巨大口蘑子實體總RNA提取方法的比較

陳梅梅 楊春敏 莫美華

（1廣州工商學(xué)院，廣東廣州510000；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州510000）

巨大口蘑（Tricholoma giganteum），又名洛巴口蘑、大白口蘑，商品名有金鞭口蘑、金福菇、香口蘑、荊西口蘑等，屬擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，口蘑科（白蘑科），口蘑屬（白蘑屬）[1]，原產(chǎn)于熱帶地區(qū)，主要分布在非洲、南亞次大陸，我國臺灣、福建、廣東、香港、云南等地均有不同程度的自然分布[2]。

巨大口蘑具有較高的營養(yǎng)價值，富含蛋白質(zhì)、多糖、脂肪、纖維素和多種礦質(zhì)元素[3]，其干制品中的蛋白質(zhì)和多糖含量分別高達(dá)36.59%和11.59%，均高于雞、松茸，是一種優(yōu)質(zhì)食用菌[4]。

大多數(shù)食用菌采摘后很快褐變、腐爛，無法遠(yuǎn)距離運輸，難以貯藏。而巨大口蘑在8～12℃條件下，貯藏30 d不變色，耐貯性好，與其他食用菌相比有較強抗褐變特性[5-7]。但目前對巨大口蘑抗褐變機理的研究較少，故需要從分子生物學(xué)的角度出發(fā)，溯本求源，克隆出巨大口蘑酪氨酸酶基因的全長，與Genebank中雙孢蘑菇酪氨酸酶基因做比對分析，找到兩者之間差異性表達(dá)的根源，為培育抗褐變新品種提供理論依據(jù)。高質(zhì)量的總RNA提取是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵步驟，而目前提取巨大口蘑總RNA的方法鮮有報道。因此筆者對巨大口蘑子實體總RNA的提取方法進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

新鮮的巨大口蘑子實體（廣州粵旺農(nóng)業(yè)有限公司提供），液氮冷卻后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與耗材

2%CTAB十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammonium bromide）緩沖液；2%PVP（Polyvinylpyrrolidone）（W/V）；25 mmol/L EDTA（Ethylenediaminetetraacetic acid）；100 mmol/L Tris-Cl（Trihydroxymethyl aminomethane-HCl）（pH 8.0）；2.0 mol/L Na-Cl；0.5 g/L亞精胺；2%β-巰基乙醇；Trizol（Invitrogen公司）；E.Z.N.A.Total RNA Kit I試劑盒（OMEGA公司）；SSTE buffer：11.68 g NaCl，1.0 g SDS，0.059 g EDTA；用于提取RNA的研缽（烘箱中加熱至160℃維持2 h）、藥匙、鑷子等用具均用0.1%DEPC（diethyl pyrocarbonate）處理過夜備用；無RNA酶的專用槍頭、PCR管、1.5 mL 離心管、10 mol/L LiCl、dd H2O經(jīng)121℃高壓滅菌30 min，60℃烘干備用；無RNA酶的β-巰基乙醇、70%乙醇（DEPC水配置），一次性手套等。

1.3 巨大口蘑總RNA的提取

1.3.1 Trizol提取方法

（1）向無RNA酶的2 mL離心管中加入1 mL Trizol備用；（2）液氮中迅速研磨新鮮子實體或?qū)?.5 g左右-80℃保存?zhèn)溆玫淖訉嶓w研磨成粉末狀；（3）按照每50～100 mg的樣品加1 mL Trizol提取液的比例取樣，向加有Trizol的離心管中加入相應(yīng)量的樣品，注意樣品的體積不超過提取液的10%；（4）將樣品和提取液用力振蕩混合搖勻后，在15～30℃下靜置5～10 min；（5）4 ℃，17 925×g，離心15 min，小心吸取400μL左右上清液至新的離心管中；（6）向上清液中加入0.5 mL異丙醇，輕搖勻后室溫靜置10 min；（7）17 925×g，4 ℃離心10 min，在管底出現(xiàn)白色沉淀，即為RNA；（8）去掉上清后，向離心管中加入DEPC水配制75%乙醇，振蕩混勻；（9）7 500 r/min，4℃離心5 min，除去上清液倒置在濾紙上，室溫干燥15～20 min，注意不能將RNA完全干燥；（10）加入45μL ddH2O溶解RNA，待完全溶解后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 E.Z.N.A.Total RNA Kit I試劑盒提取方法

（1）液氮中迅速研磨1.5 g新鮮巨大口蘑子實體或?qū)?80℃保存的巨大口蘑子實體研磨至粉末狀，加入600μL的TRK裂解液（每1 mL TRK裂解緩沖液加入20μL的β-巰基乙醇）；（2）向裂解產(chǎn)物中加入等體積（350μL或600μL）70%乙醇，輕輕混勻；（3）把所得混合樣品加到Hibind RNA柱子上，柱子的最大容量為750μL，加完乙醇后可能會形成沉淀，所以要充分振蕩，之后將所有的混合液加到柱子上，把柱子放入一個2 mL的收集離心管中，室溫離心，14 938×g，30～60 s，棄流出液；（4）將柱子放在一個新的2 mL收集管中，加上300μL RNA wash buffer I到柱子上，室溫離心，14 938×g，30～60 s，棄流出液；（5）將柱子放回2 mL收集管中，加入500 μL RNA wash buffer I，室溫離心，14 938×g，30～60 s，棄流出液；（6）將柱子放到一個新的2 mL收集管中，加入500μL RNA wash buffer II，室溫離心，14 938×g，30～60 s，棄流出液；（7）用 500μL RNA wash buffer II洗滌一次柱子，室溫離心，14 938×g，30～60 s，棄流出液，再把柱子放回收集管中，14 938×g，2 min，室溫離心，以甩干柱子基質(zhì)；（8）轉(zhuǎn)移柱子到一個新的1.5 mL的離心管中，加入30～100μL的ddH2O洗脫柱子，室溫靜置2 min，14 938×g，離心1 min，洗脫出RNA。

1.3.3 CTAB-LiCL提取方法

（1）將CTAB提取液置于65℃水浴中預(yù)熱；（2）液氮中研磨1.5 g左右新鮮巨大口蘑子實體或-80℃冷凍巨大口蘑子實體；（3）轉(zhuǎn)移樣品至有15 mL預(yù)熱之后的CTAB提取液的離心管中，劇烈振蕩30 s，放回 65℃水浴靜置 2～5 min；（4）加入等體積的氯仿/異戊醇并振蕩混合，4 ℃，14 938×g，離心15 min；（5）將上清液轉(zhuǎn)移到另一新離心管中，重復(fù)抽提一次；（6）再將上清液轉(zhuǎn)移到另一新離心管中，加入1/3體積的LiCl，4℃下沉淀過夜（最長16 h）；（7）4℃，17 925×g，離心15 min（全速），棄上清，加入500μL 70%乙醇潤洗沉淀，再用500μL 100%乙醇潤洗沉淀；（8）用500μL SSTE 溶解沉淀，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇再抽提一次；（9）加入2×體積的無水乙醇，在-80℃沉淀30 min或-20 ℃沉淀2 h；（10）4 ℃，14 938×g，離心20 min，棄上清；（11）分別用400μL 70%乙醇和400μL 100%乙醇洗沉淀，加入，45μL ddH2O溶解RNA。

1.4 RNA提取質(zhì)量檢驗及濃度計算

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度和完整性，紫外凝膠成像儀觀察并拍照；取10μL RNA樣品，用TE或蒸餾水稀釋50倍，用TE或蒸餾水做空白，調(diào)節(jié)紫外分光光度計的讀數(shù)至零，加入待測RNA樣品，分別測定A260、A280、A230、RNA含量（μg/μL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測

RNA凝膠電泳圖譜可以快速評判所提取的總RNA的完整性，完整的RNA電泳圖譜應(yīng)該可以清晰地看到28S、18S和5S RNA條帶，且28S RNA條帶的亮度約為18S RNA條帶的2倍，因此通過圖譜中各條帶的帶形和亮度可以判斷RNA的提取質(zhì)量。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠上，用上述3種方法所提取的巨大口蘑子實體總RNA的電泳結(jié)果如圖1所示。

圖1 3種方法提取的巨大口蘑子實體RNA凝膠電泳檢測結(jié)果

從圖1中可以清晰地看到A、B、C各有2條明亮的RNA條帶，從上往下分別為28S RNA和18S RNA，且28S RNA條帶的亮度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過18S RNA條帶的亮度，說明3種方法都可以提取巨大口蘑子實體總RNA?？俁NA濃度越高條帶亮度越高，其中試劑盒法提取的總RNA條帶亮度相對較弱，而CTABLiCl法提取的總RNA條帶亮度較強，帶形完整，說明提取質(zhì)量較高。

2.2 總RNA純度及濃度檢測

比較分析3種提取方法提取的巨大口蘑子實體總RNA純度和濃度，結(jié)果表明（表1）：3種方法雖均能提取巨大口蘑總RNA，但濃度和純度有所不同。

表1 3種提取方法提取的巨大口蘑總RNA純度及濃度

CTAB-LiCl法提取的巨大口蘑總RNA的A260/A280是1.92，A260/A230是2.25，濃度為235 μg/g，說明其完整且純凈；Trizol法和試劑盒法提取的巨大口蘑總RNA的A260/A230均小于2.0，說明提取RNA中存在蛋白質(zhì)、多酚等雜質(zhì)（雜質(zhì)越多RNA純度越低），其濃度分別為147μg/g和89μg/g。因此，在后續(xù)的試驗中均采用CTAB-LiCl法提取總RNA，此結(jié)論與以上RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果一致。

3 小結(jié)與討論

分子生物學(xué)技術(shù)是食用菌研究的一個重要手段，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到食用菌研究中[8]。而提取總RNA的質(zhì)量是一切后續(xù)分子生物試驗的基礎(chǔ)。

由230 nm、260 nm和280 nm紫外吸收波長不同組合的比值、總RNA濃度以及瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果可以判斷，巨大口蘑子實體總RNA提取方法的最優(yōu)選擇是CTAB-LiCl法。

巨大口蘑子實體富含蛋白質(zhì)與多糖，且多糖的理化性質(zhì)與RNA非常相似，提取時很難將二者區(qū)分開來，因此找到一種能夠滿足巨大口蘑抗褐變分子機理研究的總RNA提取方法十分重要。要想獲得富含多糖多酚的植物組織和產(chǎn)量高、完整性好的RNA，必須完全破碎植物細(xì)胞（細(xì)胞破碎不完全RNA不會完全游離出來，產(chǎn)量則下降）；且去除多糖和抑制內(nèi)源RNA酶活性是巨大口蘑總RNA提取成功的關(guān)鍵[9]。試驗分析比較了Trizol法、CTAB-LiCl法和試劑盒法提取巨大口蘑子實體總RNA的效果，結(jié)果表明3種方法均能保證RNA的完整性，但是Trizol法和試劑盒法提取的RNA純凈度有待提高，且得率不如CTAB-LiCl法。分析其原因：①巨大口蘑子實體含有較多蛋白質(zhì)，而CTAB作為裂解液，是一種強變性劑，能夠有效地去除蛋白質(zhì)（包括復(fù)合蛋白質(zhì)）等雜質(zhì)；②巨大口蘑子實體富含多糖和多酚類物質(zhì)，而在提取液中加入PVP及β-巰基乙醇能有效地去除組織中的酚類物質(zhì)和多糖，提高RNA的完整性和純度[10]；③在常用的去除多糖的方法中，用LiCl沉淀RNA是RNA提取中最常用的方法，更適于后續(xù)的分子生物學(xué)試驗[11]。所以CTAB-LiCl法提取巨大口蘑總RNA效果最好。

瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，試劑盒法提取的總RNA條帶較多，可能是在提取過程中發(fā)生了不同程度的降解。因此，在試驗過程中應(yīng)該嚴(yán)格按照試驗步驟和要求，在低溫環(huán)境中進(jìn)行，盡量減少RNA的降解。