不同品種芹菜葉中精油的提取及其功效測定

張玲希，酈 帥，董熒熒，何 霞，卓如雄，宣貴達(dá)

浙江大學(xué)城市學(xué)院，杭州 310015

芹菜(Apium graveolens L.)屬于傘形科植物，常見的芹菜品種有旱芹、水芹。芹菜具有特殊的辛香氣味，特別是芹菜葉。植物精油也稱揮發(fā)油，具有特殊氣味，被廣泛用于化妝品、香水等工業(yè)中［1］。部分植物精油具有較強(qiáng)的抗菌作用以及抗氧化作用［2-6］。而目前對于植物精油的研究也多在于對其抗菌、抗氧化方面的研究。

現(xiàn)今對芹菜葉的研究多在于對芹菜葉水溶性物質(zhì)的研究［7-9］，有極少學(xué)者對于芹菜葉揮發(fā)性物質(zhì)的成分分析進(jìn)行了探究［10］，芹菜葉作為一種生活廢棄料，天然無害且成本低廉，故具有一定的經(jīng)濟(jì)價值。本研究優(yōu)化了芹菜葉精油的提取工藝、測定了其抗菌作用、抗氧化作用。研究了常見的廢棄芹菜葉的藥理作用，為更好地利用芹菜葉提供了理論基礎(chǔ)，又因其成本低廉，故具有有較好的商業(yè)前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芹菜購于杭州，經(jīng)浙江大學(xué)城市學(xué)院植物學(xué)專家李林林鑒定屬旱芹的鐵桿芹菜及細(xì)桿芹菜。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)購于杭州天和微生物試劑有限公司。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L，細(xì)菌用):牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g(僅枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基)，NaCl 5 g，瓊脂20 g，pH:7.0～7.2

無水乙醇和石油醚均為分析純試劑。DPPH(日本東京化工業(yè)株式會社)，二丁基羥基甲苯(BHT)(廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心)，抗壞血酸(廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心)。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋HVE-50(HILAYAMA)，生化培養(yǎng)箱SPX-250B-Z 型(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9240A(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，可見分光光度計22PC(上海棱光技術(shù)有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000(上海亞榮生化儀器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 芹菜葉精油的提取及工藝優(yōu)化

取芹菜葉部分，洗凈后自然風(fēng)干48 h 后放入恒溫鼓風(fēng)干燥箱中在25 ℃條件下烘干24 h，剪碎后稱重裝保鮮袋中密封備用。根據(jù)正交試驗法［11］以料液比、浸泡時間、蒸餾時間為3 個因素，每個因素設(shè)3 個水平進(jìn)行實驗確定芹菜葉精油提取的最佳條件。具體因素水平如表1 所示。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.2 MIC 值的測定［12］

MIC 為最小抑菌濃度，即指在體外培養(yǎng)細(xì)菌18～24 h 后能抑制培養(yǎng)基內(nèi)可見菌生長的最低藥物濃度。

芹菜葉精油MIC 值的測定采用平板法。將芹菜葉精油用低熔點的石油醚將稀釋為系列濃度，加入培養(yǎng)基中后混合均勻，將0.1 mL 的菌懸液均勻地涂布于凝固的培養(yǎng)基表面，各實驗菌株在相應(yīng)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，每個濃度重復(fù)試驗三次。

1.3.3 抑菌圈的測定［13］

抑菌圈直徑的測定采用瓊脂擴(kuò)散法。將0.1 mL 的菌懸液均勻地涂布于凝固的培養(yǎng)基表面，蓋好平皿，室溫干燥5 min，將已滅菌的濾紙片(直徑6.0 mm)每片滴加濃度不同的芹菜葉精油(100、200、300 mg/mL)20 μL，自然晾干后用無菌鑷子取樣片輕輕貼放于平板表面，每個平板貼3 片試驗樣片，3片石油醚作對照片。各實驗菌株在相應(yīng)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，測量抑菌直徑，實驗重復(fù)三次。

1.3.4 清除DPPH·能力的測定

將芹菜葉精油用無水乙醇配制成一系列濃度，取0.1 mL 樣品加入3.9 mL DPPH 乙醇溶液(25 mg/L)，混合放置于室溫條件下避光30 min 后，在517 nm 處測定吸光度。

計算公式為:抑制率(%)=［1-(Ai-Aj)/Ac］×100

式中，Ai 為0.1 mL 樣品與3.9 mL DPPH 液的吸光度;Aj 為0.1 mL 無水乙醇與3.9 mL DPPH 液的吸光度;Ac 為0.1 mL 樣品與3.9 mL 無水乙醇的吸光度。

以上實驗用二丁基羥基甲苯(BHT)作陽性對照，重復(fù)兩次，實驗數(shù)據(jù)作統(tǒng)計分析。

1.3.5 還原鐵離子能力的測定［14］

將樣品用無水乙醇配制稱一系列的濃度，取2.5 mL 不同濃度的樣品溶液，加入2.5 mL 的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH=6.6)及2.5 mL 1%的K3Fe(CN)6溶液，于50 ℃水浴反應(yīng)20 min 后急速冷卻，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，取反應(yīng)液5 mL，加入5 mL 的H2O 和0.1% FeCl3溶液1 mL，混合均勻，10 min 后于700 nm 處測定其吸光光度值，以水為空白。以上實驗用抗壞血酸作陽性對照，重復(fù)兩次，實驗數(shù)據(jù)作統(tǒng)計分析。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

本文中的實驗數(shù)據(jù)分析均使用SPSS 19.0 中文版軟件作統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交實驗結(jié)果及方差分析

在實驗中得出鐵桿芹菜與細(xì)桿芹菜的精油提取率分別約為1.27%、1.23%。其兩種芹菜葉的精油提取率值相近。

表2 不同實驗條件下芹菜葉精油的提取率Table 2 The extraction yields of A.graveolens L.leaves essential oil under different experimental conditions

表3 正交試驗的方差分析Table 3 Analysis of variance for the orthogonal experiment

由表2 可知，3 個因素對芹菜葉精油提取率的影響程度從大到小依次為:蒸餾時間＞料液比＞浸泡時間。進(jìn)一步對實驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，由表3可知，這3 個因素的各水平之間差異并不顯著。因此，芹菜葉精油的最佳提取條件為:A2B1C3，即料液比1∶8 g/mL，浸泡時間0.5 h，蒸餾時間3 h。

在此最佳工藝條件下進(jìn)行驗證實驗，芹菜葉精油的得率為1.20%以上。

2.2 芹菜葉精油的MIC 值［12］

MIC 值是評價防腐劑抗菌能力的指標(biāo)，防腐劑的MIC 值越大，其抗菌能力就越強(qiáng)。

表4 不同品種芹菜葉精油的MIC 值(V/V)Table 4 MICs of different varieties of A.graveolens L.leaves essential oil

由表4 均可知，兩個品種的芹菜葉精油對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌能力更強(qiáng)，即對于革蘭氏陽性菌的抑菌能力更強(qiáng)。而鐵桿芹菜的芹菜葉精油對于枯草芽孢桿菌的抗菌活性大于細(xì)桿芹菜，細(xì)桿芹菜對于金黃色葡萄球菌的抗菌活性大于鐵桿芹菜，但總體來說相差不大。

2.3 芹菜葉精油的抑菌圈直徑［13］

測定抑菌圈直徑亦能評價防腐劑的抗菌能力，抗菌直徑越大即抗菌活性越大。

表5 不同品種芹菜葉精油抑菌圈直徑(mm)Table 5 Inhibition zone diameter of different varieties of A.graveolens L.leaves essential oil

由表5 可知，芹菜葉精油對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌能力更強(qiáng)，即對于革蘭氏陽性菌的抑菌能力更強(qiáng)。同樣能證明上述結(jié)論。

2.4 芹菜葉精油清除自由基能力測定

DPPH·是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若提取物能將其清除，則提示提取物具有降低羥自由基、烷自由基或氧化自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用。

由表6 可知，兩個品種芹菜葉精油的清除自由基能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于同等濃度的BHT 試劑清除自由基的能力。細(xì)桿芹菜葉精油的抗氧化性明顯優(yōu)于鐵桿芹菜葉精油的抗氧化性。

2.5 還原鐵離子能力測定［14］

還原能力的測定，可檢驗化合物是否為良好的電子供應(yīng)者，它所提供的電子可以使Fe3+還原為Fe2+，使體系溶液顏色改變，從而影響溶液吸光度值的改變，即可反映出體系中氧化和還原狀態(tài)的改變。吸光度越大，表示樣品的抗氧化性越強(qiáng)，反之越弱。

表6 各樣品自由基清除率Table 6 Free radical scavenging rate of samples

表7 不同品種芹菜葉精油還原鐵離子能力(吸光度A)測定Table 7 Fe2+ reducing capacity of different varieties of A.graveolens L.leaves essential oil

表8 抗壞血酸還原鐵離子能力測定Table 8 Fe2+ reducing capacity of Vc

芹菜葉精油和抗壞血酸溶液還原Fe3+能力如表7、表8 所示，其還原鐵離子能力隨濃度的增加而增加，而芹菜葉精油的還原能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于抗壞血酸。但也可看出，細(xì)桿芹菜葉精油的抗氧化性明顯優(yōu)于鐵桿芹菜葉精油的抗氧化性。

3 結(jié)論

芹菜葉精油的最佳提取條件為:料液比1∶8，浸泡時間0.5 h，蒸餾時間3 h。兩個品種的芹菜葉精油提取率相近。兩個品種的芹菜葉精油抗菌效果有些許差異，但均對于革蘭氏陽性菌的抗菌效果明顯。兩個品種的芹菜葉精油的抗氧化效果相近且都不明顯。但細(xì)桿芹菜葉精油的抗氧化效果明顯優(yōu)于鐵桿芹菜的抗氧化效果。

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