三種跳蟲腸道菌群的多樣性分析及功能預測

陳 偉, 陳 霞, 李 娟, 馬欣然, 崔 薇, 渠鳳甜, 謝桂林,*, 趙紅慶,*

(1. 東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院, 哈爾濱 150036; 2. 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所, 北京 102206)

彈尾綱(Collembola)動物，俗稱跳蟲(springtails)，隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)六足總綱(Hexapoda)，是一類原生無翅而有附肢的內口式低等六足動物，其種類繁多且分布廣泛，是陸地生態(tài)中最成功的土壤動物類群之一(高艷, 2007)。跳蟲主要以土壤中腐敗的動植物殘骸、腐殖質、細菌和真菌為食(陳建秀等, 2007)。在土壤生態(tài)系統(tǒng)中它們有助于有機物的分解和養(yǎng)分流通，同時能抑制植物病蟲害，不同程度地同化化學污染物，在土壤改良、物種多樣性維護及生態(tài)毒理學監(jiān)測等方面發(fā)揮著重要的作用(Rusek, 1998)。

跳蟲腸道是一個對陸地環(huán)境微生物具有篩選性的定植場所，其形態(tài)為簡易的桿狀，分前腸、中腸和后腸。前腸和后腸的平均體積分別為0.21和0.06 nL，中腸的體積會隨攝食活動而有所改變(0.7～11.2 nL)(Thimmetal., 1998)。Buller(1909)在跳蟲消化道內發(fā)現(xiàn)真菌孢子，首次證明跳蟲腸道內有微生物存活。Visser等(1987)用麥芽提取物瓊脂平板從Onychiurussubtenuis的糞便中培養(yǎng)出擬青霉屬Paecilomyces和枝孢霉屬Cladosporium等真菌。Borkott和Insam(1990)用幾丁質瓊脂平板從白符跳Folsomiacandida的糞便中分離出能降解幾丁質的嗜麥芽黃單胞菌Xanthomonasmaltophilia和短小桿菌屬Curtobacteriumsp.。Thimm等(1998)用掃描電子顯微鏡觀察到白符跳F.candida的中腸和后腸中存在大量的細菌，并采用YT瓊脂平板分離出一種絲狀真菌薄狀枝頂孢霉菌Acremoniumcharticola, 以及植物梨火疫病菌Erwiniaamylovora, 成團泛菌Pantoeaagglomerans和頭狀葡萄球菌Staphylococcuscapitis等11種細菌。Hoffmann等(1999)研究跳蟲攝食攜帶熒光素酶標記基因的細菌后的消化情況，結果證明攝食活動能改變腸道菌群的結構(Hoffmannetal., 1999)。

近十幾年來，隨著現(xiàn)代分子生物技術的發(fā)展，跳蟲身上定植的大量微生物已被鑒定出來。其中Czarnetzki和Tebbe(2004)通過16S rDNA擴增和單鏈構象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism, SSCP)分析，揭示了8種跳蟲的菌群多樣性。Agamennone等(2015)采用16S rDNA擴增子測序分析了實驗室飼養(yǎng)的柏林白符跳F.candida與野生型贊丹F.candida的細菌菌群結構差異性。Anslan等(2016)使用高通量測序技術研究了3種跳蟲腸道及其附肢的真菌菌群隨季節(jié)的變化。在跳蟲菌群功能研究方面，Agamennone等(2018)研究了從5種跳蟲腸道內分離的46種菌株的抗菌性特點。王立秀等(2018)研究了從阿南原等跳Proisotomaananevae腸道內分離的20種菌株產(chǎn)纖維素酶的特點。Agamennone等(2019)通過宏基因組測序分析揭示了白符跳F.candida細菌菌群與抗菌活性和碳水化合物代謝相關基因的多樣性?？傮w而言，關于跳蟲腸道菌研究的報道較少，所涉及的跳蟲種類也非常有限，絕大多數(shù)跳蟲腸道菌群的多樣性是未知的，對它們的菌群功能也是了解較少。

在本研究中，我們采用16S rDNA擴增子測序法對分別采集自我國3個地區(qū)的3種跳蟲的腸道菌群進行分析，旨在揭示其腸道菌群的多樣性及相關功能，為進一步有效地從跳蟲腸道內容物中選擇性分離可培養(yǎng)菌和探索菌群的相關功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 跳蟲的采集與實驗室飼養(yǎng)

供試跳蟲分別采自生境不同的地點(表1)，同時采集原棲息地表層土壤于飼養(yǎng)盒中，使用Baker氏酵母在實驗室正常環(huán)境下飼養(yǎng)跳蟲，并選擇蟲體基于形態(tài)學特征鑒定種名。

1.2 跳蟲的饑餓處理與表面殺菌

從3種跳蟲的飼養(yǎng)盒里分別取出20頭成蟲蟲體于無菌培養(yǎng)皿中，置于室溫環(huán)境下48 h左右，以保證跳蟲體內的腸道菌群達到相對穩(wěn)定的水平。將饑餓處理后的跳蟲轉移到4℃冰箱中，低溫使其處于昏迷狀態(tài)。在生物安全柜中用無菌水浸濕的小毛筆從培養(yǎng)皿中取出1頭跳蟲放在干凈的載玻片上，將其首尾部位固定后，用小毛筆蘸取無菌水輕輕擦拭跳蟲體表，以去除土粒和植物碎屑等。接著用75%的乙醇輕輕擦拭跳蟲體表30 s，重復操作3～4次后，用無菌干濾紙吸去體表殘留的乙醇。最后再用無菌水輕輕擦拭跳蟲體表進一步去除殘留的乙醇。

表1 3種跳蟲的采集信息Table 1 Collecting data of three springtail species

1.3 跳蟲的解剖與腸道內容物的收集

跳蟲經(jīng)過饑餓處理和表面殺菌后，使用鑷子和微針刀在基恩士數(shù)碼顯微系統(tǒng)下對其胸、腹部進行解剖，并將跳蟲腸道轉移到無菌的干濾紙條上。同一濾紙條上連續(xù)收集20頭同種跳蟲的腸道及內容物后，將濾紙條轉移到無菌離心管中，置于-40℃下保存、待用。

1.4 跳蟲腸道菌群的16S rDNA擴增子測序

采用CTAB法提取3種跳蟲腸道菌群的基因組DNA(Moranetal., 1993; 徐麗華等, 2007)，測定DNA濃度并用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，針對16S rDNA V3-V4區(qū)，用帶Barcode的特異性引物(341F: 5′-CCTAYGGGRBGCASCAG; 806R: 5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)，Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶(New England Biolabs公司)進行PCR。反應體系(50 μL): 2×Taq PCR Mix 25 μL, 引物341F/806R(10 μmol/L)各1 μL, DNA模板 2 μL, ddH2O 21 μL。反應條件: 95℃預變性5 min; 94℃變性1 min, 57℃退火45 s, 72℃延伸1 min, 共34個循環(huán)；最終72℃延伸10 min。PCR完成后，擴增產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，使用GeneJET 膠回收試劑盒(Thermo Scientific公司)剪切回收目標條帶。PCR產(chǎn)物由北京諾禾致源科技股份有限公司在Ion S5TMXL平臺上進行高通量測序。

1.5 生物信息學分析

IonS5TMXL下機數(shù)據(jù)首先使用Cutadapt對reads進行低質量部分過濾，再根據(jù)Barcode序列區(qū)分各樣本數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列初步質控后獲得原始數(shù)據(jù)(raw reads)。接著通過與物種注釋數(shù)據(jù)庫比對并去除嵌合體序列，從而獲得有效數(shù)據(jù)(clean reads)(Martin, 2011)。 利用Uparse軟件對有效數(shù)據(jù)按97%的序列一致性進行操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)聚類分析(Rognesetal., 2016)。使用Mothur方法與SILVA132的SSU rRNA數(shù)據(jù)庫對OTU序列進行物種注釋(設定閾值為0.8～1)，并分別在各分類層級上進行物種類群統(tǒng)計(Haasetal., 2011)。使用MUSCLE(v 3.8.31)軟件進行快速多序列比對，獲得所有OTU序列的系統(tǒng)發(fā)生關系(Wangetal., 2007)?；诰换腛TU豐度信息，使用QIIME(v 1.9.1)和R軟件(v 2.15.3)進行α和β多樣性分析。將OTU代表序列通過Tax4Fun包比對到KEGG數(shù)據(jù)庫(Asshaueretal., 2015)，進而實現(xiàn)對菌群基因功能的預測。

2 結果

2.1 菌群測序質量與OTUs分布

3種跳蟲腸道菌群測序的原始數(shù)據(jù)(raw reads)經(jīng)進一步預處理后，從而獲得最終的有效數(shù)據(jù)(clean reads)，具體的數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計及質控信息見表2。我們發(fā)現(xiàn)有效數(shù)據(jù)中堿基質量值大于20(測序錯誤率小于1%)的堿基比例均大于80%，且有效數(shù)據(jù)比例都超過85%，說明測序數(shù)據(jù)質量滿足后續(xù)分析的要求。為了檢驗測序量是否足夠，我們對測序數(shù)據(jù)進行了抽平處理，繪制出樣本稀釋曲線(圖1: A)。結果發(fā)現(xiàn)隨著測序深度的增加樣本稀釋曲線逐漸趨向于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量基本覆蓋到樣本中的所有物種，更多的測序數(shù)據(jù)量對發(fā)現(xiàn)新OTU作用很小。從S. (C.)oligoseta,P.minuta和T.missus3種跳蟲腸道菌群測序數(shù)據(jù)中我們分別獲得了445， 621和632個OTUs。為了比較彼此之間OTUs的差異，利用R軟件繪制出Venn圖。由圖1(B)可知，3種跳蟲中共有的OTUs為141個，分別占S. (C.)oligoseta總OTUs的31.69%，占P.minuta總OTUs的22.71%，占T.missus總OTUs的22.31%。

表2 3種跳蟲腸道菌群測序數(shù)據(jù)預處理統(tǒng)計及質控信息Table 2 Statistics and quality control information of sequencing data preprocessedfor gut microbiota of three springtail species

Q20: 堿基質量分值大于20的reads的比例The proportion of reads with a base quality score greater than twenty.

圖1 3種跳蟲成蟲腸道菌群OTUs稀釋曲線(A)及Venn圖(B)Fig. 1 Rarefaction curves (A) and Venn diagram (B) of the adult gut microbial OTUs in three springtail species

2.2 菌群α和β多樣性分析

3種跳蟲腸道菌群α多樣性指數(shù)的統(tǒng)計(默認97%閾值)見表3。S. (C.)oligoseta腸道菌群的測定物種指數(shù)(445), Chao1指數(shù)(457.000)和ACE指數(shù)(456.495)最小，表明它的菌群豐富度最低。T.missus腸道菌群的香農(nóng)指數(shù)(8.228)最大且辛普森指數(shù)(0.925)最小，表明它的菌群多樣性最高。另外，S. (C.)oligoseta腸道菌群的譜系多樣性指數(shù)(86.021)高于其他兩種跳蟲的相應指數(shù)，表明這種跳蟲的腸道菌群對進化歷史保存的差異最大，即菌群間親緣關系最復雜，進化距離最遠。

基于衡量β多樣性指數(shù)的unifrac距離，我們檢測了3種跳蟲腸道菌群兩兩之間的相異系數(shù)(圖2)，結果發(fā)現(xiàn)T.missus和S. (C.)oligoseta腸道菌群存在的差異性較大，它們之間的weighted unifrac和unweighted unifrac距離分別為0.519和0.781。對3種跳蟲腸道菌群的主成分分析(principal component analysis, PCA)和主坐標分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)(圖3: A, B)，結果發(fā)現(xiàn)彼此之間的距離都比較遠，表明它們的腸道菌群差異較大。為了更好地反映生態(tài)學數(shù)據(jù)的非線性結構，我們基于Bray-Curtis距離對測序數(shù)據(jù)執(zhí)行無度量多維標定(non-metric multi-dimensional scaling, NMDS)分析。如圖3(C)所示，Stress值小于0.001說明本次分析能準確反映3種跳蟲腸道菌群的特點，且彼此之間的距離也比較遠，這再次表明它們的腸道菌群存在較大的差異性。

表3 3種跳蟲腸道菌群α多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity indices of gut microbiota of three springtail species

圖2 3種跳蟲腸道菌群的β多樣性指數(shù)熱圖Fig. 2 Heatmap of beta diversity indices of gut microbiota of three springtail species圖中方格中的數(shù)字是兩兩樣本之間的相異系數(shù)，同一方格中上下兩個值分別代表weighted unifrac和unweighted unifrac距離。The number in the square is dissimilarity coefficient between two samples. The two values on the top to bottom in the same square are weighted unifrac and unweighted unifrac distances, respectively.

圖3 3種跳蟲腸道菌群的主成分分析(PCA)(A)、主坐標分析(PCoA)(B)和無度量多維標定(NMDS)分析(C)Fig. 3 Principal component analysis (PCA) (A), principal co-ordinates analysis (PCoA) (B) and non-metricmulti-dimensional scaling (NMDS) analysis (C) for gut microbiota of three springtail speciesPC1: 第1主成分Principal component 1; PC2: 第2主成分Principal component 2; PCo1: 第1主坐標Principal coordinate 1; PCo2: 第2主坐標Principal coordinate 2; MDS1: 第1排序軸Dimensional scaling axis 1; MDS2: 第2排序軸Dimensional scaling axis 2.

圖4 3種跳蟲腸道菌群在門水平上相對豐度前10的微生物類群Fig. 4 Relative abundance of top ten predominant microbiota at the phylum level in gut microbiota of three springtail species

2.3 菌群OTUs物種注釋及相對豐度

對3種跳蟲腸道菌群測序的OTUs進行物種注釋(圖4)。在門水平上S. (C.)oligoseta的腸道菌群主要屬于變形菌門(Proteobacteria, 43.63%)，厚壁菌門(Firmicutes，23.93%)，擬桿菌門(Bacteroidetes, 22.63%)，放線菌門(Actinobacteria, 2.64%)，梭桿菌門(Fusobacteria, 1.33%)，藍藻門(Cyanobacteria, 1.3%)，酸桿菌門(Acidobacteria, 0.8%)，疣微菌門(Verrucomicrobia, 0.8%)，芽孢菌門(Gemmatimonadetes, 0.58%)，綠彎菌門(Chloroflexi, 0.08%)等19個門；P.minuta的腸道菌群主要屬于變形菌門(Proteobacteria, 50.5%)，厚壁菌門(Firmicutes, 20.21%)，擬桿菌門(Bacteroidetes, 11.75%)，放線菌門(Actinobacteria, 8.7%)，梭桿菌門(Fusobacteria, 4.01%)，疣微菌門(Verrucomicrobia, 0.96%)，藍藻門(Cyanobacteria, 0.95%)，酸桿菌門(Acidobacteria, 0.48%)，綠彎菌門(Chloroflexi, 0.34%)，芽孢菌門(Gemmatimonadetes，0.11%)等21個門；T.missus的腸道菌群主要屬于變形菌門(Proteobacteria, 49.23%)，擬桿菌門(Bacteroidetes, 13.19%)，厚壁菌門(Firmicutes, 12.65%)，放線菌門(Actinobacteria, 3.05%)，酸桿菌門(Acidobacteria, 3.6%)，疣微菌門(Verrucomicrobia, 1.72%)，綠彎菌門(Chloroflexi, 2.19%)，芽孢菌門(Gemmatimonadetes, 1.52%)，藍藻門(Cyanobacteria, 0.96%)，梭桿菌門(Fusobacteria, 0.55%)等29個門。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)3種跳蟲腸道菌群中變形菌門為最主要的類群，其次為厚壁菌門、擬桿菌門。另外，3種跳蟲腸道菌群中都明顯存在一定數(shù)量的放線菌。

圖5 3種跳蟲腸道菌群在屬水平上相對豐度前30的微生物類群Fig. 5 Relative abundance of top thirty predominant microbiota at the genus level in gut microbiota of three springtail species

為了進一步比較3種跳蟲腸道內優(yōu)勢菌屬的差異，選取屬水平豐度排名前30的類群生成堆積柱狀圖(圖5)。我們發(fā)現(xiàn)它們的優(yōu)勢菌屬包括假單胞菌屬Pseudomonas, 節(jié)桿菌屬Arthrobacter, 擬桿菌屬Bacteroides, 寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas, 弧菌屬Vibrio, 雙歧桿菌屬Bifidobacterium, 多核菌屬Polynucleobacter, 未鑒定毛螺菌科(unidentified Lachnospiraceae), 鯨桿菌屬Cetobacterium, 不動桿菌屬Acinetobacter, 芽孢桿菌屬Bacillus, 鞘脂單胞菌屬Sphingomonas, 蒼白桿菌屬Ochrobactrum, 微桿菌屬Microbacterium, 纖維菌屬Cellulosimicrobium等。其中，在S. (C.)oligoseta腸道中假單胞菌屬Pseudomonas的豐度(16.21%)明顯高于在P.minuta和T.missus腸道中的豐度(分別為0.87%和1.37%)；在P.minuta腸道中弧菌屬Vibrio的豐度(25.81%)明顯高于在S. (C.)oligoseta和T.missus腸道中的豐度(分別為3.35%和0.004%)。值得注意的是在3種跳蟲腸道中都檢測到了一定豐度的氣單胞菌屬Aeromonas。

2.4 優(yōu)勢菌屬物種豐度聚類分析

根據(jù)相對豐度前35菌屬的物種注釋及豐度信息繪制出聚類熱圖(圖6)，3種跳蟲腸道中相對豐度前35的菌屬在進化系統(tǒng)發(fā)生上聚集為3大類。在水平方向上每種菌屬在3種跳蟲體內的豐度明顯不同，整體上可以發(fā)現(xiàn)3種跳蟲腸道菌群的優(yōu)勢菌屬是不同的。

2.5 菌群基因功能預測

對3種跳蟲腸道菌群測序數(shù)據(jù)用Tax4Fun法進行菌群基因功能預測，實現(xiàn)了SILVA數(shù)據(jù)庫注釋的OTU物種分類與KEGG數(shù)據(jù)庫中原核生物代謝功能的有效鏈接。在Level 1水平上，3種跳蟲腸道菌群中KEGG pathway注釋到代謝相關的基因豐度分別為44.34%, 44.89%和45.98%；與人類疾病相關的基因豐度分別為6.42%, 6.60%和6.76%。在Level 2水平上，3種跳蟲腸道菌群基因與11類代謝過程相關(圖7: A)，其中涉及碳水化合物代謝的基因豐度最高，其次是涉及氨基酸代謝的基因。同時還發(fā)現(xiàn)菌群基因與8類疾病相關，其中涉及傳染性疾病和耐藥性的基因豐度明顯高于其他功能基因的豐度(圖7: B)。在Level 3水平上，3種跳蟲腸道菌群中與代謝相關的豐度前20的基因其中涉及淀粉和蔗糖代謝、糖酵解/糖異生以及氨基糖和核苷酸糖代謝的基因在S. (C.)oligoseta腸道菌群中的豐度偏高。而涉及氨基酸相關酶等菌群基因在3種跳蟲腸道內的豐度差別不明顯(表4)。同時還關注了與人類疾病相關的菌群基因豐度前35的注釋結果(表5)，其中與β內酰胺抗藥性、抗菌素耐藥性和金黃色葡萄球菌感染相關的基因豐度在S. (C.)oligoseta腸道菌群中相對偏高；與胰島素抗藥性、幽門螺桿菌感染的上皮細胞信號傳導和I型糖尿病相關的基因豐度在P.minuta腸道菌群中相對偏高；與軍團病、亨廷頓氏病和非酒精性脂肪性肝病相關的基因豐度在T.missus腸道菌群中相對偏高。

圖6 3種跳蟲腸道菌群在屬水平上相對豐度前35類群的聚類熱圖Fig. 6 Heatmap of top thirty-five predominant microbiota at the genus level in gut microbiota of three springtail species

3 討論

本研究采用16S rDNA擴增子測序法對我國3個地區(qū)的3種跳蟲的成蟲腸道菌群進行了物種組成分析,結果發(fā)現(xiàn)S. (C.)oligoseta,P.minuta和T.missus腸道中的核心菌門均為變形菌門(Proteobacteria), 厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。所以，我們認為在門水平上3種跳蟲腸道菌群存在相似性。實際上早期研究也曾報道在白符跳F.candida和P.fimiata腸道(或糞便)中發(fā)現(xiàn)了一些變形桿菌、厚壁菌(Thimmetal., 1998; Hoffmannetal., 1999)。另外，在3種跳蟲腸道中我們均檢測出了一定比例的放線菌，其中包括微桿菌屬Microbacterium, 雙歧桿菌屬Bifidobacterium, 纖維菌屬Cellulosimicrobium等。近期Agamennone等(2018)用M490培養(yǎng)基從5種跳蟲腸道內分離出鏈霉菌StreptomycesSc8, 纖維菌CellulosimicrobiumTm1, 微桿菌MicrobacteriumFc16a, 谷氨酸桿菌GlutamicibacterSc3等18種放線菌，并發(fā)現(xiàn)它們對細菌、真菌和卵菌病原體有一定的抗性。跳蟲主要棲息于表層土壤、落葉層、苔蘚等微生物為主的環(huán)境中(陳建秀等, 2007)，它們對病原微生物的耐受性可能是體內的共生放線菌通過資源競爭或產(chǎn)生針對外源微生物的抗菌劑進行有效防御的結果。此外，王立秀等(2018)采用羧甲基纖維素鈉選擇性培養(yǎng)基從阿南原等跳腸道中篩選出阿里萊坦西節(jié)桿菌Arthrobacterarilaitensis, 煙草谷氨酸桿菌Glutamicibacternicotianae, 玉米白桿菌Leucobacterzeae3種放線菌，并發(fā)現(xiàn)它們有降解纖維素的能力。從跳蟲腸道內分離放線菌不僅有益于新型放線菌的開發(fā)及其代謝產(chǎn)物的有效利用，而且有助于深入了解宿主抵御外界干擾適應復雜環(huán)境的能力。

通過本研究我們發(fā)現(xiàn)，S. (C.)oligoseta,P.minuta和T.missus3種跳蟲腸道菌群存在較大的差異，其中T.missus腸道菌群的多樣性相對最高，我們推測可能是因為該種跳蟲棲息于生長茂盛的植被根部表層土壤，其中的微生物種類豐富，在此環(huán)境中長期的攝食活動增加了它的腸道菌群多樣性。過去的研究已證明跳蟲腸道是一個微生物選擇性定植場所，攝食及食物偏好性會改變其腸道菌群結構(Hoffmannetal., 1999)。另外，Staubach等(2013)通過研究實驗室和野生環(huán)境中果蠅的細菌菌群也表明環(huán)境因素(尤其食物來源)能最大程度影響宿主相關菌群結構。然而，由于我們選用的3種跳蟲分別屬于3個不同的科，其遺傳背景差別較大，所以物種本身生理特點也會對腸道內微生物的定植產(chǎn)生一定的影響。實際上這3種跳蟲的菌群結構與近期Agamennoe等(2019)報道的白符跳F.candida菌群結構確實存在較大差異。本研究3種跳蟲腸道菌群的差異性還表現(xiàn)為在S. (C.)oligoseta腸道中假單胞菌屬Pseudomonas的豐度(16.21%)明顯高于在P.minuta和T.missus腸道中的豐度(分別為0.87%和1.37%)，我們認為可能是因為S. (C.)oligoseta長期取食于陰暗潮濕的枯枝落葉層下，其中假單胞菌屬的含量較高，而且有文獻指出假單胞菌屬與有氧環(huán)境中腐敗動植物的降解有關(陳紹興, 2005)。在P.minuta腸道中弧菌屬Vibrio的豐度(25.81%)明顯高于在S. (C.)oligoseta和T.missus腸道中的豐度(分別為3.35%和0.004%)，其原因可能是它們采集于鹽堿地水域附近的表層土壤，某些弧菌(如創(chuàng)傷弧菌)在這種環(huán)境下會發(fā)生富集作用(殷紅秋等, 2016)，而生活在該地區(qū)的跳蟲對弧菌的攝食偏好性導致了其豐度的增加?？傊?，3種跳蟲的腸道菌群結構存在差異性，不同棲息地環(huán)境與物種遺傳背景是影響其菌群多樣性的重要因素。

圖7 Level 2水平上3種跳蟲腸道菌群基因與代謝(A)及人類疾病(B)相關的KEGG pathway注釋Fig. 7 Annotations of KEGG pathway related to metabolism (A) and human diseases (B)for the gut microbial genes in three springtail species at level 2

表5 KEGG pathway注釋的Level 3水平上與人類疾病相關的3種跳蟲腸道菌群基因的相對豐度(%)Table 5 Relative abundance (%) of gut microbial genes involved in human diseasesin three springtail species at level 3 in KEGG pathway annotation

通過Tax4Fun對3種跳蟲腸道菌群基因的KEGG pathway注釋，我們發(fā)現(xiàn)它們的菌群基因功能與碳水化合物代謝和氨基酸代謝明顯相關，這與跳蟲主要攝食和消化土壤中的動植物殘骸和腐殖質等物質相對應(陳建秀等, 2007)。而且在長期生存于枯枝落葉層下的S. (C.)oligoseta腸道中涉及糖類物質代謝的菌群基因相對偏高，可能就是因為其腸道中存在大量與動植物降解有關的假單胞菌。另外，3種跳蟲腸道菌群基因功能與人類疾病相關，其中涉及傳染性疾病和耐藥性的菌群基因豐度明顯較高，這表明3種跳蟲腸道內很可能存在耐藥性和致病性(或潛在致病性)菌株。事實上我們的測序結果也檢測出了氣單胞菌屬Aeromonas、蒼白桿菌屬Ochrobactrum和弧菌屬Vibrio，相關研究已經(jīng)報道這些菌屬中存在耐藥性或致病性菌株，如嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila、人蒼白桿菌Ochrobactrumanthropi、創(chuàng)傷弧菌Vibriovulnificus等(李皇, 2008; 劉志國等, 2015; 殷紅秋等, 2016)。然而，為了進一步確定它們的腸道內是否存在耐藥性和致病性細菌，還需要選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行菌株的分離和鑒定。此外，結果還預測出3種跳蟲腸道菌群基因功能涉及內分泌與代謝疾病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等人類疾病，我們認為基于擴增子測序數(shù)據(jù)對菌群功能預測而獲得的這一發(fā)現(xiàn)的可信度較低。因為這種菌群功能預測方法本身存在一定的局限性：首先是只能對已知微生物的已知功能進行預測；其次是預測結果受參考數(shù)據(jù)庫的影響；另外原始數(shù)據(jù)預處理造成的部分數(shù)據(jù)損失也會影響預測結果(孫善峰等, 2019)。所以，在實際應用中腸道菌群基因的Tax4Fun功能預測不能取代全基因組來研究菌群功能，但是對于后續(xù)的實驗設計和研究方向還是有著一定的指導意義。

總之，本研究表明S. (C.)oligoseta,P.minuta和T.missus3種跳蟲腸道內的核心菌群為變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門，同時也存在較高豐度的放線菌。它們的差異性主要表現(xiàn)為菌群多樣性和優(yōu)勢菌屬相對豐度的不同，其影響因素包括物種自身遺傳背景的差異，以及各自棲息地環(huán)境中微生物種類和數(shù)量的不同。