四季抗病毒合劑治療小兒新型冠狀病毒肺炎的可行性分析△

劉妍如，唐志書*，宋忠興，周瑞，許洪波，于金高，張君威，王昌利，，馬虎強(qiáng)

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室(培育)/ 陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083；2.陜西海天制藥有限公司，陜西 咸陽 712046

2020年2月8日，武漢兒童醫(yī)院報道了中國首例兒童感染新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)危重病例[1]。隨著全國COVID-19確診病例的不斷上升，兒童病例報道也逐漸增多，最小確診病例僅為出生30 h的新生兒。盡管數(shù)據(jù)顯示兒童感染病例遠(yuǎn)少于成人，但兒童的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，對細(xì)菌、病毒的抵抗力也比成人更弱，屬于易感人群，更需要嚴(yán)密關(guān)注。目前，臨床使用的洛匹那韋、利托那韋和瑞德西韋等抗病毒藥物并不是針對兒童研發(fā)的，臨床有效性和安全性也有待觀察[2-3]。中醫(yī)認(rèn)為，治病應(yīng)充分考慮小兒“臟腑嬌嫩、形氣未充”的特點，以扶正祛邪為本，側(cè)重清熱解毒、通腑泄熱、活血化瘀和健脾燥濕。目前，中醫(yī)藥療法雖已顯示出臨床療效，但大多數(shù)的藥物或復(fù)方制劑都不適合小兒“臟嬌”的特點。因此，找到一種符合小兒體質(zhì)特點的藥物是非常必要的。

四季抗病毒合劑是由魚腥草、桑葉、連翹、菊花、薄荷、桔梗、荊芥、紫蘇葉、苦杏仁、蘆根和甘草11味中藥組成的中藥復(fù)方口服制劑。四季抗病毒合劑在臨床上對于小兒呼吸道感染的治療作用得到了一定程度的肯定，但對于其活性成分及療效機(jī)制的研究卻鮮有報道[4-6]。因此，本研究從其臨床有效性和安全性評價入手，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“中藥-成分-疾病-靶點”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，從整體預(yù)測藥物靶點、作用通路和干預(yù)機(jī)制，采用分子對接技術(shù)篩選抗病毒活性成分，以闡釋其干預(yù)COVID-19的作用內(nèi)涵。

1 資料與方法

1.1 四季抗病毒合劑治療小兒呼吸道感染有效性和安全性評價

1.1.1數(shù)據(jù)來源 以“四季抗病毒合劑”或“四季抗病毒”為主題詞(或關(guān)鍵詞)，從中國期刊全文數(shù)據(jù)庫(CNKI)、萬方數(shù)字化期刊數(shù)據(jù)庫和維普數(shù)據(jù)庫(VIP)中檢索文獻(xiàn)。時間范圍為1979年—2020年3月。從PubMed、Web of Science和Cochrane library數(shù)據(jù)庫中以Title/Abstract檢索“siji kangbingdu”，檢索截止時間為2020年3月。檢索無語言限制。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn) 納入meta分析的文獻(xiàn)應(yīng)滿足以下條件：1)研究設(shè)計，隨機(jī)對照(randomized controlled trial，RCT)試驗，采用或不采用盲法；加入平行對照組(安慰劑組或陽性藥物組)。2)研究對象，根據(jù)《小兒衛(wèi)生總微論方》所載：“當(dāng)以十四以下為小兒治”，研究對象納入年齡應(yīng)為0～14歲的兒童，包括新生兒、嬰兒、幼兒和兒童；病理狀態(tài)符合《急性上呼吸道感染基層診療指南》(2018年)、《實用兒科學(xué)》及《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第六版)》中對急性上呼吸道感染、流感和病毒性肺炎的相關(guān)描述。3)干預(yù)方法，觀察組干預(yù)方法為四季抗病毒合劑或在常規(guī)治療(抗炎、抗感染、止咳、退熱)基礎(chǔ)上加用四季抗病毒合劑；對照組干預(yù)方法為抗病毒藥物利巴韋林、干擾素或聯(lián)合常規(guī)治療。4)結(jié)果評價方法，根據(jù)《中醫(yī)病癥診療標(biāo)準(zhǔn)》《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》，有明確的臨床療效判定標(biāo)準(zhǔn)；有明確的臨床總有效率計算結(jié)果，數(shù)據(jù)應(yīng)包括顯效病例數(shù)、有效病例數(shù)和無效病例數(shù)。

1.1.3排除標(biāo)準(zhǔn) 1)非臨床研究；2)研究對象為非呼吸道感染的病例；3)其他臨床研究：評論、病例個案報告、通訊、社論和問卷調(diào)查。

1.1.4數(shù)據(jù)收集和提取 刪除重復(fù)文獻(xiàn)，根據(jù)Cochrane Handbook 評價手冊以Reviewer Manager 5.3軟件對納入文獻(xiàn)進(jìn)行風(fēng)險偏倚和質(zhì)量評估，評價結(jié)果以“低風(fēng)險”“非明確風(fēng)險”“高風(fēng)險”表示。數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以減少報告偏差和誤差。

1.2 四季抗病毒合劑治療小兒COVID-19的可行性分析

1.2.1化學(xué)成分收集及篩選 從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(The traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//www.tcmspw.com)中收集四季抗病毒組方中藥魚腥草、桔梗、桑葉、連翹、荊芥、薄荷、紫蘇葉、苦杏仁、蘆根、菊花和甘草的主要化學(xué)成分[7]。進(jìn)一步以O(shè)B≥30%或DL≥0.18作為條件，對化合物進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

1.2.2化合物及疾病相關(guān)靶點篩選 從TCMSP和Pubchem(http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中搜索化合物對應(yīng)的靶點，以UniProt數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/uniprot/)對收集的靶點進(jìn)行規(guī)范化和校正，得到成分相關(guān)的基因靶點。在MalaCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.malacards.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(Therapeutic Targets Database，http：//bidd.nus.edu.sg/ BIDD-Databases/ TTD/ TTD.asp)和OMIM 數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)中輸入關(guān)鍵詞“SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome)”“Respiratory Failure”，搜索已報道的與冠狀病毒感染相關(guān)的基因。剔除重復(fù)和假陽性基因后，整理得到與冠狀病毒感染相關(guān)的靶點基因。

1.2.3“成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將上述得到的化合物相關(guān)靶點和疾病相關(guān)靶點以Venn工具(2.1.0，https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)取靶點交集。將交集內(nèi)靶點導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)，以人類(Homosapiens)為種屬，查詢蛋白相互作用信息，從而構(gòu)建PPI(Protein to Protein Interaction)網(wǎng)絡(luò)。

整合PPI網(wǎng)絡(luò)的蛋白互作信息，“成分-疾病-靶點”及“中藥-成分”信息，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“中藥-成分-疾病-靶點”預(yù)測網(wǎng)絡(luò)。以網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點和邊線來描述化合物與中藥、疾病和靶點之間的關(guān)系，以Cytoscape 的Network analysis插件分析并提取網(wǎng)絡(luò)節(jié)點和邊的特征。

1.2.4生物過程注釋及代謝通路分析 為了分析四季抗病毒合劑的作用機(jī)制，采用R軟件包(3.6.2)的Cluster profiler包對交集靶點進(jìn)行GO(Gene Ontology)生物信息學(xué)富集分析，用3個本體(Ontology)來描述基因靶點的分子功能(Molecular Function，MF)、所處的細(xì)胞位置(Cellular Component，CC)和參與的生物過程(Biological Process，BP)[8]。然后以KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https：//www.kegg.jp/)數(shù)據(jù)庫對靶點基因參與的主要生化代謝途徑進(jìn)行富集和注釋，顯著性差異設(shè)定卡值為P<0.05，以R軟件包(3.6.2)的ggplot2包進(jìn)行繪圖。最終整合冠狀病毒感染的病理學(xué)、分子生物學(xué)機(jī)制研究，對四季抗病毒合劑的多成分、多靶點、多途徑協(xié)同抗COVID-19的機(jī)制進(jìn)行闡釋。

1.3 四季抗病毒合劑抗新型冠狀病毒(2019-nCoV或SARS-CoV-2)的活性化合物預(yù)測

1.3.1靶點與配體預(yù)處理 以上海科技大學(xué)饒子和、楊海濤課題組公布的2019-nCoV 3CLpro高分率晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：6LU7，https：//www.rcsb.org/structure/6LU7)為對接模板用于分子對接位點分析。采用Schrodinger-2018軟件對6LU7結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫、去水、去雜原子等預(yù)處理。以6LU7原配體化合物為參照，將四季抗病毒合劑中經(jīng)口服生物利用度(OB)、類藥性(DL)篩選的化合物作為對接配體，并對各化合物分子進(jìn)行加氫等優(yōu)化預(yù)處理，生成批量處理文件。

1.3.2分子對接 以原始配體分子為中心(盒子大小設(shè)為14?)生成格點文件。以6LU7作為剛性受體，各配體分子作為構(gòu)象可變化(柔性)配體，進(jìn)行半柔性對接，以對接打分值docking core≤-6作為篩選條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 四季抗病毒合劑可有效治療小兒呼吸道感染

2.1.1文獻(xiàn)檢索結(jié)果及質(zhì)量評估 如圖1文獻(xiàn)篩選流程所示，從中文和英文數(shù)據(jù)庫中檢索文獻(xiàn)共413篇，剔除重復(fù)文獻(xiàn)后為160篇。閱讀所有選中文獻(xiàn)的標(biāo)題或摘要后，排除非臨床研究64篇，數(shù)據(jù)重復(fù)的臨床研究1篇，研究對象為非小兒呼吸道感染的臨床研究56篇，初步篩選得到文獻(xiàn)為39篇。經(jīng)進(jìn)一步閱讀全文詳細(xì)分析，排除非隨機(jī)對照的臨床研究12篇，以中藥復(fù)方作為對照的研究12篇，最終篩選得到15篇RCT文獻(xiàn)(3247例病例)。在這15篇文獻(xiàn)中，14篇文獻(xiàn)以利巴韋林為對照組，1篇文獻(xiàn)以重組人干擾素α1b為對照組。12篇文獻(xiàn)以四季抗病毒合劑為實驗組，2篇以利巴韋林合并四季抗病毒給藥為實驗組，1篇以干擾素合并四季抗病毒合劑聯(lián)合給藥為實驗組[9-23]。

根據(jù)Cochrane Handbook 評價手冊，對入選15篇文獻(xiàn)的隨機(jī)分配方法、分配方案隱藏、雙盲方案、結(jié)論評估、報告偏倚及其他偏倚進(jìn)行了逐條風(fēng)險評估(見圖2)。結(jié)果顯示，4項研究選擇了合適的隨機(jī)分配方法(不包括按就診順序的隨機(jī)分組)，評為“低風(fēng)險偏倚”；其余研究僅提及隨機(jī)分組，未提及具體方法，評為“不明風(fēng)險偏倚”。所有研究均未對分配方案隱藏、雙盲方案進(jìn)行說明，評為“不明風(fēng)險偏倚”。15篇文獻(xiàn)皆對總有效率中的病例數(shù)進(jìn)行了說明，將結(jié)論評估和報告偏倚評為“低風(fēng)險偏倚”。

2.1.2納入研究特征 表1列出了以上15篇文獻(xiàn)的基本研究特征：第一作者、出版時間、研究對象年齡、樣本大小、干預(yù)方法、評價參數(shù)、不良反應(yīng)描述。

圖1 四季抗病毒合劑治療小兒呼吸道感染中英文文獻(xiàn)篩查流程圖

圖2 四季抗病毒合劑治療小兒呼吸道感染文獻(xiàn)風(fēng)險偏倚評價

表1 四季抗病毒合劑治療小兒呼吸道感染納入研究特征

作者-發(fā)表年份年齡例數(shù)(實驗/對照)療程/d干預(yù)方式(實驗/對照)療效評價參數(shù)不良反應(yīng)胡華燕-20086月～14歲522(280/242)3(A+D)/(B+D)總有效率未提及張曼琳-2009 2～7歲60(30/30)5(A+D)/(B+D)總有效率、發(fā)熱、鼻塞流涕、打噴嚏、咳嗽、咽喉腫痛2組無不良反應(yīng)李智敏-20094月～13歲250(130/120)3(A+D)/(B+D)總有效率對照組白細(xì)胞(white blood cell,WBC)減少,停藥后恢復(fù)張旭亞-201048 d～13歲214(138/76)5(A+D)/(B+D)發(fā)熱、鼻塞流涕、咽喉腫痛對照組WBC減少,停藥后恢復(fù)王鐵寶-20104月～12歲290(150/140)3(A+D)/(B+D)總有效率未提及張碧濤-2011 6～12月100(50/50)3(A+D)/(B+D)總有效率、發(fā)熱2組無不良反應(yīng)衛(wèi)小茜-20116月～12歲611(308/303)3(A+D)/(B+D)總有效率實驗組皮疹1例;對照組皮疹2例,WBC減少,停藥后恢復(fù)闕一平-201145 d～14月80(40/40)7(A+D)/(B+D)總有效率未提及胡曉忠-20116月～14歲290(150/140)3～5(A+D)/(B+D)總有效率、發(fā)熱、鼻塞流涕、打噴嚏、咳嗽、咽喉腫痛未提及

續(xù)表1

注：A.四季抗病毒合劑；B.利巴韋林；C.干擾素α1b；D.常規(guī)治療;—表示未提及。

2.1.3療效評估

2.1.3.1總有效率 經(jīng)過初步比較，15個研究中，有14個文獻(xiàn)報道了總有效率，根據(jù)研究的干預(yù)措施的差異，將14個文獻(xiàn)進(jìn)行亞組分析[9-11，13-23]。12項研究為聯(lián)合常規(guī)消炎、退熱治療手段的比較研究，1項為聯(lián)合對照組利巴韋林的比較研究，1項為聯(lián)合干擾素α1b的比較研究。經(jīng)過比較分析，12項聯(lián)合常規(guī)手段的研究間異質(zhì)性P=0.08，I2=38%>20%，說明研究具有中度異質(zhì)性。從敏感性分析結(jié)果來看，12項研究中有1項是影響總體異質(zhì)性的文獻(xiàn)。在刪除該文獻(xiàn)結(jié)果后，研究間異質(zhì)性P=0.40，I2=0%，剩余的研究異質(zhì)性檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義。圖3顯示，除3項研究跨越無效線外[16，19，26]，其余9項研究的95%CL橫線均位于無效線右側(cè)(RR<1)[9，11，14-19，21]，說明四季抗病毒合劑聯(lián)合常規(guī)治療能夠有效治療小兒呼吸道感染，且療效優(yōu)于利巴韋林(RR=0.15，95%Cl[0.12，0.18])。1項聯(lián)合對照利巴韋林和1項聯(lián)合干擾素α1b給藥的有效性P值分別為0.01和0.003(<0.05)，說明四季抗病毒合劑聯(lián)合利巴韋林或干擾素α1b給藥的總體有效率優(yōu)于對照[22-23]。從總體分析結(jié)果來看，14項研究的異質(zhì)性P=0.11，I2=33%>20%，具有中度的異質(zhì)性。總體有效性Z=8.82，P<0.000 01(RR=0.14，95%Cl[0.11，0.17])，說明四季抗病毒合劑治療的總體有效性優(yōu)于利巴韋林或干擾素α1b(見圖3A)。

2.1.3.2呼吸道感染癥狀 根據(jù)干預(yù)對呼吸道感染癥狀的改善類型，將治療指標(biāo)亞組分析按照退熱時間、止咳時間、和咽喉腫痛消除時間進(jìn)行分組并分析。15項研究中有4項研究對干預(yù)后的退熱情況進(jìn)行了統(tǒng)計，從提取的退熱時間(d)亞組分析結(jié)果可以看出(見圖3B)，異質(zhì)性P<0.000 01，I2=97%，說明組間具有很大異質(zhì)性[10，12，20，23]。因此，采用隨機(jī)效應(yīng)模型，標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差(SMD)進(jìn)行統(tǒng)計。由亞組森林圖可見，4項研究的95%Cl橫線均位于無效線的左側(cè)，代表總體效應(yīng)的菱形方塊位于無效豎線的左側(cè)，有效性Z=2.48，P=0.01(RR=-1.49，95%Cl[-2.66，-0.31])。說明四季抗病毒合劑能夠有效治療或緩解呼吸道感染的發(fā)熱癥狀，優(yōu)于利巴韋林或干擾素α1b且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

15項研究中有3項研究對干預(yù)后的止咳時間進(jìn)行了統(tǒng)計，異質(zhì)性P=0.000 2，I2=88%，說明組間具有很大異質(zhì)性(見圖3B)[10，12，23]。刪除張旭亞(2010)研究后，異質(zhì)性P=0.69，I2=0%，說明該研究是造成組間異質(zhì)性的主要來源。亞組森林圖結(jié)果顯示，3項研究的95%Cl橫線均位于無效線的左側(cè)，代表總體效應(yīng)的菱形方塊位于無效豎線的左側(cè)，有效性Z=3.47，P=0.000 5(RR=-0.99，95%Cl[-1.54，-0.43])。說明四季抗病毒合劑能夠有效治療呼吸道感染的咳嗽癥狀，優(yōu)于利巴韋林或干擾素α1b且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

15項研究中有3項研究對干預(yù)后的咽喉腫痛消退時間進(jìn)行了統(tǒng)計，異質(zhì)性P<0.000 01，I2=92%，說明組間具有很大異質(zhì)性(見圖3B)[10，12，23]。亞組森林圖結(jié)果顯示，3項研究的95%Cl橫線均位于無效線的左側(cè)，代表總體效應(yīng)的菱形方塊位于無效豎線的左側(cè)，有效性Z=2.71，P<0.000 01(RR=-0.95，95%Cl[-1.64，-0.26])。說明四季抗病毒合劑能夠有效治療呼吸道感染的咽喉腫痛癥狀，優(yōu)于利巴韋林或干擾素α1b且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

注：A.總有效率分析；B.癥狀緩解亞型分析；C.安全性分析。圖3 四季抗病毒合劑治療小兒呼吸道感染有效性與安全性分析森林圖

總體有效性Z=4.94，P<0.000 01(RR=-1.18，95%Cl[-1.64，-0.71])，說明四季抗病毒合劑對緩解呼吸道感染的發(fā)熱、咳嗽和咽喉腫痛癥狀優(yōu)于利巴韋林或干擾素α1b。

2.1.4安全性評價 對四季抗病毒合劑用藥安全性評價中，納入分析的15項研究中有6項研究對不良反應(yīng)率和具體癥狀進(jìn)行了報道(見圖3C)[11，15，18-20，23]。有4項研究報道了利巴韋林給藥后WBC降低，給藥結(jié)束后恢復(fù)正常[11-12，15，20]；1項研究在四季抗病毒合利巴韋林干預(yù)后出現(xiàn)皮疹[15]；2項研究均提到四季抗病毒合劑給藥后出現(xiàn)了頭痛、腹瀉和惡心嘔吐癥狀[19，23]。分析結(jié)果顯示，組間異質(zhì)性P=0.05，I2=55%，說明了組間的高度異質(zhì)性。刪除張延峰(2015)研究后，異質(zhì)性P=0.42，I2=0%，說明該研究是造成組間異質(zhì)性的主要來源。由森林圖可見，有3項研究跨越了無效線，3項研究的95%Cl橫線位于無效線的左側(cè)，代表總體效應(yīng)的菱形方塊位于無效豎線的左側(cè)，Z=5.23，P<0.000 01(RR=0.44，95%Cl[0.32，0.60])，說明四季抗病毒合劑在治療小兒呼吸道感染中與對照相比不良反應(yīng)較小。

2.2 四季抗病毒合劑具有多成分、多靶點的協(xié)同抗COVID-19作用

2.2.1化學(xué)成分篩選 結(jié)合前期發(fā)表的四季抗病毒合劑成分鑒定結(jié)果與TCMSP數(shù)據(jù)庫收載的組方中藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)，共獲得化學(xué)成分1377個[24]。以口服生物利用度(OB)≥30%或類藥性(DL)≥0.18作為進(jìn)一步篩選條件，得到符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的活性化合物226個。

2.2.2“成分-疾病-靶點”篩選 四季抗病毒的226個活性化合物在TCMSP和Pubchem數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)的靶點共有334個，以Uniprot數(shù)據(jù)庫搜索校正后生成“成分-靶點”集合。從MalaCards數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫中得到與冠狀病毒感染誘發(fā)的急性呼吸綜合癥狀“SARS”和“Respiratory Failure”相關(guān)的靶點共計144個，生成“疾病-靶點”集合。將上述得到的“成分-靶點”和“疾病-靶點”集合以Venn工具 2.1.0取靶點交集，得到交集靶點24個(見圖4A)。將交集內(nèi)靶點導(dǎo)入STRING 11.0，構(gòu)建PPI(Protein to Protein Interaction)網(wǎng)絡(luò)(見圖4B)。

2.2.3“中藥-化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 將篩選得到的24個靶點與中藥進(jìn)行映射，篩選得到88個化學(xué)成分，并生成關(guān)聯(lián)表，與PPI網(wǎng)絡(luò)生成的互作表導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建四季抗病毒合劑的“中藥-化合物-靶點”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。如圖4C所示，所構(gòu)建的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)包括123個節(jié)點和939條邊。圖中節(jié)點大小代表度數(shù)大小，度數(shù)越大，說明該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要，接近中心度越大，說明節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越接近中心。該網(wǎng)絡(luò)中度數(shù)較大，接近中心度>0.45的化合物為槲皮素(度數(shù)=248)、木樨草素(度數(shù)=82)、山柰酚(度數(shù)=50)、β-谷甾醇(度數(shù)=24)、蘆丁(度數(shù)=22)、豆甾醇(度數(shù)=16)和柚皮素(度數(shù)=16)。網(wǎng)絡(luò)中度數(shù)較大，接近中心度>0.5的靶點為PTGS1(度數(shù)=106)、ADRB2(度數(shù)=52)、JUN(度數(shù)=45)、IL6(度數(shù)=41)、IL1B(度數(shù)=35)、IL10(度數(shù)=32)、IFNG(度數(shù)=29)、ACHE(度數(shù)=29)和IL2(度數(shù)=29)。以上結(jié)果表明四季抗病毒合劑在發(fā)揮藥效過程中具有多成分、多靶點的協(xié)同作用。

2.2.4生物過程注釋及代謝通路分析 為了探討四季抗病毒合劑抗COVID-19作用的潛在分子機(jī)制，將“成分-疾病”對應(yīng)的24個靶點通過Cluster profiler進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路注釋，共富集到169條生物學(xué)過程，19條代謝通路。GO富集分析結(jié)果如圖5所示，這些靶點主要分布于質(zhì)膜外側(cè)(GO：0009897，external side of plasma membrane)、細(xì)胞器包膜管腔(GO：0031970，organelle envelope lumen)和分泌顆粒腔(GO：0034774，secretory granule lumen)。其分子功能(MF)主要與細(xì)胞因子受體結(jié)合(GO：0005126，cytokine receptor binding)、細(xì)胞因子活性(GO：0005125，cytokine activity)和G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合活性(GO：0001664，G protein-coupled receptor binding)有關(guān)。生物學(xué)途徑(BP)主要涉及脂多糖反應(yīng)(GO：0032496，response to lipopolysaccharide)、細(xì)菌來源分子效應(yīng)(GO：0002237，response to molecule of bacterial origin)和細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控(GO：0001819，positive regulation of cytokine production)。這些靶點主要調(diào)控的代謝通路為：IL-17信號通路(hsa04657，IL-17 signaling pathway)、細(xì)胞因子受體相互作用通路(hsa04060，Cytokine-cytokine receptor interaction)、病毒蛋白與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路(hsa04061，Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor)和花生四烯酸代謝通路(hsa00590，Arachidonic acid metabolism)。

注：A.“成分-疾病”靶點交集韋恩圖；B.篩選靶點PPI圖；C.“中藥-成分-靶點”關(guān)聯(lián)圖(橙色：活性化合物；紫色：靶點；綠色：組方中藥)。圖4 四季抗病毒合劑治療小兒呼吸道感染“中藥-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖構(gòu)建

2.3 四季抗病毒合劑的黃酮類成分是抑制2019-nCoV 3CL pro蛋白的主要成分

2.3.1對接體系驗證 將對接前后的6LU7原始配體進(jìn)行構(gòu)象疊合來驗證對接方法的準(zhǔn)確度，疊加結(jié)果顯示均方根偏差(RMSD)值為1.281 3? < 2?，說明該對接體系可以用于配體化合物與6LU7的對接測試。

圖5 四季抗病毒合劑靶點GO富集及KEGG通路注釋

2.3.2四季抗病毒合劑化合物對接測試 分子對接的打分值(docking core)絕對值越大說明配體-受體親和力越強(qiáng)，兩者結(jié)合越牢固。將篩選得到的88個化合物與6LU7體系(包括預(yù)處理受體和格點文件)進(jìn)行對接測試，以對接打分值≤-6.0作為篩選條件。結(jié)果得到符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的化合物12個(見表2)。12個化合物中9個為黃酮類化合物，其他分別為酚酸、單萜和生物堿類化合物。對接結(jié)果表明，大部分化合物和受體結(jié)合以發(fā)生氫鍵作用為主，且四季抗病毒合劑中具有2019-nCoV 3CL pro蛋白抑制作用的化合物主要為黃酮類化合物，其結(jié)合位點主要為GLU166、LEU141、CYS145、ASP187和HID163。結(jié)果見表2。

4 討論

四季抗病毒合劑組方是以漢代名醫(yī)張仲景《傷寒論》的古方和清代醫(yī)家吳鞠通《溫病條辨》中的桑菊飲、銀翹散為基礎(chǔ)，尊古創(chuàng)新，加減化裁而得。方中魚腥草微寒，味辛，歸肺經(jīng)，以清解肺熱見長，又具化痰排膿之效。連翹性微寒，味苦，歸肺、心、小腸經(jīng)，辛涼透邪清熱，又可芳香辟穢解毒。桑葉性寒，味甘、苦，歸肺、肝經(jīng)，既可疏散上焦風(fēng)熱，

表2 四季抗病毒候選化合物對接結(jié)果

又可清宣肺熱，涼潤肺燥；三藥協(xié)同為用，清熱解毒，疏散風(fēng)熱，宣肺止咳，為方中之君藥。菊花微寒，味甘、苦，歸肺、肝經(jīng)，具有清散風(fēng)熱，清利頭目的功效；杏仁苦降，歸肺、大腸經(jīng)，能夠肅降肺氣，止咳平喘；桔梗辛散，歸肺經(jīng)，具有開宣肺氣，祛痰利咽的作用，二藥宣降相伍，桔梗又能祛痰利咽，三藥和合，清泄肺熱并解其毒，宣降肺氣以復(fù)其清肅，使君藥清熱宣肺之力大增，故而為臣藥。薄荷辛涼，歸肺、肝經(jīng)，佐君臣發(fā)散風(fēng)熱，又可清利頭目，通鼻竅；荊芥、紫蘇葉辛溫發(fā)散，主歸肺經(jīng)，助連翹發(fā)汗逐外邪；蘆根甘寒，歸肺、胃經(jīng)，其功效清熱，生津止渴，配伍佐藥，主癥兼癥得以消散，皆為佐藥之用。甘草合桔梗使用，既可宣肺止咳，利咽化痰，又可調(diào)和藥性，兼具佐使之功。諸藥配合，全方共奏疏風(fēng)透表，清熱解毒，宣肺止咳之功。

四季抗病毒合劑主要用于小兒呼吸系統(tǒng)感染，本研究對15項臨床研究，3247例病例進(jìn)行循證meta分析。從分析結(jié)果來看，目前四季抗病毒合劑的臨床應(yīng)用多采用聯(lián)合消炎、退熱給藥的治療方法，多與抗病毒藥物利巴韋林、干擾素進(jìn)行對照比較。從meta分析結(jié)果來看，四季抗病毒合劑單用或聯(lián)合常規(guī)給藥的臨床總有效率明顯優(yōu)于對照。在縮短發(fā)熱時間、咳嗽時間、咽喉腫痛時間方面，四季抗病毒合劑不論是單用、聯(lián)合常規(guī)治療，還是聯(lián)合對照給藥，其療效均明顯優(yōu)于利巴韋林或干擾素聯(lián)合常規(guī)治療。在治療過程中，四季抗病毒合劑的不良反應(yīng)較少，在有報道安全性指標(biāo)的6項研究中，僅有3項研究出現(xiàn)了頭痛、腹瀉、嘔吐的報道，而對照利巴韋林給藥后往往出現(xiàn)WBC降低，且出現(xiàn)更多的不良反應(yīng)病例。這些結(jié)果說明在常規(guī)治療基礎(chǔ)上，聯(lián)用四季抗病毒合劑是治療小兒呼吸系統(tǒng)感染安全、有效的措施。然而納入文獻(xiàn)在數(shù)量、質(zhì)量上的缺陷，降低了本次分析的可靠性，因此需要采用國際統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，開展更多大樣本、多中心的隨機(jī)對照雙盲試驗。

到目前為止，COVID-19的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。已有一些研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19主要為2019-nCoV直接致病，病毒的刺突蛋白通過與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)蛋白結(jié)合，介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主，從而激活機(jī)體的免疫細(xì)胞，并使其分泌大量細(xì)胞因子和趨化因子，進(jìn)而導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)出現(xiàn)免疫性炎癥和病理損傷[25]。目前臨床常用具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化作用的清熱解毒中藥，來緩解病毒感染誘發(fā)的“過度保護(hù)”免疫反應(yīng)，減輕肺臟等組織損傷。四季抗病毒合劑具有清熱解毒、清熱消炎的功效，有效性、安全性較高，有治療小兒COVID-19的潛力。然而其組方復(fù)雜，作用機(jī)制難以預(yù)測，使其臨床應(yīng)用受到阻礙。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對四季抗病毒合劑潛在的活性成分和作用靶點進(jìn)行預(yù)測，從系統(tǒng)層面研究其作用機(jī)制。通過構(gòu)建“中藥-成分-疾病-靶點”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，對其中因素進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四季抗病毒合劑中的活性成分與冠狀病毒(SARS-CoV)感染誘發(fā)的“急性呼吸綜合癥”的27個靶點相關(guān)。其中，復(fù)方的黃酮類成分如槲皮素、木樨草素、山柰酚、蘆丁和柚皮素是干預(yù)疾病的主要成分。已有研究顯示，黃酮類化合物對呼吸道感染病毒如SARS-CoV、輪狀病毒、柯薩奇A16、合胞病毒、甲型流感亞型病毒等有顯著的抑制作用，其作用機(jī)制可能通過破壞病毒RNA復(fù)制，干預(yù)病毒解旋酶，抑制神經(jīng)氨酸酶來發(fā)揮抗病毒作用[26]。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致，說明通過“中藥-成分-疾病-靶點”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析四季抗病毒合劑抗COVID-19作用的合理性和科學(xué)性。

本研究的生物信息學(xué)富集結(jié)果顯示，四季抗病毒合劑中的活性成分可通過多個靶點發(fā)揮抗COVID-19的作用。預(yù)測結(jié)果的環(huán)氧化酶1(PTGS1)、βT腎上腺素能受體(ADRB2)、c-Jun蛋白(JUN)、白細(xì)胞介素6(IL6)、白細(xì)胞介素1素(IL1B)、白細(xì)胞介素10(IL10)、干擾素γ(IFNG)、乙酰膽堿酯酶(ACHE)和白細(xì)胞介素2(IL2)在關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中占有重要地位，這些靶點與多種生物過程相關(guān)，主要涉及白細(xì)胞介素-17(IL-17)信號通路、細(xì)胞因子受體相互作用通路、病毒蛋白與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路和花生四烯酸代謝通路，這些生物過程與病毒感染造成的自身免疫反應(yīng)和炎癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。IL-17信號通路是四季抗病毒成分作用靶點的重點富集通路，IL-17由輔助性T細(xì)胞(Th17)和先天性免疫細(xì)胞分泌，是一個重要的促炎癥細(xì)胞因子，IL-17受體(IL-17R)通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體IL-17R-Act1-TRAF6激活下游IL-6、IL-1β、核因子κB(NF-κB)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等炎癥相關(guān)信號通路，在多種炎性反應(yīng)及自身免疫性疾病病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。從本研究的PPI分析及代謝通路富集結(jié)果來看，四季抗病毒合劑活性成分主要作用于 IL-17信號通路，推測其機(jī)制為通過抑制白細(xì)胞介素8(IL8)/ C-X-C-趨化因子配體8(CXCL8)、C-X-C-趨化因子配體10(CXCL10)、C-X-C-趨化因子配體2(CXCL2)和C-C趨化因子配體2(CCL2)等多種趨化因子的產(chǎn)生，降低粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在炎癥部位的聚集，來降低炎性效應(yīng)。同時，還可以通過降低IL-17對環(huán)氧化酶1(PTGS1)的誘導(dǎo)作用，對感染COVID-19后出現(xiàn)的多種并發(fā)癥有緩解作用，如維持血小板水平、保護(hù)胃腸道黏膜、改善腎臟損傷等。而PTGS1也是關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點，和四季抗病毒合劑中多個重要活性成分顯著相關(guān)。GO富集分析及網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)結(jié)果顯示，四季抗病毒合劑中的化合物可能通過直接或間接作用于PTGS1來降低前列腺素H2(PGH2)的擴(kuò)血管作用，從而抑制炎癥細(xì)胞進(jìn)入炎癥部位；也可能通過抑制PGH2下游代謝促炎物質(zhì)前列腺素E2(PGE2)、前列腺素D2(PGD2)、前列腺素F2α(PGF2α)大量生成，來修復(fù)組織器官損傷[27]。

在闡釋四季抗病毒合劑對COVID-19及并發(fā)癥具有抗炎的“治標(biāo)”作用同時，也對其在新型冠狀病毒復(fù)制過程中的干擾作用進(jìn)行了分析，以期找到“治本”的關(guān)鍵信息。3C樣蛋白酶(3CLpro)是在2019-nCoV復(fù)制過程中的重要蛋白，其序列高度保守，是一類半胱氨酸水解酶，主要作用是水解冠狀病毒復(fù)制過程中編碼的多聚蛋白pp1a和pp1ab來產(chǎn)生功能蛋白，人體中尚未發(fā)現(xiàn)相似的水解酶[28]。因此，本研究采用計算機(jī)輔助藥物設(shè)計的分子對接技術(shù)，以2019-nCoV 3CLpro作為抗新型冠狀病毒靶標(biāo)篩選的首選蛋白，提取“成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵化合物作為配體，通過搜索受體-配體結(jié)合的優(yōu)勢構(gòu)象，評價對接分子的結(jié)合強(qiáng)度，找到兼有“治標(biāo)”和“治本”作用的活性化合物。通過結(jié)合藥代動力學(xué)和藥物設(shè)計學(xué)參數(shù)，篩選得到12個對3CLpro有潛在抑制作用的化合物。通過分析其類型和結(jié)合位點發(fā)現(xiàn)，這些化合物中大多為黃酮、黃酮醇類化合物，主要和受體的GLU166、LEU141、CYS145和HID163位點發(fā)生氫鍵作用，說明這些化合物在發(fā)揮抗炎作用同時，也具有抗病毒的潛力。

綜上所述，本研究對四季抗病毒合劑臨床用藥的有效性、安全性進(jìn)行了循證醫(yī)學(xué)評價，提出其在治療小兒COVID-19方面具有潛在的可行性。同時對其在干預(yù)COVID-19及并發(fā)癥中的活性成分、作用靶點、相關(guān)通路和作用機(jī)制進(jìn)行了探索性研究。研究結(jié)果初步表明，四季抗病毒合劑在干預(yù)新型冠狀病毒感染方面，不但與炎癥通路相關(guān)性較高，其重要活性成分還有潛在的抗病毒作用，說明四季抗病毒合劑可通過多成分、多靶點、多通路的互作模式達(dá)到兼顧“治標(biāo)”和“治本”的治療作用。