花椒窄吉丁氣味結(jié)合蛋白基因AzanOBP3的克隆、原核表達(dá)及組織表達(dá)譜分析

鞏雪芳, 楊 平, 王延來(lái), 郭 莉, 陳 迪, 謝壽安, 呂淑杰

(西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院, 陜西楊凌 712100)

昆蟲(chóng)在其長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，依靠著靈敏的嗅覺(jué)系統(tǒng)來(lái)生存和適應(yīng)環(huán)境變化(王桂榮等, 2002)，在其交配、產(chǎn)卵、對(duì)寄主植物定位和選擇等行為中，嗅覺(jué)器官均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用(王超群等, 2017; 陳東凱等, 2018)。昆蟲(chóng)在其嗅覺(jué)感受信息物質(zhì)的過(guò)程中，形成了多種分布形式不一，執(zhí)行著不同功能的嗅覺(jué)相關(guān)蛋白，它們通過(guò)各自的分工與合作組成了精密復(fù)雜的嗅覺(jué)系統(tǒng)，進(jìn)而共同來(lái)調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)嗅覺(jué)和其他生理活動(dòng)(孫可可, 2018)。這些嗅覺(jué)相關(guān)蛋白主要包括氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)、氣味受體(odorant receptors, ORs)、離子型受體(ionotropic receptors, IRs)、感受神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins, SNMPs)和氣味降解酶(odorant-degrading enzymes, ODEs)等(胡穎穎等, 2013; 詹文會(huì)等, 2018)。在昆蟲(chóng)嗅覺(jué)感受的過(guò)程中，OBP 選擇性地與某些特定類型的氣味分子相結(jié)合，起到過(guò)濾器的作用(Pelosi and Maida, 1995)?；ń氛griluszanthoxylumi為鞘翅目(Coleoptera)吉丁蟲(chóng)科(Buprestidae)窄吉丁屬Agrilus，廣泛分布于我國(guó)北方的花椒產(chǎn)區(qū)，包括陜西、甘肅、山東、山西等地(黨國(guó)剛等, 2017)。幼蟲(chóng)主要是通過(guò)取食韌皮部后逐漸開(kāi)始蛀食形成層，受害部位癥狀表現(xiàn)為蟲(chóng)疤松軟濕潤(rùn)，椒農(nóng)稱之為“流油” (焦浩, 2011; 李輝, 2013)。成蟲(chóng)通過(guò)取食葉片補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，造成葉片缺刻、空洞，樹(shù)皮大量流膠、軟化、腐爛干枯、龜裂最后脫落甚至整株死亡(高煥婷和張國(guó)龍, 2007; 杜平, 2012; 王燕等, 2012)。近年來(lái)，在花椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展過(guò)程中構(gòu)成了巨大威脅，給椒農(nóng)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(權(quán)麗君, 2016)。因此，如何更有效、更環(huán)保地防治花椒窄吉丁已引起廣大椒農(nóng)和病蟲(chóng)害防治部門的高度重視。

OBP 最早發(fā)現(xiàn)于鱗翅目昆蟲(chóng)，之后在鞘翅目、膜翅目、同翅目、雙翅目等昆蟲(chóng)中也相繼被發(fā)現(xiàn)(李正西和Zhou JJ, 2004; Wangetal., 2013; 宋月芹等, 2014)。迄今為止，OBPs 已在斜紋夜蛾Spodopteralitura、亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis、綠盲蝽Apolyguslucorum、松墨天牛Monochamusalternatus、云斑天牛Batoceralineolata、椰甲截脈姬小蜂Asecodeshispinarum、白背飛虱Sogatellafurcifera、煙粉虱Bemisiatabaci、梨小食心蟲(chóng)Grapholitamolesta、大草蛉Chrysopapallens、中黑盲蝽Adelphocorissuturalis、茶尺蠖Ectropisobliqua和柑橘大實(shí)蠅Bactroceraminax(金豐良等, 2008; 程曉東等, 2011; Huangetal., 2013; 梁慶梅, 2014; Li Ketal., 2015; Li ZQetal., 2015; 錢凱等, 2015; Cuietal., 2016; 蔣艷東等, 2016; 王然等, 2016; 張國(guó)輝和仵軍祥, 2016; 卓志航等, 2016; 馮一璐等, 2017; 司品法等, 2018)等近100種昆蟲(chóng)中被報(bào)道。OBPs是一類可溶性的小分子量親和球蛋白，相對(duì)分子量約為15～17 kD，氨基酸的數(shù)量為120～160個(gè)，等電點(diǎn)為4.4～5.2(Briandetal., 2001)。N末端有一段20個(gè)氨基酸左右的信號(hào)肽，序列中具有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)(Pelosietal., 2006; Steinbrecht, 2010)；二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、LOOP環(huán)所形成的二硫鍵組成，在其三級(jí)結(jié)構(gòu)中起到了支撐作用(Vogt and Riddiford, 1981; Scalonietal., 1999; Dambergeretal., 2007; Jacquinjolyetal., 2010)。目前國(guó)內(nèi)對(duì)花椒窄吉丁的研究主要集中于化學(xué)防治和生物學(xué)特性方面(劉綏鵬等, 2016; 袁麗芳等, 2016)，國(guó)外幾乎無(wú)相關(guān)研究報(bào)道，但是化學(xué)防治方法具有難奏效、農(nóng)藥殘留、污染環(huán)境等弊端。近幾年，本實(shí)驗(yàn)室已對(duì)花椒窄吉丁的寄主植物花椒揮發(fā)物的組成進(jìn)行了鑒定(袁麗芳等, 2016)，初步獲得了對(duì)成蟲(chóng)有電生理活性和行為活性的組分(劉綏鵬, 2017)；同時(shí)也對(duì)花椒窄吉丁成蟲(chóng)后腸和糞便提取物中的揮發(fā)性物質(zhì)、成蟲(chóng)的電生理活性和行為活性做了測(cè)定(劉綏鵬等, 2016)。但是，對(duì)其氣味結(jié)合蛋白及氣味物質(zhì)與寄主揮發(fā)物的結(jié)合機(jī)理研究還處于空白。因而探究花椒窄吉丁氣味結(jié)合蛋白的理化特性與結(jié)構(gòu)對(duì)其明確功能和作用機(jī)理就顯得至關(guān)重要。

本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的花椒窄吉丁雌雄成蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析，通過(guò)BLAST同源比對(duì)的方法分析鑒定出了與花椒窄吉丁化學(xué)感受相關(guān)的氣味結(jié)合蛋白基因AzanOBP3，利用在線軟件分析預(yù)測(cè)AzanOBP3基因的理化特性和結(jié)構(gòu)，將其氨基酸序列與其他的已研究發(fā)表過(guò)的鞘翅目昆蟲(chóng)氣味結(jié)合蛋白氨基酸序列比對(duì)，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的方法，進(jìn)行親緣關(guān)系初步推斷與分析。通過(guò)RT-PCR技術(shù)首次克隆鑒定花椒窄吉丁氣味結(jié)合蛋白基因AzanOBP3，通過(guò)酶切重組的方法將擴(kuò)增產(chǎn)物插入pET-28a(+)載體構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行了表達(dá)；并采用qPCR技術(shù)分析了AzanOBP3基因在花椒窄吉丁雌雄成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)情況，期望本研究結(jié)果為今后繼續(xù)開(kāi)展其配基結(jié)合特性研究并應(yīng)用于農(nóng)林害蟲(chóng)的綠色防控技術(shù)誘芯的篩選與制備奠定基礎(chǔ)，為農(nóng)林業(yè)鞘翅目蛀干害蟲(chóng)在搜尋寄主、吸引配偶、尋找產(chǎn)卵場(chǎng)所等行為活動(dòng)領(lǐng)域的研究提供重要的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)的采集與樣品收集

2018年5-7月于陜西省西安市藍(lán)田縣普化鎮(zhèn)周董村的花椒園采集花椒窄吉丁成蟲(chóng)。提取 RNA 前選取 1 000頭活動(dòng)能力較強(qiáng)的成蟲(chóng)，解剖鏡下分別切下雌雄成蟲(chóng)觸角，液氮冷凍并保存于-80℃低溫冰箱中備用。

1.2 總RNA的提取與cDNA第1鏈的合成

采用Trizol法(Trizol, Invitrogen)提取花椒窄吉丁成蟲(chóng)觸角以及雌雄成蟲(chóng)頭、胸、腹、足和翅總RNA，具體步驟依據(jù)Invitrogen說(shuō)明書(shū)進(jìn)行?？俁NA的質(zhì)量1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；根據(jù)NanaDrop2000紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品的完整性和濃度。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)合成cDNA第1鏈備用。

1.3 花椒窄吉丁氣味結(jié)合蛋白基因AzanOBP3的克隆

以1.2節(jié)中合成的花椒窄吉丁雌雄成蟲(chóng)觸角cDNA作為模板，根據(jù)花椒窄吉丁成蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序注釋到的候選OBP3基因設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物(表1)，進(jìn)行目的基因PCR克隆。PCR反應(yīng)體系: cDNA模板<1 μg, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, 2×Reaction Mix 12.5 μL, ddH2O補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增程序: 94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min, 30個(gè)循環(huán); 72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收的目的片段連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，最后將鑒定的陽(yáng)性克隆菌株送北京奧科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用引物Table 1 Primers used in the experiment

下劃線序列分別表示內(nèi)切酶BamHⅠ (GGATCC) 和XhoⅠ (CTCGAG) 酶切位點(diǎn)。雌成蟲(chóng)內(nèi)參基因用Actin，雄成蟲(chóng)內(nèi)參基因用28S-2。Restriction sites ofBamHⅠ (GGATCC) andXhoⅠ (CTCGAG) are underlined, respectively. The reference gene used for female adult isActinand for male is28S-2.

1.4 生物信息學(xué)分析

利用在線程序Expasy 對(duì)目的基因序列進(jìn)行翻譯(http: ∥expasy.org/translate/)，預(yù)測(cè)其蛋白分子量、等電點(diǎn)及其他的理化特性(http:∥expasy.org/protparam/)；Open Reading Frame Finder (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)預(yù)測(cè)其開(kāi)放閱讀框；SignalP 4.1 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 預(yù)測(cè)其信號(hào)肽，通過(guò)NCBI中的BLAST進(jìn)行氨基酸序列的同源比對(duì)。在花椒窄吉丁AzanOBP3與其他昆蟲(chóng) OBPs 的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建中，先采用 Clustalx1.83 進(jìn)行多序列比對(duì)，然后利用MEGA5.0 軟件并采用最大似然法(maximum likelihood, ML) (Bootstrap:1 000次)來(lái)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

1.5 構(gòu)建原核表達(dá)載體及IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)

根據(jù)花椒窄吉丁OBP3的編碼序列及表達(dá)載體pET-28a(+)設(shè)計(jì)帶有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的引物序列(表1)。以雌雄成蟲(chóng)觸角cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Golden Easy PCR System)。PCR反應(yīng)體系(25 μL): cDNA模板<1 μg, 正反向引物(10 μmol/L) 各1 μL, 2×Reaction Mix 12.5 μL, ddH2O補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增程序: 94℃預(yù)變性3 min; 94℃變性30 s， 55℃退火30 s, 72℃延伸1 min， 30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。將擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收(QIA QuickR Gel Extraction Kit, QIAGEN)后連接到pMD18-T克隆載體(TaKaRa, Clontech)中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后挑取陽(yáng)性菌落振蕩培養(yǎng)12～16 h (37℃, 220 r/min)，提取質(zhì)粒[Plasmid Mini Kit I (OMEGA)試劑盒] DNA并測(cè)序驗(yàn)證(北京奧科生物有限公司測(cè)序)。 將含有目的片段的重組克隆質(zhì)粒DNA和pET-28a(+)質(zhì)粒DNA分別進(jìn)行酶切，在T4 DNA連接酶的作用下將目的片段連接到表達(dá)載體pET-28a(+)上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用含有卡那霉素(Kan)的LB平板培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，小量提取質(zhì)粒后測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pET-28a/AzanOBP3轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂板培養(yǎng)后挑取單菌落于LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)(37℃ 220 r/min, 12～16 h)，將小量培養(yǎng)后的菌液按1∶100(v/v)的比例接種于新鮮的LB培養(yǎng)液(含Kan 50 μg/mL)中，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8時(shí)，加入終濃度1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，然后離心收集菌體，將菌體重新懸浮后超聲波破碎，12 000 r/min離心30 min，收集上清和沉淀，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況。

1.6 融合蛋白的Western blot檢測(cè)

將PVDF膜和濾紙分別裁剪成與凝膠相同的大小，使用轉(zhuǎn)膜緩沖液處理后，按照濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙的順序依次放在轉(zhuǎn)膜儀的電極板之間，開(kāi)始轉(zhuǎn)膜。設(shè)置轉(zhuǎn)膜儀參數(shù)：電流(62 mA)、轉(zhuǎn)印時(shí)間(80 min)，將PVDF膜置于含1.5% BSA的10 mL Blocking Buffer中，4℃平放過(guò)夜封閉。使用稀釋后的Penta-His Antibody溶液6 mL，進(jìn)行一次抗體反應(yīng)1 h。TBST緩沖液(20 mL)洗滌2次；洗滌TBST緩沖液漂洗 3次，每次5 min。使用稀釋后的HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG抗體溶液6 mL，進(jìn)行二次抗體反應(yīng)1 h。TBST緩沖液(20 mL)洗滌 2次；洗滌TBST緩沖液沖洗3次。滴1 mL TrueBlue Peroxidase Substrate顯色1 min；10 mL Western BrightTMECL顯色5 min，在暗室中進(jìn)行曝光顯色反應(yīng)。

1.7 qPCR檢測(cè)AzanOBP3基因在花椒窄吉丁雌雄成蟲(chóng)各組織中的表達(dá)譜

根據(jù)花椒窄吉丁氣味結(jié)合蛋白編碼基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)qPCR引物(表1)，研究AzanOBP3基因在不同組織部位中的表達(dá)情況，雌成蟲(chóng)內(nèi)參基因用Actin，雄成蟲(chóng)內(nèi)參基因用28S-2，qPCR所用的引物序列見(jiàn)表1。以1.2節(jié)合成的花椒窄吉丁雌雄成蟲(chóng)不同組織的cDNA第1鏈為模板，PCR反應(yīng)體系(20 μL): 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL, cDNA模板1.0 μL, 補(bǔ)充ddH2O到20 μL混勻(試劑盒為Vazyme ChamQTMSYBR?qPCR Master MixQ311-02/03)。擴(kuò)增程序: 95℃預(yù)變性10 min; 95℃變性10 s, 95℃30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共40個(gè)循環(huán)，之后從65～95℃之間進(jìn)行熔解曲線分析以排除非特異性PCR產(chǎn)物的污染，每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀相應(yīng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，EXCEL整理數(shù)據(jù)。相對(duì)定量采用2-△△Ct法計(jì)算OBP3在不同組織的相對(duì)表達(dá)量，采用Duncan氏多重比較檢驗(yàn)法比較分析花椒窄吉丁成蟲(chóng)不同組織中目的基因表達(dá)量的差異顯著性，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)(independent samplest-test)檢測(cè)雌雄成蟲(chóng)同一組織中的基因表達(dá)量的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 花椒窄吉丁AzanOBP3基因的克隆和序列分析

PCR同源克隆獲得了花椒窄吉丁氣味結(jié)合蛋白編碼基因片段大小符合預(yù)期結(jié)果。AzanOBP3基因cDNA全長(zhǎng)614 bp(GenBank登錄號(hào): MT318832)，上游有起始密碼子ATG，下游有終止密碼子TGA，包括一個(gè)414 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼137個(gè)氨基酸殘基，其5′和3′端分別有35 bp和142 bp的非編碼區(qū)。在線預(yù)測(cè)到成熟蛋白分子量為16.038 kD，理論等電點(diǎn)為4.79，而且該蛋白氨基酸序列中具有6個(gè)保守半胱氨酸(C1, C2, C3, C4, C5和C6)(圖1)，符合典型氣味結(jié)合蛋白家族特征。

圖1 花椒窄吉丁AzanOBP3核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of AzanOBP3 fromAgrilus zanthoxylumi保守位點(diǎn)上的半胱氨酸用紅色方框表示，信號(hào)肽用單下劃線表示。The conserved cysteines are indicated in red box, and the predicted signal peptide is underlined.

花椒窄吉丁AzanOBP3 N端前29位氨基酸為信號(hào)肽，在第29和30位氨基酸之間存在一個(gè)信號(hào)肽切割位點(diǎn)，該特征符合分泌蛋白特征。AzanOBP3有多個(gè)比較明顯的疏水區(qū)，可能是親脂性的氣味分子的結(jié)合位點(diǎn)，該蛋白上有較少的區(qū)域能夠結(jié)合脂類氣味分子，有親脂性的氨基酸即可能與疏水性的氣味物質(zhì)結(jié)合，又有可能與親水性的物質(zhì)結(jié)合，有較多數(shù)量的親水性氨基酸，暗示該蛋白可能是一種能夠與水親和的球蛋白。AzanOBP3第1-137位氨基酸均位于細(xì)胞膜表面，預(yù)測(cè)蛋白AzanOBP3不包含跨膜螺旋，這與該蛋白的疏水性區(qū)域分析結(jié)果基本一致，表明AzanOBP3具一個(gè)有細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)功能的膜受體蛋白。通過(guò)SOPMA工具預(yù)測(cè)到花椒窄吉丁AzanOBP3的二級(jí)結(jié)構(gòu)是由56.93%的α-螺旋、7.3%的延伸鏈、3.65%的 β-轉(zhuǎn)角和32.12%的無(wú)規(guī)則卷曲組成。

2.2 花椒窄吉丁AzanOBP3序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析

將AzanOBP3的氨基酸序列與已報(bào)道的鞘翅目其他幾種昆蟲(chóng)的OBPs進(jìn)行多重聯(lián)配(圖2)，發(fā)現(xiàn)每種昆蟲(chóng)OBP氨基酸序列中均有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，且分布符合C1-X20-66-C2-X3-C3-X21-43-C4-X8-14-C5-X8-C6和C1-X15-39-C2-X3-C3-X21-44-C4-X7-42-C5-X8-C6(X為除半胱氨酸以外的其他氨基酸)的典型特征。通過(guò)對(duì)AzanOBP3序列同源性搜索(BLASTX)發(fā)現(xiàn)，AzanOBP3與蘋果小吉丁Agrilusmail和白蠟窄吉丁AgrilusplanipennisOBP的氨基酸序列一致性最高，分別達(dá)74.45%和76.92%，表明它們之間在進(jìn)化關(guān)系上更加同源，與已知其他昆蟲(chóng)的OBPs的氨基酸序列一致性較低，均小于50%。

圖2 AzanOBP3與其他昆蟲(chóng)OBPs氨基酸序列比對(duì)Fig. 2 Alignment of amino acid sequence of AzanOBP3 with OBPs from other insectsOBPs來(lái)源物種及GenBank登錄號(hào)Source species of OBPs and their GenBank accession numbers: AzanOBP3: 花椒窄吉丁Agrilus zanthoxylumi(MT318832); AmalOBP2: 蘋果小吉丁Agrilus mail (MF615491.1); AplaGOBP: 白蠟窄吉丁Agrilus planipennis (XP_025829930.1); DhelOBP13: 花絨寄甲Dastarcus helophoroides (AIX97059.1); DarmOBP2: 華山松大小蠹Dendroctonus armandi (AIY61045.1); DponOBP: 中歐山松大小蠹Dendroctonus ponderosae (AFI45061.1); DponOBP3: 中歐山松大小蠹Dendroctonus ponderosae (AKK25131.1); PaenOBP15: 榆藍(lán)螢葉甲Pyrrhalta aenescens (APC94288.1); PmacOBP15: 榆黃毛螢葉甲Pyrrhalta maculicollis (APC94206.1); CbowOBP17: 大猿葉甲Colaphellus bowringi (ALR72505.1); TcasOBP25: 赤擬谷盜Tribolium castaneum (EFA04747.2); TmolOBP2: 黃粉蟲(chóng)Tenebrio molitor (AJM71476.1); AchiOBP: 星天牛Anoplophora chinensis (AUF72991.1); AglaGOBP: 光肩星天牛Anoplophora glabripennis (XP_023310142.1). 圖3同The same for Fig. 3. 紅色星號(hào)表示保守位點(diǎn)上的半胱氨酸。綠色區(qū)域表示包含普通氣味結(jié)合蛋白在內(nèi)的所有氣味結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)中的相同保守結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)。紫色表示所有氣味結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)中相同的氨基酸。Conserved cysteines are indicated with the red asterisk. The green region represents the same conserved domain site in all odorant binding protein structures including the common odorant binding protein. Purple region indicates the same amino acid in all odorant binding protein structures.

花椒窄吉丁氣味結(jié)合蛋白AzanOBP3的氨基酸序列與已報(bào)道的鞘翅目其他昆蟲(chóng)如蘋果小吉丁Agrilusmail的AmaiOBP2, 白蠟窄吉丁Agrilusplanipennis的AplaGOBP, 花絨寄甲Dastarcushelophoroides的DhelOBP13, 華山松大小蠹Dendroctonusarmandi的DarmOBP2, 中歐山松大小蠹Dendroctonusponderosae的 DponOBP3, 榆藍(lán)螢葉甲Pyrrhaltaaenescens的PaenOBP15, 榆黃毛螢葉甲Pyrrhaltamaculicollis的PmacOBP15, 大猿葉甲Colaphellusbowringi的CbowOBP17, 星天牛Anoplophorachinensis的AchiOBP, 光肩星天牛Anoplophoraglabripennis的AglaGOBP, 模式昆蟲(chóng)赤擬谷盜Triboliumcastaneum的TcasOBP25和黃粉蟲(chóng)Tenebriomolitor的TmolOBP2的氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn)，AzanOBP3與蘋果小吉丁的AmalOBP2和白蠟窄吉丁的AplaGOBP相似度最高，氨基酸序列一致性達(dá)到了100%，這說(shuō)明氣味結(jié)合蛋白在這幾種昆蟲(chóng)間的親緣關(guān)系較近(圖3)。

圖3 基于花椒窄吉丁AzanOBP3和其他昆蟲(chóng)OBP蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析(最大似然法)Fig. 3 Phylogenetic tree of AzanOBP3 from Agrilus zanthoxylumi and OBPs from other insectsbased on the amino acid sequences (maximum likelihood method)

2.3 AzanOBP3的原核表達(dá)及Western blot檢測(cè)

成功構(gòu)建了pET-28a(+)/AzanOBP3原核表達(dá)載體，37℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)至OD600值約為 0.6 時(shí)添加 150 mmol/L IPTG 33 μL(終濃度為 1 mmol/L IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，37℃培養(yǎng)4 h。取變性后的樣品10 μL 進(jìn)行上樣，SDS-PAGE結(jié)果如圖4(A)所示，在大腸桿菌中成功地表達(dá)出了與預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量大小一致的AzanOBP3融合蛋白。通過(guò)對(duì)重組蛋白純化后樣品進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示在樣品相應(yīng)位置有明顯信號(hào)，且檢測(cè)到His-Tag標(biāo)簽蛋白，顯色后的PVDF膜如圖所示(4: B)。

圖4 重組蛋白AzanOBP3的SDS-PAGE檢測(cè)(A)和Western blot(B)分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis (A) and Western blotting (B) of recombinant protein AzanOBP3M1, M2: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker (Broad); 1: IPTG誘導(dǎo)前全蛋白Whole protein before IPTG induction; 2: IPTG誘導(dǎo)前上清Supernatant before IPTG induction; 3: IPTG誘導(dǎo)前沉淀Precipitate before IPTG induction; 4: 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的全蛋白Whole protein after induction with IPTG; 5: 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的上清Supernatant after induction with IPTG; 6: 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的沉淀Precipitate after induction with IPTG; 7: IPTG誘導(dǎo)前全蛋白Whole protein before IPTG induction; 8: IPTG誘導(dǎo)前上清Supernatant before IPTG induction; 9: IPTG誘導(dǎo)前沉淀Precipitate before IPTG induction; 10: IPTG誘導(dǎo)后的全蛋白Whole protein after induction with IPTG; 11: IPTG誘導(dǎo)后的上清Supernatant after induction with IPTG; 12: IPTG誘導(dǎo)后的沉淀Precipitate after induction with IPTG.

2.4 AzanOBP3在花椒窄吉丁成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)量

根據(jù)2-△△Ct相對(duì)定量法，以雄成蟲(chóng)足中的表達(dá)量為基準(zhǔn)，測(cè)定AzanOBP3在花椒窄吉丁成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)譜。結(jié)果表明(圖5)，AzanOBP3在雌雄蟲(chóng)頭、胸部、腹部、足、翅中均有表達(dá)，且表達(dá)量不一，在雄成蟲(chóng)各組織的表達(dá)量為：足>胸部>頭部>翅>腹部；在雌成蟲(chóng)不同組織中表達(dá)量為：頭>腹部>足>翅>胸部。AzanOBP3在雌雄成蟲(chóng)間各組織(除足部)中的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，僅在足中雄成蟲(chóng)的表達(dá)量顯著高于雌成蟲(chóng)(P=0.0227);但除腹部以外，雄成蟲(chóng)各組織中的表達(dá)量均較雌蟲(chóng)的要高些。

圖5 AzanOBP3在花椒窄吉丁成蟲(chóng)各組織中的表達(dá)量分析Fig. 5 Expression profile of AzanOBP3 in various tissues of Agrilus zanthoxylumi adults圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；柱上不同小寫(xiě)字母和大寫(xiě)字母分別表示雌成蟲(chóng)和雄成蟲(chóng)不同組織間的表達(dá)量差異顯著(P<0.05, Duncan氏多重檢驗(yàn))；柱上星號(hào)示雌雄成蟲(chóng)同一組織中的表達(dá)量差異顯著(P<0.05, t檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SD. Different lowercase and capital letters above bars indicate significantly different gene expression levels among different tissues of female and male adult, respectively (P<0.05, Duncan’s multiple range test). The asterisk above bars indicates significant difference in the gene expression level in the same tissue between female and male adults (P<0.05, t-test)

3 討論

昆蟲(chóng)的觸角對(duì)于信息素的聚集、寄主和非寄主揮發(fā)性物質(zhì)的特異性識(shí)別起著至關(guān)重要的作用(Huangetal., 2013; Zhangetal., 2015)。本研究是基于花椒窄吉丁成蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所獲得的序列數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，通過(guò)預(yù)測(cè)其開(kāi)放閱讀框和氨基酸序列的方法，成功克隆得到了花椒窄吉丁氣味結(jié)合蛋白基因AzanOBP3開(kāi)放閱讀框的全長(zhǎng)序列。序列分析表明，AzanOBP3基因編碼的氨基酸序列具有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，編碼137個(gè)氨基酸組成的多肽，在第 29-30位氨基酸存在一個(gè)信號(hào)肽切割點(diǎn)，預(yù)測(cè)的蛋白分子量為16.038 kD，等電點(diǎn)(pI)為4.79。

將AzanOBP3的氨基酸序列與其他幾種已報(bào)道的鞘翅目昆蟲(chóng)氣味結(jié)合蛋白進(jìn)行多重聯(lián)配，發(fā)現(xiàn)每個(gè)昆蟲(chóng)氣味結(jié)合蛋白氨基酸序列中均有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，AzanOBP3與蘋果小吉丁的AmalOBP2和白蠟窄吉丁的AplaGOBP的同源性最高，氨基酸序列一致性分別達(dá)74.45%和76.92%，表明它們之間在進(jìn)化關(guān)系上更加同源。理化特性分析發(fā)現(xiàn)，AzanOBP3具有多個(gè)比較明顯的疏水區(qū)，有較少的區(qū)域能夠結(jié)合脂類氣味分子，有親脂性的氨基酸即可能與疏水性的氣味物質(zhì)結(jié)合，又有可能會(huì)與親水性的物質(zhì)結(jié)合。昆蟲(chóng)OBPs是一類水溶性小分子量酸性蛋白，其典型特征是在二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在6個(gè)保守的半胱氨酸, 分別交叉形成3個(gè)二硫鍵，因此對(duì)其三維結(jié)構(gòu)起到支撐作用(Briandetal., 2001)，AzanOBP3的二級(jí)結(jié)構(gòu)由56.93%的α-螺旋、7.3%的延伸鏈、3.65%的 β-轉(zhuǎn)角和32.12%的無(wú)規(guī)則卷曲組成。

氣味結(jié)合蛋白作為載體，負(fù)責(zé)篩選、結(jié)合以及運(yùn)輸疏水性氣味分子到達(dá)特異性氣味受體，是昆蟲(chóng)感知外界環(huán)境的基礎(chǔ)(Vogt and Riddiford, 1981; Steinbrechtetal., 1995)，能夠與特定的氣味分子相結(jié)合，推測(cè)具有選擇氣味的功能，是昆蟲(chóng)了解外界環(huán)境的首當(dāng)其沖的反應(yīng)(黃恩炯等, 2008; 鐘濤等, 2008; Zhouetal., 2009; 張升祥等, 2010; Pelletier and Leal, 2011; 李慧等, 2018)。本研究對(duì)AzanOBP3在花椒窄吉丁雌雄成蟲(chóng)不同組織中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明AzanOBP3在雄成蟲(chóng)足中的表達(dá)量最高，推測(cè)雄蟲(chóng)對(duì)氣味結(jié)合的能力要強(qiáng)于雌蟲(chóng)，且AzanOBP3的功能可能不僅局限于嗅覺(jué)識(shí)別。經(jīng)原核表達(dá)發(fā)現(xiàn)，融合蛋白在總蛋白中表達(dá)量較大，而在可溶性蛋白部分表達(dá)量相對(duì)較少，且 SDS-PAGE中的表觀分子量比預(yù)測(cè)的分子量偏大，猜測(cè)造成融合蛋白His-AzanOBP3表觀分子量偏差的原因可能是His 標(biāo)簽(唐威華等, 2000)，至于該猜測(cè)是否準(zhǔn)確還需進(jìn)行蛋白純化后切去蛋白標(biāo)簽后SDS-PAGE檢測(cè)驗(yàn)證，以便為今后配基結(jié)合特性的研究提供良好的融合蛋白。

組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，AzanOBP3在雄成蟲(chóng)足中的表達(dá)量最高，提示AzanOBP3不僅在成蟲(chóng)的嗅覺(jué)識(shí)別中發(fā)揮著重要的作用，在花椒窄吉丁成蟲(chóng)非嗅覺(jué)組織中可能也具有重要的生理功能，同時(shí)也可能與雄性成蟲(chóng)尋求配偶的選擇性有關(guān)聯(lián)。AzanOBP3是首次報(bào)道的花椒窄吉丁的OBP基因，對(duì)本實(shí)驗(yàn)已克隆的AzanOBP3基因，將由本實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)進(jìn)行表達(dá)純化其蛋白，通過(guò)熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合等實(shí)驗(yàn)明確該氣味結(jié)合蛋白的結(jié)合譜，為探討該蛋白分子結(jié)構(gòu)及其在花椒窄吉丁成蟲(chóng)觸角感受化學(xué)信息物質(zhì)的作用機(jī)理提供依據(jù)，為今后高效開(kāi)發(fā)和設(shè)計(jì)花椒窄吉丁生物信息素的綠色防控引誘劑的篩選奠定基礎(chǔ)。