華北大黑鰓金龜引誘劑配方篩選及引誘效果評(píng)價(jià)

李曉峰, 李金橋, 曹雅忠, 尹 姣, 張 帥, 秦建輝, 王思雨, 陸俊姣, 李克斌,*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193; 2. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 太原030000)

華北大黑鰓金龜Holotrichiaoblita屬鞘翅目鰓金龜科，是華北旱作區(qū)重要的地下害蟲(chóng)(仵均祥等, 2011)，其幼蟲(chóng)(又稱蠐螬)取食植物的地下部分(張美翠等, 2014)，常常造成花生、大豆、馬鈴薯等嚴(yán)重減產(chǎn)(程松蓮等, 2008)。由于蠐螬具有土棲性，為害方式隱蔽，以往主要依靠持效期長(zhǎng)的化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，如六六六、涕滅威等(馬光蓮, 1987)，這類農(nóng)藥都具有高毒性，高殘留特性，早已被國(guó)內(nèi)所禁用。并且隨著化學(xué)農(nóng)藥濫用，這類農(nóng)藥已經(jīng)引起了一系列嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題(鞏雪芳等, 2018)。目前生產(chǎn)上所使用的農(nóng)藥持效期較短，防治蠐螬難以達(dá)到滿意效果，但繼續(xù)使用持效期長(zhǎng)的農(nóng)藥則會(huì)帶來(lái)土壤農(nóng)藥殘留超標(biāo)等諸多不利后果，繼而會(huì)引發(fā)農(nóng)產(chǎn)品安全問(wèn)題(龔東風(fēng)等, 2016)。有一種新舉措是從控制成蟲(chóng)數(shù)量，減少其產(chǎn)卵量入手來(lái)達(dá)到減輕蠐螬為害的目的，即“地下害蟲(chóng)地上治理”的地下害蟲(chóng)防控策略(朱棟等, 2012)。研發(fā)引誘劑在生產(chǎn)中控制華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)基數(shù)有高效、環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)(王攀等, 2017)，引誘劑配方組分來(lái)源主要有植物揮發(fā)物、昆蟲(chóng)聚集信息素、性信息素等。

植物揮發(fā)物由植物地上部分釋放，為植物體內(nèi)的次生代謝物(Petterssonetal., 1998)。其成分復(fù)雜，濃度低(程彬等, 2012)，是昆蟲(chóng)與植物之間重要的化學(xué)信息紐帶(王文強(qiáng)等, 2015)，在昆蟲(chóng)取食和產(chǎn)卵方面起到了重要作用(杜家緯, 2001)。目前，一些植物揮發(fā)物已被證明對(duì)金龜甲有誘集效果。例如，鄰氨基苯甲酸甲酯和順-3-己烯醇對(duì)在歐洲分布較廣的庭園發(fā)麗金龜Phylloperthahorticola有誘集作用(Ruther, 2004)。蓖麻源揮發(fā)物鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)華北大黑鰓金龜具有較強(qiáng)的電生理活性及引誘活性(李為爭(zhēng)等, 2013)。昆蟲(chóng)聚集信息素通常由單一性別產(chǎn)生，對(duì)雌雄兩性均可引起聚集行為(李雪等, 2018)，國(guó)外早在20世紀(jì)90年代就將昆蟲(chóng)聚集信息素廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物生產(chǎn)、倉(cāng)儲(chǔ)和環(huán)境保護(hù)中(趙博光和張松山, 1993)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)利用聚集信息素防治害蟲(chóng)已取得良好的效果。研究表明，云杉八齒小蠹Ipstypographus聚集信息素在林間防治其成蟲(chóng)誘捕量可達(dá)到9 092頭(王澤斌等, 2013)。昆蟲(chóng)性信息素對(duì)靶標(biāo)害蟲(chóng)的引誘具有專一性強(qiáng)、作用距離遠(yuǎn)等特點(diǎn)(高嫚妮等, 2018)，可引誘雄蟲(chóng)向氣味源飛行并與雌蟲(chóng)交配。早在20世紀(jì)90年代，Leal(1998)就在Anomalacuprea性信息素的分離、鑒定以及誘捕效果方面取得了較大進(jìn)展。

有研究表明，植物揮發(fā)物對(duì)昆蟲(chóng)信息素具有增效作用(鞏雪芳等, 2018)。Deng等(2004)發(fā)現(xiàn)，植物揮發(fā)物反-2-己烯醛、苯乙醛等對(duì)甜菜夜蛾性信息素具有明顯的增效作用?？嚅瑩]發(fā)物和光肩星天牛聚集信息素混配后引誘效果強(qiáng)于單一成分(張秀歌等, 2015)。將一定量乙酸葉醇酯與梨小食心蟲(chóng)性信息素混配后發(fā)現(xiàn)增效作用顯著(于海利等, 2015)。李雪等(2018)研究表明將榆樹(shù)揮發(fā)物與華北大黑鰓金龜聚集信息素聯(lián)用的引誘效果相對(duì)于兩者單獨(dú)使用具有顯著的加成作用。本研究挑選植物揮發(fā)物、華北大黑鰓金龜聚集信息素、性信息素各數(shù)種，通過(guò)趨性行為反應(yīng)試驗(yàn)得到各化合物單體的最佳引誘濃度，并以此為依據(jù)將三大類化合物單體兩兩混配，分別為植物揮發(fā)物+聚集信息素、植物揮發(fā)物+性信息素和聚集信息素+性信息素共17種配方。通過(guò)觸角電位(EAG)反應(yīng)、趨性行為反應(yīng)試驗(yàn)逐步篩選活性配方，再將配方與單一成分進(jìn)行引誘效果比較并通過(guò)室內(nèi)籠罩誘捕試驗(yàn)檢驗(yàn)配方的引誘效果。此研究旨在通過(guò)植物揮發(fā)物、聚集信息素、性信息素間的二元混配篩選出對(duì)華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)高效、環(huán)保的引誘劑配方，為該蟲(chóng)綠色防控提供一定的科學(xué)依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試蟲(chóng)

供試?yán)ハx(chóng)為華北大黑鰓金龜，成蟲(chóng)于2019年6月在河北省滄州市農(nóng)林科學(xué)院附近花生田采集。在大田挖取飼養(yǎng)試蟲(chóng)所用的土壤，過(guò)20目篩使土壤顆粒均勻，在干燥箱烘干至恒重，然后與蒸餾水徹底混合，使其濕度保持在18%～20%。將適量的土壤裝入50 cm×40 cm×40 cm的養(yǎng)蟲(chóng)箱內(nèi)，厚度約10 cm。每個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)箱放入100頭成蟲(chóng)，用新鮮的榆樹(shù)葉飼喂(李雪等, 2018)。

1.2 試劑和儀器

試驗(yàn)所用的植物揮發(fā)物來(lái)自蓖麻葉(姚永生, 2004)，分別為鄰苯二甲酸二丁酯[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]、肉桂醛(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、順-3-己烯基乙酸酯[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]、1-己醇[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]、順-3-己烯基異丁酸酯(北京百靈威科技有限公司)。根據(jù)李雪等(2018)研究結(jié)果，所用的華北大黑鰓金龜聚集信息素為順-9-十八烯醛、順-9-十八烯乙酸酯(均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所新農(nóng)藥創(chuàng)制課題組提供)。所用的華北大黑鰓金龜性信息素為甘氨酸甲酯(王惠等, 2002)[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]。EAG反應(yīng)試驗(yàn)中參照揮發(fā)物為順-3-己烯醇[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司](李為爭(zhēng)等, 2013b)。試驗(yàn)所用溶劑為石蠟油[生工生物工程(上海)貿(mào)易有限公司]。所有試劑純度均≥95%，在4℃條件下保存。

Y型嗅覺(jué)儀(泰州市揚(yáng)子江科教儀器設(shè)備有限公司)：嗅覺(jué)儀為玻璃材質(zhì)，管內(nèi)徑3 cm，主臂長(zhǎng)20 cm，兩側(cè)臂長(zhǎng)均為18 cm且?jiàn)A角為75°。 空氣先經(jīng)活性炭除雜后再進(jìn)入Y型玻璃管，流速為500 mL/min。

觸角電位儀(Syntech公司)：由CS-55氣味刺激控制裝置、MP-15微動(dòng)操作器、IDAC2數(shù)據(jù)采集控制器和觸角電位記錄顯示輸出裝置組成。

玻璃籠(泰州市揚(yáng)子江科教儀器設(shè)備有限公司)：規(guī)格為1 m×1 m×1 m，玻璃材質(zhì)。

1.3 信息素單體最佳引誘濃度的測(cè)定

植物揮發(fā)物單體對(duì)華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)的最佳引誘濃度依據(jù)有關(guān)研究報(bào)道(李曉峰等, 2020)，其中鄰苯二甲酸二丁酯、肉桂醛、順-3-己烯基乙酸酯、1-己醇和順-3-己烯基異丁酸酯的濃度分別為0.11, 0.33, 1.00， 0.33和3.00 μg/μL。

將華北大黑鰓金龜信息素單體的引誘濃度分別測(cè)定。共有聚集信息素順-9-十八烯醛和順-9-十八烯乙酸酯、性信息素甘氨酸甲酯3種化合物以石蠟油為溶劑，分別稀釋成0.11, 0.33, 1, 3和9 μg/mL 5個(gè)濃度梯度，通過(guò)趨性行為反應(yīng)試驗(yàn)尋找最佳引誘濃度。根據(jù)試蟲(chóng)晝伏夜出的習(xí)性，試驗(yàn)安排在20∶30-23∶30時(shí)進(jìn)行。測(cè)定室干凈清潔，通風(fēng)狀況良好，溫度(25±1)℃，濕度保持在70%左右。以石蠟油為對(duì)照，不同濃度的化合物單體作為處理分別取20 μL均勻涂抹在4 cm×3 mm(長(zhǎng)×寬)的濾紙條上，而后將對(duì)照和處理分別放入Y型管兩側(cè)臂端作為氣味源。在距離主臂3 cm處接入1頭饑餓處理24 h的試蟲(chóng)，若試蟲(chóng)爬行至任一側(cè)臂的1/2以上且停留時(shí)間在1 min以上，則認(rèn)為試蟲(chóng)有反應(yīng)；若10 min后試蟲(chóng)仍停留在主臂或掉頭離開(kāi)Y型管，則認(rèn)為試蟲(chóng)無(wú)反應(yīng)。每個(gè)處理測(cè)試雌雄試蟲(chóng)各30頭，重復(fù)3次。每次更換處理時(shí)，需分別用75%的酒精及蒸餾水沖洗Y型管，待干燥后即可繼續(xù)使用(李建一等, 2019)。Y型嗅覺(jué)儀測(cè)試中選擇反應(yīng)的計(jì)算公式(Zhouetal., 2009)：

反應(yīng)率(%)=(味源臂試蟲(chóng)數(shù)+對(duì)照臂試蟲(chóng)數(shù))÷測(cè)試總蟲(chóng)數(shù)×100%；

選擇反應(yīng)率(%)=味源臂試蟲(chóng)數(shù)÷(味源臂試蟲(chóng)數(shù)+對(duì)照臂試蟲(chóng)數(shù))×100%。

1.4 各配方組成成分及含量的確定

對(duì)所挑選的植物揮發(fā)物、華北大黑鰓金龜聚集信息素、性信息素三大類間進(jìn)行兩兩混配，共得到17組二元引誘劑配方。根據(jù)1.3節(jié)各化合物單體對(duì)華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)最佳引誘濃度測(cè)試結(jié)果來(lái)確定配方中各成分的含量比例，使配方中兩種化合物單體濃度均為其最佳引誘濃度。以石蠟油為溶劑，每種配方配制100 mL。

1.5 試蟲(chóng)對(duì)不同配方的EAG測(cè)定

從養(yǎng)蟲(chóng)箱挑選活躍的華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)，用鑷子輕輕按住其觸角基部使觸角3個(gè)鰓片打開(kāi)(鄧思思等, 2011)，迅速將觸角從基部切下，用導(dǎo)電膠將其固定在電極兩端，兩電極之間的觸角不可沾膠，否則會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。將配方溶液用移液槍取20 μL均勻涂抹在4 cm×3 mm的濾紙條上，然后將濾紙條縱向?qū)φ酆蠓湃氚退沟鹿苤?，封口處理，待試?yàn)時(shí)取用。試驗(yàn)時(shí)，要保證實(shí)驗(yàn)室干凈清潔無(wú)異味，無(wú)人員走動(dòng)等影響試驗(yàn)結(jié)果的因素。調(diào)試軟件，待基線平穩(wěn)后即可對(duì)觸角進(jìn)行氣味刺激。持續(xù)氣流流速為500 mL/min，刺激氣流流速為40 mL/min。每次刺激時(shí)間0.2 s，兩次刺激時(shí)間間隔30 s以上。隨機(jī)抽取供試配方進(jìn)行測(cè)試，均以20 μL石蠟油作為對(duì)照。以順-3-己烯醇作為標(biāo)準(zhǔn)參照揮發(fā)物。雌、雄成蟲(chóng)分別進(jìn)行測(cè)試。每個(gè)配方及標(biāo)準(zhǔn)參照揮發(fā)物重復(fù)測(cè)定3次，每次重復(fù)測(cè)定時(shí)要更換新的濾紙條，以免濃度偏差對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響，測(cè)試完每個(gè)配方及標(biāo)準(zhǔn)參照揮發(fā)物要測(cè)定一次石蠟油對(duì)照。重復(fù)8個(gè)觸角。每個(gè)觸角測(cè)試10個(gè)配方。EAG反應(yīng)相對(duì)值的計(jì)算公式(李為爭(zhēng)等, 2013b)：

EAG反應(yīng)相對(duì)值(%)=(處理EAG反應(yīng)值-對(duì)照EAG反應(yīng)值)÷(參照物EAG反應(yīng)值-對(duì)照EAG反應(yīng)值)×100%。

1.6 試蟲(chóng)對(duì)不同配方的趨性行為反應(yīng)測(cè)定測(cè)定

通過(guò)Y型嗅覺(jué)儀進(jìn)行測(cè)定，方法如1.3節(jié)。對(duì)1.5節(jié)初步篩選出的配方進(jìn)行趨性行為反應(yīng)測(cè)定，每種配方測(cè)試華北大黑鰓金龜雌雄成蟲(chóng)各30頭，重復(fù)3次。 進(jìn)一步篩選對(duì)試蟲(chóng)有行為反應(yīng)活性的配方。

1.7 不同配方及其單一組分的引誘作用比較

通過(guò)Y型嗅覺(jué)儀進(jìn)行測(cè)定，方法如1.3節(jié)。將1.6節(jié)進(jìn)一步篩選出的對(duì)試蟲(chóng)有行為反應(yīng)活性的配方與其兩種化合物單體組分分別進(jìn)行引誘效果比較。Y型管一個(gè)側(cè)臂端放入20 μL配方溶液，另一側(cè)臂端放入20 μL單一的組分(其濃度與配方中此化合物單體的濃度一致)，每一處理測(cè)試華北大黑鰓金龜雌雄成蟲(chóng)各30頭，重復(fù)3次。

1.8 不同配方對(duì)試蟲(chóng)的籠罩誘捕效果測(cè)試

將1.6節(jié)篩選出的配方在1 m×1 m×1 m的玻璃籠中進(jìn)行籠罩誘捕效果測(cè)試。玻璃籠中距底部15 cm處放置泡沫板，面積與玻璃籠底面積相同。沿玻璃籠底面兩條對(duì)角線兩端分別放置4個(gè)花盆(上直徑18 cm，下直徑13 cm，高13 cm)，花盆上沿與泡沫板平齊。花盆中土壤厚度10 cm，將小誘芯插入1 000 μL移液槍槍頭中形成組合體，而后將組合體插入花盆內(nèi)的土壤上，使小誘芯高出土壤3 cm。試驗(yàn)安排在20:00-23:00時(shí)進(jìn)行，玻璃籠的一條對(duì)角線上的兩個(gè)花盆作為處理組，其小誘芯中均加入60 μL同一配方溶液；另一條對(duì)角線上的兩個(gè)花盆作為對(duì)照組，其小誘芯僅加入60 μL石蠟油。每個(gè)玻璃籠放入雌雄試蟲(chóng)各30頭。保持實(shí)驗(yàn)室干凈清潔，溫度(25±1)℃，相對(duì)濕度保持在70%左右。1 h后觀察誘捕結(jié)果。若試蟲(chóng)掉入花盆或爬在小誘芯上，則認(rèn)為有反應(yīng)；若試蟲(chóng)未進(jìn)入花盆，則認(rèn)為無(wú)反應(yīng)。計(jì)數(shù)完成后打開(kāi)玻璃籠通風(fēng)，0.5 h后重復(fù)試驗(yàn)，每種配方重復(fù)3次?；\罩誘捕試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算公式(Zhouetal., 2009)：

反應(yīng)率(%)=(處理組花盆中試蟲(chóng)數(shù)+對(duì)照組花盆中試蟲(chóng)數(shù))÷總測(cè)試蟲(chóng)數(shù)×100%；

選擇反應(yīng)率(%)=處理組花盆中試蟲(chóng)數(shù)÷(處理組花盆中試蟲(chóng)數(shù)+對(duì)照組花盆中試蟲(chóng)數(shù))×100%。

1.9 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Y型嗅覺(jué)儀測(cè)試中處理和對(duì)照間(配方與其單一組分間)的差異顯著性及籠罩誘捕測(cè)試中處理和對(duì)照間的差異顯著性采用卡方檢驗(yàn)。其他測(cè)試的數(shù)據(jù)采用One-way ANOVA方差分析；其中，Y型嗅覺(jué)儀及籠罩誘捕測(cè)試的反應(yīng)率和選擇反應(yīng)率先進(jìn)行反正弦平方根轉(zhuǎn)換，然后采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行不同處理之間差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 化合物單體對(duì)華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)的最佳引誘濃度

各化合物單體不同濃度對(duì)華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)的引誘效果如表1所示，所有處理的反應(yīng)率均高于87%，表明試蟲(chóng)較活躍，試驗(yàn)結(jié)果可靠。華北大黑鰓金龜聚集信息素順-9-十八烯醛、順-9-十八烯乙酸酯以及性信息素甘氨酸甲酯在濃度分別為0.11, 0.11 和3 μg/μL時(shí)對(duì)試蟲(chóng)的引誘效果最強(qiáng)，引起的選擇反應(yīng)率分別達(dá)到60.12%, 66.09%和64.00%。

表1 化合物單體對(duì)華北大黑鰓金龜?shù)囊T效果Table 1 The attractive effect of each compound on Holotrichia oblita

反應(yīng)率(%)=(味源臂試蟲(chóng)數(shù)+對(duì)照臂試蟲(chóng)數(shù))÷測(cè)試蟲(chóng)數(shù)×100%；選擇反應(yīng)率(%)=味源臂試蟲(chóng)數(shù)÷(味源臂試蟲(chóng)數(shù)+對(duì)照臂試蟲(chóng)數(shù))×100%。數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤；同列數(shù)據(jù)后不同字母表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。Response rate (%)=(number of test insects in odor source tube+number of test insects in the control tube)÷number of test insects×100%. Selective response rate (%)=number of test insects in odor source tube÷(number of test insects in odor source tube+number of test insects in the control tube)×100%. Data are mean±SE. Different letters in the same column indicate significant difference by Duncan’s new multiple range test (P<0.05). 表3和4同The same for Tables 3 and 4.

2.2 二元引誘劑配方中各組分及含量的確定

本試驗(yàn)共有17種二元配方，組成成分已確定。根據(jù)試驗(yàn)2.1節(jié)結(jié)果即各化合物單體對(duì)華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)最佳引誘濃度得到配方中各組分的含量。各配方編號(hào)、組成成分及各成分含量如表2。

2.3 華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)對(duì)17種二元引誘劑配方的EAG反應(yīng)

華北大黑鰓金龜雌成蟲(chóng)對(duì)17種二元引誘劑配方的EAG測(cè)定結(jié)果如圖1(A)所示。結(jié)果表明，2B, 6F, 7G, 9I, 10J和11K共6種配方引起雌蟲(chóng)的EAG反應(yīng)相對(duì)值較大，均在5 722%以上，且均與其他配方引起雌蟲(chóng)的EAG反應(yīng)相對(duì)值呈顯著性差異(P<0.05)。在這6種配方中，引起的EAG反應(yīng)相對(duì)值最高的為配方2B，達(dá)11 093%;其次為配方6F, 7G, 9I, 10J和11K，引起的EAG反應(yīng)相對(duì)值分別達(dá)到7 537%, 6 759%, 5 981%, 5 796%和5 722%。

表2 各二元引誘劑配方組分及含量Table 2 Component and content of each binary attractant formulation

化合物濃度同表1。The concentrations of compounds are the same as in Table 1.

華北大黑鰓金龜雄成蟲(chóng)對(duì)17種二元引誘劑配方的EAG測(cè)定結(jié)果如圖1(B)所示。結(jié)果表明， 2B, 6F, 7G, 9I, 10J, 11K和14N共7種配方引起雄蟲(chóng)的EAG反應(yīng)相對(duì)值較大，均在3 566%以上，且均與其他配方引起雄蟲(chóng)的EAG反應(yīng)相對(duì)值呈顯著性差異(P<0.05)。在這7種配方中，引起EAG反應(yīng)相對(duì)值最高的為配方10J，達(dá)4 712%;其次為配方2B, 14N, 9I, 6F, 11K和7G，引起的EAG相對(duì)反應(yīng)值分別達(dá)到4 677%, 4 438%, 3 983%, 3 878%, 3 809%和3 566%。

從EAG反應(yīng)相對(duì)值來(lái)看，華北大黑鰓金龜雌雄蟲(chóng)對(duì)17種二元引誘劑配方的反應(yīng)比較一致，但雌蟲(chóng)的EAG反應(yīng)相對(duì)值較雄蟲(chóng)更大。配方2B, 6F, 7G, 9I, 10J和11K均可引起雌雄蟲(chóng)較強(qiáng)的電生理反應(yīng)，故可將此6種配方用于進(jìn)一步的篩選。

2.4 華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)對(duì)6種二元引誘劑配方的趨性行為反應(yīng)

華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)對(duì)EAG反應(yīng)試驗(yàn)初篩的6種二元引誘劑配方的趨性行為反應(yīng)結(jié)果如圖2所示，配方9I, 10J和11K對(duì)試蟲(chóng)的引誘數(shù)量均極顯著多于對(duì)照(P<0.01)，3種配方與對(duì)照的引誘試蟲(chóng)數(shù)分別為118vs49, 119vs49, 121vs49頭。而配方2B, 6F和7G這3種配方對(duì)試蟲(chóng)的引誘數(shù)量與對(duì)照相比差異均不顯著(P>0.05)。試蟲(chóng)對(duì)6種二元引誘劑配方的反應(yīng)率均高于91%，可見(jiàn)試蟲(chóng)活性較強(qiáng)，試驗(yàn)結(jié)果可靠(表3)，選擇反應(yīng)率在52.35%～71.21%之間。其中，引起的選擇反應(yīng)率最高的為配方11K，達(dá)71.21%;其次為配方10J和9I，引起的選擇反應(yīng)率分別達(dá)到70.84%和70.72%。這3種配方引起的選擇反應(yīng)率相差較小，無(wú)顯著差異(P>0.05)，但均顯著高于其他配方引起的選擇反應(yīng)率(P<0.05)。故通過(guò)趨性行為反應(yīng)測(cè)定篩選出的配方為9I, 10J和11K共3種，即順-3-己烯基乙酸酯+順-9-十八烯乙酸酯，1-己醇+順-9-十八烯乙酸酯和鄰苯二甲酸二丁酯+甘氨酸甲酯。

2.5 3種二元引誘劑配方及其單一組分對(duì)華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)引誘作用的比較

對(duì)趨性行為反應(yīng)測(cè)定試驗(yàn)進(jìn)一步篩選出的3種二元引誘劑配方進(jìn)行的配方與其單一組分引誘效果比較結(jié)果如圖3所示，配方9I與順-3-己烯基乙酸酯引誘的試蟲(chóng)數(shù)量分別為95頭和66頭，二者差異顯著(P<0.05)；而配方9I與順-9-十八烯乙酸酯引誘的試蟲(chóng)數(shù)量分別為96頭和71頭，兩者差異不顯著(P>0.05)。配方10J與1-己醇引誘的試蟲(chóng)數(shù)量分別為98頭和62頭，二者差異極顯著(P<0.01)；配方10J與順-9-十八烯乙酸酯引誘的試蟲(chóng)數(shù)量分別為103和61頭，二者也呈極顯著性差異(P<0.01)。配方11K與鄰苯二甲酸二丁酯引誘的試蟲(chóng)數(shù)量分別為94和69頭，二者差異顯著(P<0.05)；而配方11K與甘氨酸甲酯引誘的試蟲(chóng)數(shù)量分別為103和65頭，二者差異極顯著(P<0.01)。

圖1 華北大黑鰓金龜雌(A)雄(B)成蟲(chóng)對(duì)不同的二元引誘劑配方的觸角電位(EAG)反應(yīng)Fig. 1 Electro-antennogram (EAG) response of female (A) and male (B) adults of Holotrichia oblitato different binary attractant formulations配方編號(hào)同表2。The formulation no. is the same as in Table 2. 下同The same below.

圖2 華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)對(duì)不同二元引誘劑配方的趨性行為反應(yīng)Fig. 2 Taxis of Holotrichia oblita adults to different binary attractant formulations星號(hào)和雙星號(hào)分別表示處理與對(duì)照(石蠟油)間或配方與單一組分間經(jīng)卡方檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。The asterisk and double asterisk indicate significant differences (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01) between treatment and the control (paraffine oil) or between formulation and single component, respectively by Chi-square test. 圖3和4同。The same for Figs. 3 and 4.

表3 華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)對(duì)6種二元引誘劑配方的趨性行為反應(yīng)Table 3 Taxis of Holotrichia oblita adults to 6 binaryattractant formulations

可見(jiàn)，配方9I對(duì)單一組分順-3-己烯基乙酸酯有顯著的增效作用，而對(duì)順-9-十八烯乙酸酯增效作用不明顯；配方10J對(duì)單一組分1-己醇及順-9-十八烯乙酸酯均可表現(xiàn)出極顯著的增效作用；配方11K對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯具有顯著的增效作用，而對(duì)甘氨酸甲酯具有極顯著的增效作用。將這3種二元引誘劑配方進(jìn)行下一步的籠罩誘捕效果測(cè)試。

圖3 不同二元引誘劑配方與其單一組分對(duì)華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)的引誘效果Fig. 3 Attractiveness of different binary attractant formulations and their single components to Holotrichia oblita adults

2.6 3種二元引誘劑配方對(duì)對(duì)華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)的籠罩誘捕效果

二元引誘劑配方9I, 10J和11K籠罩誘蟲(chóng)結(jié)果如圖4所示，這3種配方引誘的成蟲(chóng)數(shù)分別為126, 116和115頭，而對(duì)照引誘的成蟲(chóng)數(shù)分別為45, 60和64頭，處理與對(duì)照的幼蟲(chóng)數(shù)間均差異極顯著(P<0.01)。如表4所示，華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)對(duì)3種二元引誘劑配方的反應(yīng)率均高于95%，表明試蟲(chóng)較活躍，試驗(yàn)結(jié)果可靠。配方9I引起的選擇反應(yīng)率最高，達(dá)74.06%;其次為配方10J和11K，引起的選擇反應(yīng)率分別達(dá)到65.89%和64.25%;但3種配方引起的選擇反應(yīng)率之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。此籠罩誘捕試驗(yàn)結(jié)果表明，這3種二元引誘劑配方均對(duì)華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)具有很強(qiáng)的引誘效果。

3 討論

本研究以華北大黑鰓金龜為試驗(yàn)對(duì)象，將植物揮發(fā)物、華北大黑鰓金龜聚集信息素、性信息素兩兩混配得到17種配方，通過(guò)EAG和趨性行為反應(yīng)測(cè)定逐步篩選出較好的二元引誘劑配方。再將篩選出的配方與其單一組分通過(guò)Y型嗅覺(jué)儀作引誘效果比較，最后通過(guò)籠罩誘捕檢驗(yàn)二元引誘劑配方對(duì)華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)的引誘能力。

相關(guān)研究表明，華北大黑鰓金龜求偶行為是在植物揮發(fā)物和性信息素的共同作用下進(jìn)行的。植物揮發(fā)物首先引誘同類聚集，然后再通過(guò)雌蟲(chóng)釋放的性信息素來(lái)完成交配(鄧思思等, 2011)。另有研究表明，華北大黑鰓金龜后腸的聚集信息素組分與植

圖4 不同二元引誘劑配方對(duì)華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)的籠罩誘捕效果Fig. 4 Indoor caged trapping efficacies of different binary attractant formulations on Holotrichia oblita adults

表4 華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)對(duì)3種二元引誘劑配方的趨性反應(yīng)Table 4 Taxis of Holotrichia oblita adults to3 binary attractant formulations

物揮發(fā)物混合后表現(xiàn)出顯著的增效作用(李雪等, 2018)。故在配制引誘劑配方時(shí)，若能將植物揮發(fā)物、華北大黑鰓金龜聚集信息素、性信息素間混配，則可取得更好的引誘效果。本研究挑選了5種榆樹(shù)揮發(fā)物單體、2種華北大黒鰓金龜聚集信息素單體、1種性信息素單體，在三大類化合物中進(jìn)行兩兩混配，分別有植物揮發(fā)物+聚集信息素、植物揮發(fā)物+性信息素、聚集信息素+性信息素共17種配方。不僅可以克服單一種類化合物引誘缺陷(如，性信息素只對(duì)雄蟲(chóng)起作用)，還能有效提高對(duì)華北大黑鰓金龜?shù)囊T效果。

根據(jù)姚永生(2004)從蓖麻葉二氯甲烷索氏提取物中鑒定出的主要成分，李為爭(zhēng)等(2013a)挑選了5種供試揮發(fā)物，配對(duì)后按各植物揮發(fā)物在蓖麻葉中的相對(duì)含量確定二元引誘劑配方中植物揮發(fā)物單體的混配比例。本試驗(yàn)由于化合物單體分別來(lái)自榆樹(shù)揮發(fā)物、華北大黑鰓金龜聚集信息素、性信息素，在自然含量中無(wú)統(tǒng)一參考值，故首先確定各化合物單體的最佳引誘濃度，再據(jù)此確定配制各配方時(shí)，在100 mL的總體積下各組成成分需加入的量，從而使混配后各配方中組成成分的濃度仍為其最佳引誘濃度。

EAG反應(yīng)結(jié)果表明，華北大黑鰓金龜雌雄成蟲(chóng)對(duì)17種二元引誘劑配方的電生理活性表現(xiàn)基本一致。均對(duì)配方2B(肉桂醛+順-9-十八烯醛)、6F(鄰苯二甲酸二丁酯+順-9-十八烯乙酸酯)、7G(肉桂醛+順-9-十八烯乙酸酯)、9I(順-3-己烯基乙酸酯+順-9-十八烯乙酸酯)、10J(1-己醇+順-9-十八烯乙酸酯)、11K(鄰苯二甲酸二丁酯+甘氨酸甲酯)有較好的反應(yīng)。但EAG測(cè)定只是反映嗅覺(jué)感受器對(duì)特定配方物質(zhì)反應(yīng)電壓的強(qiáng)弱(李為爭(zhēng)等, 2013b)，活性較強(qiáng)的配方具體有無(wú)引誘活性需要進(jìn)行趨性行為反應(yīng)測(cè)定(李為爭(zhēng)等, 2013b)。EAG反應(yīng)試驗(yàn)對(duì)17種二元引誘劑配方初篩后，通過(guò)趨性行為反應(yīng)進(jìn)一步篩選，結(jié)果表明，配方9I, 10J和11K引誘試蟲(chóng)數(shù)均極顯著高于對(duì)照(P<0.01)。而配方2B, 6F和7G引誘試蟲(chóng)數(shù)與對(duì)照無(wú)顯著差異。這表明，EAG測(cè)定引起電生理活性較強(qiáng)的配方引誘活性不一定強(qiáng)，這與Ryan(2002)的結(jié)論一致。故當(dāng)待測(cè)配方較多時(shí)，可首先使用EAG反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行初步的篩選，再通過(guò)趨性行為反應(yīng)檢測(cè)有無(wú)引誘作用，這樣可大大減小工作難度，提高引誘劑配方的篩選速度。

配方10J(1-己醇+順-9-十八烯乙酸酯)和11K(鄰苯二甲酸二丁酯+甘氨酸甲酯)引誘的華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)數(shù)均顯著多于其相應(yīng)的單一組分(P<0.05)，表明植物揮發(fā)物與華北大黑鰓金龜聚集信息素、性信息素混配后增效作用顯著。配方9I引誘試蟲(chóng)數(shù)顯著多于單一組分順-3-己烯基乙酸酯(P<0.05)，而對(duì)另一單一組分順-9-十八烯乙酸酯誘蟲(chóng)數(shù)差異不顯著。從引誘的試蟲(chóng)數(shù)量96頭和71頭來(lái)看，配方9I引誘試蟲(chóng)數(shù)多于順-9-十八烯乙酸酯。故將配方9I繼續(xù)進(jìn)行籠罩誘捕試驗(yàn)。

相較于Y型嗅覺(jué)儀，華北大黑鰓金龜在1 m×1 m×1 m的玻璃籠中活動(dòng)更自由，測(cè)試結(jié)果更具有說(shuō)服力，故本研究將室內(nèi)籠罩誘捕作為檢驗(yàn)配方誘蟲(chóng)活性的手段。配方9I, 10J和11K對(duì)華北大黑鰓金龜成蟲(chóng)的籠罩誘捕結(jié)果可看出，3種配方相較于對(duì)照引誘的成蟲(chóng)數(shù)均差異極顯著(P<0.01)，由此說(shuō)明，這3種配方均對(duì)華北大黑鰓金龜具有較高的引誘活性。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，金龜甲配方的引誘劑有石蠟油、無(wú)水乙醇、二氯甲烷、正己烷等(羅宗秀, 2010)，而本研究?jī)H用石蠟油作為配方溶劑，對(duì)最后篩選的配方9I, 10J和11K未進(jìn)行最適溶劑的篩選，在進(jìn)一步的試驗(yàn)中應(yīng)加強(qiáng)此方面的研究。后續(xù)開(kāi)展的試驗(yàn)還應(yīng)該進(jìn)行對(duì)此3種配方的田間應(yīng)用研究，探究配方引誘華北大黑鰓金龜?shù)哪芰σ约皩?duì)其他靶標(biāo)害蟲(chóng)的引誘效果，從而拓寬此引誘劑的應(yīng)用渠道。在田間誘捕時(shí)，應(yīng)篩選合適的誘芯載體、誘捕器的類型及其在田間設(shè)置的距離和懸掛高度等(楊捷, 2008)。從而使引誘劑發(fā)揮最大效能。另外，昆蟲(chóng)對(duì)氣味的感受機(jī)理較為復(fù)雜，不同種類化合物混配可以得到較好的引誘效果，相同種類間的化合物混配也可能有較強(qiáng)的引誘作用。在進(jìn)一步的試驗(yàn)中可從相同種類間幾種化合物的混配入手，如將幾種植物揮發(fā)物混配測(cè)試引誘效果，并與其單一組分進(jìn)行比較；也可將植物揮發(fā)物、聚集信息素、性信息素三大類混配而成三元配方，測(cè)試引誘效果并可與二元配方及單一化合物進(jìn)行引誘效果比較，探究增效作用，從而找出更為有效、廣譜的引誘劑配方。

Dickens(2006)研究表明，馬鈴薯甲蟲(chóng)Leptinotarsadecemlineata聚集信息素與植物揮發(fā)物混配后增效作用顯著；相關(guān)報(bào)道也表明，光肩星天牛Anoplophoraglabripennis聚集信息素與順-3-己烯醇等植物揮發(fā)物混配可提高其誘捕效果(Nehmeetal., 2009, 2010)。本試驗(yàn)篩選出的配方9I和10J再次證明了昆蟲(chóng)聚集信息素與植物揮發(fā)物混配可顯著提高對(duì)靶標(biāo)害蟲(chóng)的誘捕效果這一結(jié)論。性誘劑其典型特點(diǎn)為專一性和誘蟲(chóng)活性強(qiáng)，但誘蟲(chóng)種類少，僅對(duì)雄蟲(chóng)起作用是其明顯的缺陷。將性信息素與植物揮發(fā)物聯(lián)用可同時(shí)發(fā)揮性誘劑的高效性及植物揮發(fā)物的廣譜性，從而有效防治靶標(biāo)害蟲(chóng)。本研究所篩選出的配方11K也證明甘氨酸甲酯與鄰苯二甲酸二丁酯混配能夠顯著提高對(duì)華北大黑鰓金龜?shù)囊T效果。順-3-己烯基乙酸酯+順-9-十八烯乙酸酯, 1-己醇+順-9-十八烯乙酸酯和鄰苯二甲酸二丁酯+甘氨酸甲酯這3種二元引誘劑的研發(fā)為防治華北大黑鰓金龜提供了新思路和新的潛在配方，在華北大黑鰓金龜綠色防控方面具有重要意義。