA檢測結(jié)果顯示，與CON組大鼠相比，CUMS組大鼠海馬組織中CRH水平升高(P<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+ANT組大鼠海馬組織中CRH水平降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組子代大鼠海馬組織CRH水平影響(n=3)

與CON組比較：*P<0.05；與CUMS組比較：#P<0.05

2.5 CRHR1拮抗劑對子代海馬mTOR、p-mTOR蛋白表達影響采用Western blot法檢測mTOR和p-mTOR蛋白水平。圖3顯示，與CON組相比，CUMS組大鼠海馬組織中mTOR表達量下降(P<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+ANT組大鼠海馬組織中mTOR表達量上升。圖4顯示，與CON組相比，CUMS組大鼠海馬組織中p-mTOR水平下降(P<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+ANT組大鼠海馬組織中p-mTOR表達量上升。CON組和CON+ANT組大鼠海馬組織中mTOR和p-mTOR表達量均無統(tǒng)計學差異。

2.6 CRHR1拮抗劑對體外培養(yǎng)海馬腦片中mTOR蛋白水平影響采用Western blot法檢測體外培養(yǎng)的海馬腦片mTOR蛋白水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，CRH組大鼠海馬腦片mTOR表達量下降(P<0.05)；與CRH組相比，低、中和高劑量CRHR1拮抗劑組大鼠海馬腦片mTOR表達量增加(P<0.05)；但低、中和高劑量CRHR1拮抗劑組與對照組相比，大鼠海馬腦片mTOR表達量差異無統(tǒng)計學意義，且低、中和高劑量CRHR1拮抗劑組3組之間組內(nèi)比較大鼠海馬腦片mTOR表達量差異無統(tǒng)計學意義。見圖5。

圖3 CRHR1拮抗劑對海馬組織中mTOR蛋白表達的影響(n=3)

與CON組比較：*P<0.05；與CUMS組比較：#P<0.05

圖4 CRHR1拮抗劑對海馬組織中p-mTOR蛋白表達的影響(n=3)

與CON組比較：*P<0.05；與CUMS組比較：#P<0.05

3 討論

不同妊娠時期應激會對子代雄鼠的行為產(chǎn)生不同的影響。本實驗結(jié)果顯示， 與CON組相比，MID-DLE、LATE和MID-LATE組的大鼠糖水偏好率下降、強迫游泳不動時間增長，且MID-LATE組比MIDDLE和LATE組強迫游泳不動時間更長，糖水偏好率提高，提示MID-LATE妊娠期應激組子代雄性大鼠抑郁程度最嚴重。

圖5 CRHR1拮抗劑對體外培養(yǎng)海馬腦片中mTOR蛋白表達的影響(n=3)

1：低劑量CRHR1拮抗劑組；2：中劑量CRHR1拮抗劑組；3：高劑量CRHR1拮抗劑組；4：CRH組；5：對照組；與CRH組比較：*P<0.05

CRH和CRHR1在全腦分布廣泛，故本實驗通過向妊娠期慢性應激子鼠側(cè)腦室微量注射CRHR1拮抗劑，并結(jié)合體外培養(yǎng)海馬腦片更有利于探討妊娠期慢性應激誘導子代雄性大鼠抑郁的機制。實驗結(jié)果顯示，與CON組相比，CUMS組大鼠糖水偏好率下降，強迫游泳不動時間增長，說明妊娠期慢性應激致子代出現(xiàn)抑郁樣癥狀。與CUMS組相比，CUMS+ANT組大鼠糖水偏好率上升，強迫游泳不動時間減少，提示CRH參與了妊娠期慢性應激致子代抑郁。HE染色和海馬組織CRH濃度檢測結(jié)果顯示，與CON相比，CUMS組的子代雄鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)細胞損傷，海馬組織CRH濃度升高，而加入CRHR1拮抗劑后，CUMS+ANT組子代雄鼠海馬病理損傷改善，提示妊娠期慢性應激通過提高子代海馬組織中CRH水平，導致海馬CA3區(qū)損傷，從而引起抑郁樣癥狀。本研究結(jié)果還顯示，CRHR1拮抗劑可下調(diào)CUMS引起的升高的CRH，其機制不詳，還有待于進一步研究。

mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯、細胞增殖與死亡等生理過程[8]。研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，激活mTOR通路，可通過上調(diào)多種相關(guān)蛋白的磷酸化水平，提高神經(jīng)元的可塑性，產(chǎn)生抗抑郁效果。本研究結(jié)果顯示，CUMS組大鼠海馬組織中mTOR和p-mTOR蛋白的表達低于CON組，但側(cè)腦室注射CRHR1拮抗劑后mTOR和p-mTOR蛋白表達升高，提示CRHR1拮抗劑可上調(diào)妊娠期慢性應激導致的子鼠mTOR和p-mTOR的蛋白水平的降低。此外體外培養(yǎng)海馬腦片結(jié)果顯示，CRH、低、中和高劑量CRHR1拮抗劑組大鼠海馬腦片mTOR蛋白表達量增加，且中劑量組的mTOR蛋白表達水平接近正常水平，進一步說明CRHR1拮抗劑可以上調(diào)mTOR蛋白表達水平，提示妊娠期慢性應激通過下調(diào)子鼠海馬mTOR蛋白水平致海馬神經(jīng)細胞損傷，最終引起抑郁。遺憾的是，本課題組尚未掌握體外觀察海馬腦片病理形態(tài)的技術(shù)，無法在觀察mTOR蛋白的同時觀察海馬腦片的病理改變。此外本研究也未能成功檢查海馬神經(jīng)元凋亡狀況，也是本文不足之處。

綜上所述，妊娠期慢性應激可導致子代出現(xiàn)抑郁樣行為，其作用機制可能是妊娠期慢性應激誘導子代海馬組織CRH水平升高，通過抑制mTOR通路的激活，導致海馬CA3區(qū)神經(jīng)細胞損傷，進而使子代抑郁。