復合酶法輔助提取無患子總皂苷的工藝

余美瓊,朱金環(huán) ,楊金杯,陸文敬,陳玲玲

（福建技術師范學院海洋與生化工程學院,福建福清 350300）

無患子（Sapindus mukorossi Gaertn.）又名油患子、油羅樹和洗手果,屬于亞熱帶植物,原產我國長江流域以南及中南半島、印度和日本.在我國主要分布在淮河流域以南各省(廣東、福建、浙江、廣西、浙江等)的丘陵山區(qū)[1,2].無患子提取液在中國傳統(tǒng)文化中常常被用來清洗頭發(fā)和身體,《本草綱目》中記載用無患子浸提液洗發(fā)去頭屑、洗臉增白祛斑.無患子皂苷是無患子中重要的活性成分之一,主要存在于果實部位,是一種天然的非離子型表面活性劑[3],具有良好的起泡和去污性能.無患子皂苷是很好的農藥乳化劑[4].藥理研究表明,無患子果皮所含皂苷成分具有抗菌作用[5]、抑制乳腺癌作用[6]等多種生物活性.

目前,無患子總皂苷的提取方法很多,如水溶劑減壓提取[7]、乙醇浸提[8]、丙酮浸提[9]、復合酶法提取[10]、超聲波提取[11]、大孔樹脂吸附提取[12]、水提醇沉[13]等等.但現(xiàn)有無患子總皂苷提取方法普遍存在提取步驟多、耗時長、能耗高、提取率低等問題,有待進一步研究.筆者在前期分別采用乙醇浸提法、乙醇-超聲提取法提取無患子總皂苷,在最佳提取條件下,提取率分別為 5.67% 和 7.02% ,提取效果不佳.酶法輔助提取是近年來用于植物功能性成分提取的一項生物工程技術[14],是利用纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等處理植物原料后,將細胞壁內的蛋白、果膠等酶解掉,使得目標物得到純化,具有操作時間短、成本低、作用條件溫和等優(yōu)點.復合酶集合了纖維素酶和果膠酶,兩種酶共同發(fā)揮作用,破壞植物組織細胞壁的致密性[15],改變細胞壁的通透性[16],可以有效降解細胞壁及細胞間質中的果膠、纖維素等,利于活性成分溶出,提取效果明顯優(yōu)于單獨使用纖維素酶、果膠酶[17].考慮到無患子假種皮細胞壁組成主要為纖維素和果膠質,基于酶具有高效性和特異性.本研究采用纖維素酶和果膠酶組成的復合酶制劑，輔助提取無患子總皂苷.

1 實驗部分

1.1 材料、試劑和儀器

無患子粉末（福建源華林業(yè)生物科技有限公司）；纖維素酶（10萬U/g)、果膠酶（5萬U/g),均購自寧夏和氏璧生物技術有限公司；齊墩果酸標準品98%（HPLC級,上海如吉生物科技發(fā)展有限公司）；香草醛、高氯酸、冰醋酸、無水乙醇、甲醇,均為分析純,均購自國藥集團化學試劑有限公司.

THZ-82A 回旋式恒溫水浴振蕩器（浙江省紹興市蘇珀儀器有限公司）,DHG-9075A電熱鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）,UV-1800PC-DS2型紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）,抽濾機（鞏義市予華儀器有限公司）,電子分析天平（精儀達盛電子公司,日本島津AVY220）.

1.2 實驗方法

1.2.1 無患子總皂苷的提取方法

將無患子粉末過80目篩,在60 ℃烘箱中干燥至恒重,備用.準確稱取無患子粉末2.0 g于150 mL具塞錐形瓶中,加入50 mL蒸餾水,室溫下浸泡24 h.在錐形瓶中加入一定質量比（具體見結果與討論部分）的由果膠酶和纖維素酶組成的復合酶制劑（總酶用量為6%,以無患子粉末質量為基準）,調節(jié)溶液的pH值,將錐形瓶放置于一定溫度（具體見結果與討論部分）的恒溫水浴振蕩器中酶解一定時間（具體見結果與討論部分）.提取液趁熱抽濾,將濾渣放入三口燒瓶中,加入50 mL 70%的乙醇溶液回流提取1 h,抽濾；濾渣重復提取2次,合并濾液并定容至250 mL的容量瓶,取0.1 mL濾液采用分光光度法測定無患子總皂苷含量.每個提取實驗平行三次,實驗結果取平均值.

1.2.2 無患子總皂苷含量的測定

由于目前市面上沒有純的無患子皂苷標準品,而無患子總皂苷主要為齊墩果酸型的三萜皂苷,因此選擇齊墩果酸作為標準品,用香草醛-高氯酸比色法進行皂苷濃度測定.在文獻測試方法[18-21]的基礎上,做了一定的改進.

對照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸標準品0.100 g,加甲醇溶解,定容至100 mL,得濃度為1.0 mg/mL的標準溶液.

顯色劑溶液配制 精密稱取香草醛0.50g置于10mL容量瓶中,加入冰醋酸使其溶解,定容并搖勻,制得質量分數(shù)5%的香草醛-冰醋酸顯色溶液,顯色劑現(xiàn)用現(xiàn)配.

最大吸收波長的確定 取標準溶液和無患子皂苷提取液各 0.20 mL于具塞試管中,置于80 ℃烘箱中烘干,準確加入 5%香草醛-冰醋酸溶液0.40 mL,高氯酸1.60 mL,搖勻,于60℃恒溫水浴中加熱15 min后取出在流水下冷卻至室溫,加冰醋酸定容至10 mL,搖勻,靜置20 min.以蒸餾水為空白對照,用紫外分光光度計在400～700 nm范圍內測兩者最大吸收波長,其最大吸收波長均為553 nm.

標準曲線的繪制 分別精密吸取1.0 mg/mL標 準溶液 0、20.0、40.0、 80.0、120.0、160.0、200.0 、240.0μL于10mL具塞試管中,在80 ℃烘箱中烘干,加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.40 mL,高氯酸1.60 mL,搖勻,于60 ℃恒溫水浴中加熱15 min后取出在流水下冷卻至室溫,加冰醋酸定容至10 mL,搖勻,靜置20 min.以空白溶液為參比,于553 nm波長處測定各組的吸光度值.以吸光度(A)為縱坐標y,以對照品溶液溶度（μg/mL）為橫坐標x繪制標準曲線,得線性回歸方程為：y=0.0283 x -0.0103, R2= 0.9995.

無患子總皂苷含量測定 準確吸取0.10 mL濾液（樣品）于具塞試管中,按標準曲線測定方法,測定濾液的濃度,并計算無患子總皂苷的提取率.

式中：X,皂苷質量濃度（μg/mL）；

V,濾液總體積（mL）；

V',樣品體積（0.10 mL）；

m,無患子粉末的質量2.0 g.

1.2.3 正交實驗的設計

在單因素實驗基礎上,為了進一步優(yōu)化提取工藝參數(shù),設計L9（34）正交實驗（見表1）,按1.2.1提取方法,以總皂苷提取率為指標,來確定復合酶法提取無患子總皂苷的優(yōu)化實驗條件.利用正交設計助手Ⅱ進行數(shù)據統(tǒng)計分析.

表1 正交實驗因素水平表

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 酶配比對無患子總皂苷提取率的影響

按1.2.1提取方法,加入不同配比的復合酶制劑（m果膠酶∶ m纖維素酶=0∶1、1∶0、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1 和 5∶1）,調節(jié)溶液 pH 值為 4.0,在50 ℃下恒溫震蕩90 min.不同復合酶配比對無患子總皂苷的提取率影響見圖1.

圖1 復合酶配比對總皂苷提取率的影響

由圖1分析知,只添加單一的纖維素酶(0∶1)或果膠酶(1∶0),總皂苷的提取率較低,添加果膠酶的提取率略高于添加纖維素酶的提取率,復合酶制劑的提取率高于單一酶的作用,這可能是由于復合酶制劑間具有協(xié)同作用.無患子假種皮細胞壁組成主要為纖維素和果膠質,纖維素酶和果膠酶復合酶促進了細胞壁的分解,加快了皂苷向溶劑的擴散傳質[16].隨著復合酶配比的增大,提取率先上升后下降,可能是由于隨著復合酶配比的增加,果膠酶含量增加,細胞間的果膠質降解了,有利于總皂苷的提取；但是同時纖維素酶含量減少了,細胞壁的通透性下降,又使得總皂苷提取率下降.因此,取最佳復合酶配比2∶1繼續(xù)后續(xù)試驗.

2.1.2 酶解時間對無患子總皂苷提取率的影響

按1.2.1提取方法,加入配比為2∶1的復合酶制劑,調節(jié)溶液pH為4.0,分別在50℃下恒溫震蕩30、60、90、120、150 min.不同酶解時間對無患子總皂苷的提取率影響見圖2.

圖2 酶解時間對總皂苷提取率的影響

由圖 2可知,酶解初期,隨著酶解時間延長,提取率逐漸增加,在酶解時間為90 min 時,提取率最高,之后隨著酶解時間的增加,總皂苷的提取率反而減小.這可能是因為時間短,酶的活性沒有被充分利用,隨著酶解時間的延長,在一定范圍內,可促進皂苷的溶出[22]；而時間過長會導致部分酶失去活性,還有部分皂苷發(fā)生水解[9],使得總皂苷提取率降低.

2.1.3 酶解溫度對無患子總皂苷提取率的影響

按1.2.1提取方法,加入配比為2∶1的復合酶制劑,調節(jié)溶液pH為4.0,分別在30、40、50、60、70 ℃下恒溫震蕩90 min.不同酶解溫度對無患子總皂苷的提取率影響見圖3.

由圖3可知,總皂苷提取率隨著酶解溫度的上升先增加后減小.由30 ℃升至60 ℃時,提取率隨酶解溫度增大而增大,說明溫度升高有利于提高酶的活性,促進酶對無患子假種皮細胞壁中纖維素及果膠質等物質的分解,同時溫度升高分子運動速度加快,能夠促使皂苷快速溶解出來[10,22].但是當溫度超過60℃時,總皂苷的提取率反而下降,這可能是由于超過一定溫度,導致酶活性降低或部分失活[22].

圖3 酶解溫度對總皂苷提取率的影響

2.1.4 pH值對無患子總皂苷提取率的影響

按1.2.1提取方法,加入配比為2∶1的復合酶制劑,分別調節(jié)溶液pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0,在60 ℃下恒溫震蕩90 min.不同pH值對無患子總皂苷的提取率影響見圖4.

圖4 pH值對總皂苷提取率的影響

由圖4可知,無患子總皂苷的提取率隨pH值的升高先增大后減小.這可能是由于pH值不在酶的最適宜pH 范圍內時會導致酶活性降低[16],從而使得纖維素降解、果膠分解不徹底.因為不同酶在不同pH 范圍活性不同[23],纖維素酶在pH為5.0～6.5時具有最佳活性,而果膠酶在pH 為4.0～4.8時具有最佳活性.復合酶最適合的pH值為5.0.

2.2 正交實驗結果

在單因素實驗基礎上,設計L9（34）正交實驗進一步優(yōu)化提取工藝參數(shù),實驗結果見表2和表3.

表2 正交實驗結果表

表3 無患子總皂苷提取率方差分析表

由表2和表3分析可見：各因素對無患子總皂苷提取率的影響順序為D＞C＞A＞B,即pH值＞酶解溫度＞復合酶配比＞酶解時間.從k值判斷可以得出無患子皂苷的提取最優(yōu)工藝為A3B3C2D1,即復合酶配比為3∶1、酶解時間120 min、酶解溫度50 ℃、pH值為4.0,也正是正交實驗表中的9號實驗.9號實驗條件下的3次平行實驗,無患子總皂苷的提取率分別為：19.42%、19.46%、19.45%,平均值為19.44%,標準偏差為0.0208,相對標準偏差為0.11%,說這明復合酶解提取工藝具有良好的穩(wěn)定性.

3 結論

采用果膠酶和纖維素酶復合酶輔助乙醇提取無患子總皂苷,通過單因素實驗和正交實驗,得出復合酶法輔助提取無患子總皂苷的最佳條件為：復合酶配比為3∶1、酶解時間120 min、酶解溫度50 ℃、pH值為4.0,在此條件下無患子總皂苷的提取率為19.44%.與 水溶劑減壓提?。?5.43%）[7]、丙酮浸提（5.72%）[9]、超聲波提?。?.41%）[11]、水提醇沉法（3.66%）[13]、乙醇浸提（14.26%）[24]提取無患子總皂苷相比,提取率有較大的提高.