超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定不同石斛中8種農(nóng)藥殘留量△

肖蘇萍，鐘榮榮，高慧，周朗，王繼永，李春，劉慧峰

1.中國中藥有限公司，北京 100195；2.島津企業(yè)管理(中國)有限公司 北京分公司，北京 100020； 3.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004；4.中國中醫(yī)科學院 中藥研究所，北京 100700； 5.再鼎醫(yī)藥(蘇州)有限公司，江蘇 蘇州 215123

石斛屬隸屬于蘭科蘭亞科樹蘭族石斛亞族，約1000種，是蘭科比較大的屬之一，我國有74種和2變種[1]。石斛始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為九大仙草之首，具有益胃生津、滋陰清熱功效?！吨腥A人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)中石斛品種收載有金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛的栽培品及其同屬植物近似種的新鮮或干燥莖[2]。鐵皮石斛單獨收載為干燥莖的2個品規(guī)：鐵皮楓斗(耳環(huán)石斛)和鐵皮石斛[2]?；羯绞蛔u為石斛中的極品，因資源分布范圍狹窄，野生資源非常瀕危。目前，國內(nèi)大多石斛都來自于栽培品種，因其特殊的栽培環(huán)境要求，在種植過程中經(jīng)常發(fā)生病蟲害，尤其在夏秋季病蟲害繁殖較快，很容易發(fā)生各種病菌，為了石斛植株免遭其害，種植戶極易施打農(nóng)藥保護石斛，這對提高石斛產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益起著很重要作用。但農(nóng)藥施用到農(nóng)作物上之后，絕大部分因多種原因而轉化，同時農(nóng)作物內(nèi)往往會有少量的殘留，長時間攝食殘留農(nóng)藥將會影響人體的健康[3]。作為即將成為藥食兩用的常用保健原料，對其農(nóng)藥殘留的安全控制則顯得極為重要。

近年來，霍山石斛多糖藥理活性及系統(tǒng)發(fā)育研究較多，種質(zhì)鑒定及質(zhì)量標準和安全控制研究較少，筆者目前只檢索到1篇有關霍山石斛農(nóng)藥殘留的文獻報道[4]。鐵皮石斛農(nóng)藥殘留研究大多采用氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用、氣相色譜法對其農(nóng)藥殘留進行研究評價。農(nóng)藥殘留分析中樣品前處理是整個農(nóng)藥殘留分析關鍵步驟，選擇性能較好、分離效果好、靈敏度高的儀器檢測也尤為重要。本研究在比較了不同前處理方法的基礎上，篩選出一種簡易快捷的樣品前處理方法，采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜對不同石斛中的常見8種農(nóng)藥殘留進行快速檢測，此方法操作簡單，經(jīng)濟省時，并可獲得較高的回收率，可用于不同石斛樣品農(nóng)藥殘留安全檢測與質(zhì)量控制。

1 材料

1.1 儀器

LC-30A超高效液相色譜儀和 LC-MS/MS-8045三重四極桿質(zhì)譜儀(日本島津公司)，XS205DU 型電子天平(美國METTLER-TOLEDO公司)，XB620M型電子天平(瑞士Precisa公司)，REFERENCE型實驗室超純水機(默克密理博公司)，SC-3612型低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)，Voterx-5型渦旋混合儀(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)，Eppendorf 移液器[艾本德(上海)國際貿(mào)易有限公司]。

1.2 試劑

多菌靈(上海源葉生物科技有限公司，批號：KJ0719YC13，純度：HPLC≥98%)，吡蟲啉(上海源葉生物科技有限公司，批號：L11M6H1，純度：HPLC≥98%)，甲霜靈(上海源葉生物科技有限公司，批號：G791644，純度：98.4%)，腈菌唑(上海源葉生物科技有限公司，批號：B17J10D80150，純度：99%)，丙環(huán)唑(上海源葉生物科技有限公司，批號：N11J10Y79699，純度：GC≥98%)，戊唑醇(上海源葉生物科技有限公司，批號：S13J7N8896，純度：HPLC≥98%)，三唑酮(上海源葉生物科技有限公司，批號：G129954，純度：98.7%)，毒死蜱(上海源葉生物科技有限公司，批號：G130559，純度：99.8%)，乙腈為色譜純(賽默飛世爾科技有限公司)，甲醇為色譜純(賽默飛世爾科技有限公司)，甲酸為HPLC級(迪馬公司)，乙酸銨、無水硫酸鎂、氯化鈉為分析純(北京化工試劑廠)，水為超純水。

1.3 樣品

課題組收集了覆蓋全國7個不同省份產(chǎn)地的22批鐵皮石斛樣品，霍山產(chǎn)的不同生長年限的霍山石斛12批，銅皮石斛3批，霍山產(chǎn)的霍山石斛葉和花各1批。樣品由中國中藥有限公司王繼永研究員和中國中藥霍山石斛科技有限公司副總經(jīng)理孫大學鑒定確認品種，樣品信息見表 1。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 混合對照品儲備液的制備

分別精密稱取多菌靈、吡蟲啉、甲霜靈、腈菌唑、丙環(huán)唑、戊唑醇、三唑酮、毒死蜱各約12 mg，分別置不同50 mL容量瓶中，各加甲醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻后即得各農(nóng)藥的240 mg·L-1的對照品儲備液，置-20 ℃冰箱中保存，備用。

精密量取上述各對照品儲備液溶液各5 mL置同一50 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，搖勻后得24 mg·L-1作為混合對照品儲備液，置-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 樣品前處理

取石斛樣品粉末 1 g，精密稱定，置50 mL具塞離心管中，加水1 mL、0.1%甲酸乙腈6 mL，振搖5 min后，加入 0.8 g無水硫酸鎂，1 g氯化鈉，再次渦旋 5 min，靜置片刻，以 5000 r·min-1(離心半徑為12.96 cm)離心10 min，取離心后上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 基質(zhì)混合對照品溶液的制備

取1批不含農(nóng)藥的石斛，按2.2項下處理，加入上述系列混合對照品溶液適量，搖勻，即得。

2.4 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18(100 mm×2.1 mm，2 μm)；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL；流動相A相為水(含0.1%甲酸和10 mmol·L-1乙酸銨)，流動相B相為甲醇，梯度洗脫(0～1.0 min，70%A；1.0～5.0 min，70%～5%A；5.0～7.0 min，5%A；7.0～7.1 min，5%～70%A；7.1～9.0 min，70%A)；流速：0.4 mL·min-1。

2.5 質(zhì)譜條件

ESI源；接口電壓4000 V；正離子和負離子掃描方式同時掃描；掃描模式：多反應監(jiān)測(MRM)；霧化氣：氮氣3.0 L·min-1；干燥氣：氮氣 10 L·min-1；加熱氣：空氣 10 L·min-1；碰撞氣：氬氣，壓力2.3×105Pa；脫溶劑管溫度：200 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；接口溫度：300 ℃；駐留時間：15 ms；延遲時間：1 ms。

將各農(nóng)藥分別配制成100 μg·L-1的對照品溶液，進行一級質(zhì)譜分析，得到每種農(nóng)藥的分子離子峰，利用儀器自動優(yōu)化功能，篩選二級碎片離子信息，獲得碎片離子及質(zhì)譜參數(shù)和碰撞能量(CE)，8種農(nóng)藥響應強度最佳時的質(zhì)譜條件見表2?；旌蠈φ掌返目傠x子流圖見圖1。

表2 農(nóng)藥品種及MRM參數(shù)

注：產(chǎn)物離子1為定量離子。

注：1.吡蟲啉；2.甲霜靈；3.腈菌唑；4.三唑酮；5.戊唑醇；6.丙環(huán)唑；7.毒死蜱；8.三唑酮。圖1 8種農(nóng)藥對照品離子流圖

2.6 方法學驗證

2.6.1線性關系考察、檢出限及定量限 用鐵皮石斛空白基質(zhì)將8種農(nóng)藥以混合對照品儲備液配制成質(zhì)量濃度分別為1、5、10、20、50、100、200 μg·L-1的系列混合標準溶液。將各溶液注入超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀內(nèi)，按1.4、1.5項下進行測定，以各色譜峰峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標進行線性回歸分析。以3倍信噪比作為檢出限，10 倍信噪比作為定量限。實驗結果表明，各種農(nóng)藥對照品在1～200 μg·L-1線性關系良好，結果見表3。

2.6.2精密度試驗 使用10 μg·L-1基質(zhì)混合對照品溶液按照2.4和2.5項下方法，連續(xù)進樣6次，8種農(nóng)藥的RSD分別為吡蟲啉2.77%，多菌靈2.16%，甲霜靈4.48%，腈菌唑3.02%，戊唑醇3.17%，三唑酮1.03%，丙環(huán)唑4.55%，毒死蜱3.76%。RSD均在5%以內(nèi)，說明精密度良好。

2.6.3重復性試驗 取含有8種農(nóng)藥的鐵皮石斛樣品，按2.2項下制備6份樣品并測定，計算RSD，8種農(nóng)藥的重復性試驗RSD分別為吡蟲啉1.86%，多菌靈4.70%，甲霜靈4.34%，腈菌唑2.96%，戊唑醇2.55%，三唑酮3.74%，丙環(huán)唑4.62%，毒死蜱2.59%。RSD都在5%以內(nèi)，說明重復性良好。

2.6.4回收率試驗 對石斛樣品的8種農(nóng)藥進行10、20、50 μg·L-13個濃度水平下的加標回收率試驗(n=3)。8種農(nóng)藥回收率和相對標準偏差結果見表3，回收率為97.3%～111.6%，RSD為4.22%～8.44%，符合回收率為70%～120%，RSD≤20%的農(nóng)藥殘留分析質(zhì)量控制要求。

表3 8種農(nóng)藥線性回歸方程、檢出限、定量限和回收率(n=9)

2.7 樣品測定與分析

按樣品前處理方法對表1的樣品進行處理后上機，結果見表4、圖2。目前，《中國藥典》未對石斛的農(nóng)藥殘留進行限量要求，本研究以《中國藥典》石斛和鐵皮石斛項下規(guī)定的12 g為石斛每日人均可服用的最大劑量，按60 kg計人體體質(zhì)量，參考GB 2763—2016食品中農(nóng)藥最大殘留限量規(guī)定的8種農(nóng)藥每日允許攝入量，按照《中國藥典》中藥有害 留物限量制定指導原則規(guī)定計算農(nóng)藥殘留量最大限量理論值，得出8種農(nóng)藥的殘留量最大限量理論值分別為吡蟲啉3 mg·kg-1、多菌靈1.5 mg·kg-1、甲霜靈4 mg·kg-1、腈菌唑1.5 mg·kg-1、戊唑醇1.5 mg·kg-1、三唑酮1.5 mg·kg-1、丙環(huán)唑3.5 mg·kg-1、毒死蜱0.5 mg·kg-1。

表4 39批樣品測定結果 mg·kg-1

注：*表示農(nóng)藥超出限量標準;—表示未檢出。

圖2 樣品色譜圖

由表4可知，這8種農(nóng)藥中，39批不同石斛中有2批石斛的多菌靈和戊唑醇超出了石斛的農(nóng)藥最大限量理論值，8種農(nóng)藥檢出率為25.6%～46.2%，說明石斛總體農(nóng)藥殘留安全控制相對較好，但還需加強各農(nóng)藥的使用。

3 討論

3.1 石斛農(nóng)藥品種的選擇

本課題組查閱了維普、萬方和中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫資料，發(fā)現(xiàn)目前總共有22 篇專題報道石斛中農(nóng)藥殘留檢測方法的文獻，其中報道石斛農(nóng)藥殘留檢出的有多菌靈、甲基硫菌靈、吡蟲啉、甲霜靈、腈菌唑、丙環(huán)唑、戊唑醇、三唑酮、毒死蜱、殺螟硫磷、七氯、三氯殺螨醇、o，p′-DDT、百菌清、五氯硝基苯、腐霉利、氯氰菊酯、苯醚甲環(huán)唑[5-9]。本研究在總結現(xiàn)有文獻報道基礎上，選擇石斛中農(nóng)藥殘留檢出率較高的甲霜靈、多菌靈、戊唑醇、三唑酮、腈菌唑、吡蟲啉、丙環(huán)唑、毒死蜱和甲基硫菌靈9種農(nóng)藥建立操作簡單、快速的一測多評方法。但采用本方法對甲基硫菌靈檢測時的回收率僅有19.6%，不適合甲基硫菌靈檢測;《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763—2016)也規(guī)定甲基硫菌靈殘留物為甲基硫菌靈和多菌靈之和以多菌靈表示，可能與甲基硫菌靈的轉化有關。因此，本方法僅對以上8種石斛中常見的農(nóng)藥殘留進行檢測。

3.2 樣品前處理方法的對比分析

分別選擇了不同QuEChERS凈化管和不用凈化管進行鹽析后凈化比較分析，發(fā)現(xiàn)不同凈化管內(nèi)含物和不用凈化管的加樣回收率差異較大。采用QuEChERS凈化管和不用凈化管進行樣品前處理均能達到符合要求的回收率試驗結果。從其RSD結果、節(jié)約實驗成本和節(jié)約實驗時間的角度上考慮，本研究選擇不用凈化管的前處理方法。

3.3 基質(zhì)效應的影響分析

本研究分別以純?nèi)軇┖涂瞻谆|(zhì)溶劑分別制備混合對照品溶液考察石斛中農(nóng)藥的基質(zhì)效應，采取2種不同方法進行基質(zhì)效應分析，方法1以空白基質(zhì)溶劑作為對照品溶液的稀釋液，以各組分的峰面積(Y) 對質(zhì)量濃度(X) 繪制基質(zhì)加標標準曲線，將其斜率與純?nèi)軇┡渲频臉藴是€斜率相比[7，10]，結果標準曲線斜率比值為1.06～1.21。方法2采用相對響應值法評價基質(zhì)效應。

基質(zhì)效應=B/A×100%

(1)

A為純?nèi)軇┲修r(nóng)藥的響應值；B為樣品基質(zhì)中添加相同濃度農(nóng)藥的響應值[11]。比較10、100 μg·L-1質(zhì)量濃度下的農(nóng)藥響應值，結果10、100 μg·L-12種高、低不同濃度下的農(nóng)藥響應值差異不大，RSD在4%以內(nèi)。其中吡蟲啉、甲霜靈、毒死蜱的基質(zhì)效應相對大一些，但8種農(nóng)藥的基質(zhì)效應都相對穩(wěn)定，本方法可以用于對石斛進行8種農(nóng)藥的檢測。本研究共檢測了39批不同石斛，其中有2批分別是石斛花和石斛葉，僅從這2批樣品來看，石斛花和葉均有部分農(nóng)藥殘留，石斛葉比花的殘留更高。不同產(chǎn)地之間的農(nóng)藥殘留差異性不大，安徽霍山產(chǎn)的不同石斛總體比其他產(chǎn)地的鐵皮石斛所含農(nóng)藥殘留較少，不同生長年限石斛農(nóng)藥殘留差異性不大，3種不同石斛所含農(nóng)藥殘留排序為銅皮石斛<霍山石斛<鐵皮石斛。

本研究采用一種無需凈化、簡易快捷的樣品前處理方法，利用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜對不同石斛中的常見8種農(nóng)藥殘留進行快速檢測，該方法檢測靈敏度高、基質(zhì)干擾小、穩(wěn)定性好，能獲得較高的回收率，適用于石斛農(nóng)藥殘留安全檢測與質(zhì)量控制。