基于“扶正祛邪”理論的生血寶合劑輔助治療新型冠狀病毒肺炎的可行性分析△

于金高，唐志書*，劉妍如，許洪波，周瑞，宋忠興，閆亞峰，常愛冰，周建平

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究與 開發(fā)國家重點實驗室(培育)/陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083；2.清華德人西安幸福制藥有限公司，陜西 西安 710043

生血寶合劑是由制何首烏、女貞子、桑椹、墨旱蓮、白芍、黃芪、狗脊經(jīng)煎煮提取、減壓濃縮制得的液體口服制劑，收載于2015版《中華人民共和國藥典》，具有滋補肝腎、益氣生血的功效，臨床上用于治療神疲乏力、頭暈耳鳴等氣血虧虛證以及用于放療、化療、缺鐵性貧血等的輔助治療。臨床研究表明，生血寶合劑等補血劑具有提升機體造血機能、提高血液中各類型T細胞和自然殺傷細胞水平、改善機體炎癥狀態(tài)、緩解疲勞感等作用[1-3]。

2019年底湖北省武漢市及其周邊城市爆發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠狀病毒(2019-nCoV或SARS-CoV-2)感染引起的呼吸系統(tǒng)疾病[4-5]，主要表現(xiàn)為肺部毛玻璃樣病變，伴隨發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、疲倦以及部分胃腸道系統(tǒng)癥狀，重癥患者還伴隨膿毒癥休克、代謝性酸中毒和凝血功能障礙[6]?？傊?，免疫功能紊亂、肺部炎性損傷以及凝血功能異常等是COVID-19的主要病理特征，其中炎癥風暴的產(chǎn)生是患者病情惡化的重要原因之一[7]。

目前，中醫(yī)藥在防治COVID-19過程中發(fā)揮了一定作用，能夠多途徑協(xié)同發(fā)揮調(diào)節(jié)機體免疫力、抑制炎性反應(yīng)等作用，從而明顯改善患者各方面癥狀，縮短病程，減少危重癥患者的發(fā)生率，降低病死率[8]。在COVID-19疾病恢復(fù)期，人參、黃芪等補虛藥被廣泛用于患者康復(fù)調(diào)理，起到了良好的輔助治療作用，這些都體現(xiàn)了中醫(yī)藥“扶正祛邪”治療理念的優(yōu)勢。由于生血寶合劑是臨床上常用的補血劑，主要作用于血液循環(huán)系統(tǒng)，且能顯著提升機體免疫功能，故本課題組基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，探討生血寶合劑對COVID-19的潛在輔助治療作用，為生血寶合劑的臨床應(yīng)用提供合理依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 生血寶合劑化學(xué)成分收集

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺[9](TCMSP，http：//tcmspw.com/)對常用的499種中藥當中的12 144個化學(xué)成分進行了系統(tǒng)收集整理，本研究借助該平臺搜索“何首烏”“女貞子”“桑椹”“墨旱蓮”“白芍”“黃芪”“狗脊”等關(guān)鍵詞，并結(jié)合PubChem數(shù)據(jù)庫(http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)收集生血寶合劑中的化學(xué)成分以及各化學(xué)成分的藥代動力學(xué)等參數(shù)。

1.2 化學(xué)成分及其靶標蛋白篩選

根據(jù)收集到的化學(xué)成分列表及其附帶的口服生物利用度(OB)、類藥性(DL)等信息，以O(shè)B≥30%或DL≥0.18作為篩選閾值，篩選生血寶合劑中能被較好地吸收入血的化學(xué)成分，作為潛在活性成分。在此基礎(chǔ)上，進一步借助TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢潛在活性成分的靶標蛋白，并借助UniProt數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)等將靶標蛋白名稱轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的基因名稱。

1.3 抗病毒性肺炎活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選出的潛在活性成分及其對應(yīng)的靶標蛋白基因列表等信息輸入Cytoscape 3.7.2軟件(http：//www.cytoscape.org/)[10]，構(gòu)建潛在活性成分的靶點網(wǎng)絡(luò)，并將化合物對應(yīng)靶點與MalaCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.malacards.org/)中重癥急性呼吸綜合征(SARS)等疾病的病理靶點進行疊加，取交集，篩選出與呼吸道病毒關(guān)聯(lián)密切的靶點，其對應(yīng)的活性成分作為生血寶合劑的抗病毒性肺炎活性成分。

1.4 靶點通路分析

為進一步獲得各靶點的生物學(xué)功能以及涉及的生物學(xué)通路信息，將靶標蛋白基因列表導(dǎo)入UniProt數(shù)據(jù)庫將靶基因名稱規(guī)范化校正，并導(dǎo)入R軟件(V3.6)Bioconductor平臺中的Cluster profiler進行基因本體(GO，gene ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路分析。同時借助STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)查詢靶點間相互作用信息。

1.5 抗病毒性肺炎活性成分-靶點分子對接

為進一步篩選生血寶合劑中可能干預(yù)2019-nCoV感染過程的潛在活性成分，將1.3中交集分析篩選出的抗病毒性肺炎活性成分與人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)以及2019-nCoV病毒的S蛋白[11]進行分子對接：以ChemOffice軟件構(gòu)建活性成分3D分子結(jié)構(gòu)，并調(diào)整空間構(gòu)象，使其能量最小化，保存為*mol2格式。從PDB數(shù)據(jù)庫(https：//www.rcsb.org/)下載靶蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)(PDB編號為2ajf和6vsb，*PDB格式)，采用LibDock分子對接程序進行分子對接，用程序內(nèi)置的LibDockSocre打分函數(shù)篩選分值>100的復(fù)合物構(gòu)象。篩選出的構(gòu)象對應(yīng)的活性成分即為可能具有抗COVID-19作用的活性成分。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分的收集

以O(shè)B和DL為主要篩選條件，結(jié)合生血寶合劑中各中藥的化學(xué)成分研究進展，共獲得143個化學(xué)成分。其中來源于何首烏的成分主要為大黃素、大黃酚等蒽醌類以及白藜蘆醇、沒食子酸、兒茶素等多酚類成分；來源于女貞子的成分主要為木犀草素、芹菜素、槲皮素等黃酮類以及女貞苷、紅景天苷、羥基酪醇等；來源于桑椹的成分主要為花青素、楊梅素、桑色素、蘆丁等黃酮類成分；來源于墨旱蓮中的成分主要為木犀草苷、芹菜素、金合歡素、紅車軸草素等黃酮類成分；來源于白芍中的成分主要為芍藥苷等單萜糖苷類以及兒茶素、沒食子酸、山柰酚等酚酸或黃酮類成分；來源于黃芪的成分主要為毛蕊異黃酮、芒柄花素等黃酮類以及少量三萜類成分(主要成分黃芪甲苷等三萜皂苷類因OB和DL值均低于設(shè)定的閾值，故未納入研究)；來源于狗脊的成分主要為牛膝甾酮等。經(jīng)過文獻分析[12-17]，本研究收集的化合物均為生血寶合劑各藥味的主要活性成分，且這些成分均能通過口服吸收入血，因此能夠較好地代表生血寶合劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.2 抗病毒性肺炎活性成分篩選

生血寶合劑中篩選出的主要化學(xué)成分經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢，共得660個體內(nèi)相互作用靶點(見圖1)；將這些靶點與SARS相關(guān)病理靶點進行交集分析后，進一步得到39個共有靶點(見圖1、表1)，并對應(yīng)著45個活性成分(見表2)。這表明生血寶合劑可能通過調(diào)節(jié)這39個呼吸道病毒相關(guān)靶點發(fā)揮抗病毒性肺炎作用，且這45個化學(xué)成分是關(guān)鍵的抗病毒性肺炎活性成分。

注：藍色圈代表潛在活性化學(xué)成分匹配的靶點；黃色圈代表SARS相關(guān)病理靶點；兩者交集為共有靶點。圖1 生血寶合劑化學(xué)成分作用靶點與 SARS相關(guān)病理靶點的交集分析圖

對共有靶點的分析表明，生血寶合劑主要通過調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)、固有免疫系統(tǒng)功能、氧化-抗氧化平衡、病毒入侵、組織器官損傷等生理/病理過程發(fā)揮抗病毒性肺炎作用。另外，機體凝血功能參與了固有免疫系統(tǒng)的啟動過程，在抵抗炎癥的過程中起重要作用。在39個共有靶點中，有23個靶點與機體免疫和炎癥過程相關(guān)，可見調(diào)節(jié)機體免疫和炎癥是生血寶合劑最主要的作用途徑。在病毒入侵過程相關(guān)靶點中，腎素-血管緊張素通路占主要部分，包括腎上腺素能受體、腎素、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶等，該通路恰是SARS病毒和2019-nCoV病毒入侵機體的主要途徑[11，18]。

表1 生血寶合劑的抗病毒性肺炎作用靶點(共有靶點)

注：表中靶點縮寫和對應(yīng)的功能來自于UniProt或GeneCards數(shù)據(jù)庫。

表2 生血寶合劑抗病毒性肺炎活性成分

注：抗病毒性肺炎活性成分即共有靶點對應(yīng)的活性成分，TCMSP_ID為TCMSP數(shù)據(jù)庫中化合物分子識別號。

對45個抗病毒性肺炎活性成分的分析表明，黃酮類成分(23個)是生血寶合劑的主要的活性成分，占總數(shù)的51%，主要來自于女貞子、桑椹、墨旱蓮、白芍、黃芪等藥味；其次是蒽醌類(4個)、多酚和酚酸類(6個)成分，共占總數(shù)的22%，主要來自于何首烏、白芍等藥味；其余成分如萜類、甾酮等主要來自于墨旱蓮、女貞子、白芍、狗脊等藥味。綜合以上結(jié)果，何首烏、白芍、墨旱蓮、女貞子、桑椹等藥味相對貢獻較大，大致與生血寶合劑的組方規(guī)律相吻合，即何首烏補肝腎、益精血為君藥，女貞子、墨旱蓮、桑椹等滋補肝腎為臣藥，白芍等養(yǎng)血柔肝為佐使藥。

2.3 中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)和生物學(xué)通路分析

為進一步明確生血寶合劑各藥味、抗病毒性肺炎活性成分、作用靶點三者之間的相互關(guān)系，采用Cytoscape軟件對三者進行網(wǎng)絡(luò)分析(見圖2)，采用度值(Degree)衡量各節(jié)點的權(quán)重。在7味中藥中，桑椹、女貞子、墨旱蓮的度值最高，依次為86、80、58，狗脊度值最低；主要原因為桑椹、女貞子、墨旱蓮貢獻了較多的黃酮類成分，該類成分是主要的抗病毒性肺炎活性成分，而狗脊僅貢獻了1個成分。在39個靶點中，前列腺素G/H合成酶1(PTGS1)、轉(zhuǎn)錄因子AP1(JUN)、(白介素-6)IL6、白介素-10(IL10)、腎上腺素能受體(ADRB2)等度值最高，依次為91、45、44、38、38，其原因為PTGS1與各活性成分的連接最多，而JUN、IL6、IL10、ADRB2等靶點與其他靶點相互作用緊密。

GO富集分析和KEGG富集分析表明，生血寶合劑主要干預(yù)病原體應(yīng)答(response to lipopolysaccharide、response to molecule of bacterial origin)、細胞因子生成(positive regulation of cytokine production)、抗體應(yīng)答(response to antibiotic)、免疫細胞激活(regulation of leukocyte cell-cell adhesion、regulation of T cell activation)等生物學(xué)過程，主要涉及炎癥應(yīng)答相關(guān)通路(Inflammatory bowel disease、IL-17 signaling pathway、cytokine-cytokine receptor interaction)和病毒感染相關(guān)通路(Influenza A、Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor)等(見圖3)。

綜合以上結(jié)果并結(jié)合表1，可見炎癥調(diào)節(jié)、病毒入侵等環(huán)節(jié)是生血寶合劑最主要的抗病毒性肺炎作用途徑。

注：■中藥；●化學(xué)成分；◆靶點；中藥與化學(xué)成分之間以實線連接；化學(xué)成分與靶點之間以虛線連接；靶點之間以實線連接，并根據(jù)靶點之間的相互作用強度設(shè)置連線粗細。圖2 生血寶合劑中藥-活性成分-抗病毒性肺炎作用靶點網(wǎng)絡(luò)

注：A.共有靶點涉及的生物學(xué)過程，來源于GO富集分析；B.共有靶點涉及的生物學(xué)通路，來源于KEGG通路富集分析。圖3 生血寶合劑抗病毒性肺炎可能涉及的生物學(xué)過程和生物學(xué)通路

2.4 分子對接

ACE2蛋白是宿主細胞膜表面蛋白，其正常功能是催化生成血管緊張素，SARS病毒和2019-nCoV病毒均通過結(jié)合至該靶點從而通過胞吞作用進入細胞，而2019-nCoV病毒蛋白衣殼上的刺突糖蛋白(即S蛋白)在此過程中起著關(guān)鍵作用，該蛋白的活性結(jié)構(gòu)域能與人ACE2蛋白緊密結(jié)合，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生胞吞作用[11]。采用LibDock對接程序?qū)⑸獙毢蟿┲械目共《拘苑窝谆钚猿煞忠来闻c這些蛋白進行對接，并經(jīng)打分程序評分，得到女貞果苷D、西托糖苷、長春藤皂苷元、紫鉚素、蘆丁等得分>100的活性成分，這些成分可能對病毒入侵過程起到直接的干預(yù)作用(見表3)。另外，從表3的數(shù)據(jù)可知，同一個化學(xué)成分與人ACE2和2019-nCoV的S蛋白對接時，其分值均較接近，原因可能是2個靶蛋白的活性域結(jié)構(gòu)具有互補性，小分子結(jié)合到任一蛋白活性域均能干擾兩者的結(jié)合。

圖4展示了女貞果苷D與ACE2和2019-nCoV S蛋白的對接情況，其中女貞果苷D與ACE2蛋白TRP436等位點間存在氫鍵等相互作用，與2019-nCoV S蛋白ARG393等位點存在氫鍵和Pi-陽離子等相互作用。

表3 生血寶合劑活性成分與ACE2和 2019-nCoV S蛋白對接結(jié)果

注：—表示得分<100。

注：A.ACE2蛋白靶點對接圖；B.2019-nCoV S蛋白對接圖；各圖左側(cè)為對接構(gòu)象，右側(cè)為分子間作用力位點；不同分子間作用力以不同顏色表示，女貞果苷D為藍色骨架。圖4 女貞果苷D與關(guān)鍵靶蛋白活性域的對接構(gòu)象和分子間作用力分布

3 討論

相對于化學(xué)藥和生物藥，中醫(yī)藥在應(yīng)對SARS、COVID-19等疫情方面有著特殊的優(yōu)勢。一方面，由于疫情爆發(fā)迅速、病毒致病特點未知、化學(xué)藥物作用靶點單一等原因，在疫情防治過程中很容易陷入無藥可用和盲目治療的尷尬境地；中醫(yī)藥因診斷和治療方法不基于未知病毒，而是基于人體感染病毒后出現(xiàn)的不同臨床癥狀，辨別證型，對證下藥，因而能夠做到迅速開具個體化處方，減少病情貽誤，且經(jīng)濟簡便，易于被患者接受。另一方面，在治療理念上，中醫(yī)藥注重“扶正祛邪”，通過提高機體的免疫能力，加快機體自愈。從中醫(yī)藥防治COVID-19的整體效果來看，降低炎癥水平、防止發(fā)生炎癥風暴，是中醫(yī)藥的核心作用之一，體現(xiàn)了中醫(yī)藥“調(diào)節(jié)機體而非單純治病”這種治療理念的優(yōu)勢。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，試圖揭示生血寶合劑可能的抗病毒性肺炎作用及其蛋白靶點以及對應(yīng)的活性成分。研究表明，調(diào)節(jié)機體免疫功能、改善炎癥反應(yīng)是生血寶合劑主要的作用途徑，對應(yīng)的活性成分為黃酮、多酚、蒽醌等類成分。任越等[29]通過構(gòu)建花生四烯酸代謝通路相關(guān)藥效團模型，從中藥化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫中篩選出了大黃素甲醚葡萄糖苷等具有潛在抑制炎癥風暴的小分子。而本研究同樣表明，大黃素類成分能夠與炎癥相關(guān)靶點產(chǎn)生相互作用。

另外，調(diào)節(jié)機體凝血功能也是生血寶合劑的可能作用途徑，表明生血寶合劑可能通過對血液循環(huán)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)發(fā)揮治療COVID-19的作用。最后，針對2019-nCoV 入侵機體的刺突蛋白和ACE2蛋白，采用分子對接方法尋找生血寶合劑中可能直接抑制該病毒的活性成分，結(jié)果顯示來自于女貞子的女貞果苷D、西托糖苷、長春藤皂苷元、紫鉚素、蘆丁等具有較高的對接得分，可能具有潛在的開發(fā)價值。

目前，中醫(yī)藥預(yù)防和治療方案中，玉屏風散等益氣固表方主要用于預(yù)防階段；麻杏石甘湯等清熱劑應(yīng)用最廣，主要用于治療階段；而在恢復(fù)階段主要采用具有益氣養(yǎng)陰功效的補益劑[6]。本研究的結(jié)果提示，生血寶合劑可能通過增強機體免疫功能、調(diào)節(jié)炎癥、調(diào)節(jié)血液循環(huán)系統(tǒng)功能等，從而可能對COVID-19起到輔助治療作用；且生血寶合劑作為臨床上常用的補血劑，較適合于恢復(fù)期調(diào)養(yǎng)的患者或治療期伴隨貧血癥狀的患者。