轉(zhuǎn)基因大豆MON89788 芯片式數(shù)字PCR 定量方法的 建立

楊鎮(zhèn)州 劉剛 梁文

（上海市計量測試技術研究院化學與電離輻射所生物計量實驗室，上海 201203）

據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術應用服務組織（ISAAA）公布的數(shù)據(jù)表明，伴隨著生物技術及相關產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展，截至2018 年底，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達1.92 億hm2，大約為中國大陸面積的2 倍［1］；與此同時，美國在2009 年已批準了8 種抗蟲害轉(zhuǎn)基因新型玉米的商業(yè)化許可；加拿大等國也開始批量開發(fā)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因大豆等作物，我國在2009 年11 月也為轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻和轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米頒發(fā)了生物安全證書。由此可見，轉(zhuǎn)基因作物的相關研究和應用將會越來越廣泛。因此各國家和地區(qū)開始對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物進行系統(tǒng)管理，實施標識制度，如歐盟規(guī)定合法轉(zhuǎn)基因成分標識閾值為0.9%，巴西、新西蘭標識閾值為3%，俄羅斯、日本標識閾值為5%等［2］。這一制度的采用，將轉(zhuǎn)基因安全管理變得更科學合理。與此同時，也對我們傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因檢測方法的精確定量提出了更高要求。

轉(zhuǎn)基因檢測目前主要分為核酸檢測與蛋白檢測兩種［3］。相比于蛋白，核酸在生物細胞內(nèi)含量更穩(wěn)定、不易被破壞，且核酸檢測的操作簡易、靈敏度更高，因此成為轉(zhuǎn)基因檢測的主流方法［4］。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因成分定量檢測基本采用實時熒光定量PCR 法（Realtime fluorescence quantitative PCR，qPCR）［5］， 但qPCR 只能實現(xiàn)相對定量，并且只能夠分辨約兩倍的濃度差異（如5 000 拷貝與10 000 拷貝的差異），且對低濃度的拷貝數(shù)差異分辨能力更低。因此大多數(shù)的qPCR 在轉(zhuǎn)基因檢測方法的應用還停留在定性階段。數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是一種對PCR反應體系進行有限分割，在不同反應微單元中進行擴增，最后根據(jù)泊松分布原理和陽性單元的個數(shù)得出模板DNA 的起始拷貝數(shù)的技術。相較于傳統(tǒng)PCR技術，dPCR 有著高靈敏度、高精確度、絕對定量、反應單元不易受干擾等優(yōu)勢［6］。因此，dPCR 技術在近年來發(fā)展飛速，已多次被報道用于轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測研究中。

轉(zhuǎn)基因品系大豆MON89788 是抗蟲耐除草劑大豆的新品種，目前已在歐盟、韓國、墨西哥等國家被批準用于商業(yè)化種植或食用。在我國，MON89788大豆于2008 年首次獲得農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的進口安全證書，僅限原料加工。目前國內(nèi)該品系轉(zhuǎn)基因大豆的定量檢測方法主要使用普通PCR 法進行定性檢測［7］。而國際上主要采用qPCR 進行定量檢測［2］，尚未見采用dPCR 進行精確定量檢測的報道。本實驗以芯片式dPCR 為檢測平臺對轉(zhuǎn)基因MON89788 品系大豆進行定量檢測方法研究，從提取方法、基因組DNA濃度檢測方法開始進行類比分析，對dPCR 的反應體系進行優(yōu)化，并對方法的重復性和定量限進行評估，對其他轉(zhuǎn)基因定量檢測技術有著重要的借鑒 作用。

1 材料與方法

1.1 材料

植物基因組DNA 提取試劑盒（天根DP305，北京）；引物、探針（佰力格，上海）；3D 數(shù)字PCR系統(tǒng)（QuantStudioTM3D，ABI 公司）；核酸定量儀（Nanodrop2000、Qubit3.0，thermo 公 司）；5%、1%和0.1%的轉(zhuǎn)基因MON89788 大豆粉末，由中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所制備。

1.2 方法

1.2.1 試劑盒法抽提轉(zhuǎn)基因大豆基因組 DNA 用植物基因組DNA 提取試劑盒進行轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA 的抽提。在抽提過程中需要用到酚氯仿，以有效去除大豆材料中的多糖和多酚成分。

1.2.2 CTAB 法抽提轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA 參考GB/T 19495.3-2004 附 錄C 《CTAB-1 法 提 取DNA》進行轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA 的抽提。

1.2.3 反應體系和反應條件 從國內(nèi)通用的大豆 MON89788 定量檢測標準中篩選品系特異序列和內(nèi)源基因的引物探針，并建立各自的PCR 反應體系和反應條件。轉(zhuǎn)基因大豆品系的芯片dPCR反應體系（總體積為20 μL）中，內(nèi)外源基因的正反向引物終濃度均為500 nmol/L，探針終濃度為250 nmol/L。Master mix 體 積 為10 μL，H2O 體 積 為5.5 μL。3D 芯 片dPCR 的反應條件為：酶激活和預變性階段：96℃，10 min；循環(huán)擴增階段：98℃/30 s，60℃/2 min，共40 個循環(huán)。升溫速率為0.8℃/s，降溫速率為1.2℃/s。

1.2.4 檢測方法的重復性 隨機抽取10 瓶轉(zhuǎn)基因含量為5%的大豆MON89788 樣品，每瓶獨立提取3 次，根據(jù)1.2.1 和1.2.2 的方法進行DNA 抽提，隨后根據(jù)

1.2.3 的反應體系及條件進行dPCR。

1.2.5 方法的定量檢測限 提取轉(zhuǎn)基因含量分別為5%、1%和0.1%大豆粉末，控制基因組DNA 的濃度在100 ng/μL 左右，根據(jù)1.2.3 的反應體系及條件進行dPCR，每個擴增實驗重復3 次，并計算測得平行數(shù)據(jù)的RSD 值，以RSD＜25%作為有效定量數(shù)據(jù)的判斷標準。

2 結(jié)果

2.1 提取方法的優(yōu)化

本實驗分別選擇了傳統(tǒng)的CTAB 法和較通用的植物基因組抽提層析柱試劑盒法進行對比。結(jié)果見表1。核酸溶液在紫外260 nm 處有特征吸收峰，若A260/A280在1.8-2.0 之間，說明核酸的純度較好。A260/A280＜1.8，說明溶液中可能含有機試劑或蛋白雜質(zhì)。實驗結(jié)果表明，層析柱法提取大豆基因組DNA的純度顯著優(yōu)于CTAB-1 法，CTAB-1 提取的核酸A260/A280=1.68，提示可能有有機溶劑的污染。同樣的樣品量（約100 mg），層析柱法提取的濃度是傳統(tǒng)CTAB-1 法的2 倍。因此后續(xù)試驗均采用層析柱法進行樣品基因組提取。

表1 采用不同方法提取的轉(zhuǎn)基因MON89788 品系大豆基因組DNA

2.2 DNA模板濃度的控制

數(shù)字PCR 法的模板DNA 濃度應該在47 000-99 723 拷貝范圍內(nèi)，從而避免低轉(zhuǎn)基因含量樣本出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因片段漏取樣的情況，也避免DNA 拷貝數(shù)過高，陽性過載使數(shù)據(jù)精確度下降的情況。為了準確調(diào)控模板的濃度范圍，必須對模板濃度進行預估。本實驗設計使用微量紫外分光光度計法及熒光檢測法分別檢測提取轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA 的濃度，并與數(shù)字PCR 結(jié)果進行對比。實驗結(jié)果見圖1，采用紫外分光檢測的濃度結(jié)果高于熒光檢測的濃度，可能因為紫外分光法受部分蛋白或有機溶劑的干擾使?jié)舛戎灯?，而熒光檢測法能特異性的與雙鏈DNA結(jié)合。但熒光檢測法定量依靠標準曲線的建立，而標準物質(zhì)和樣品與熒光基團的結(jié)合能力不同導致濃度定量的偏差，有時表現(xiàn)出濃度偏低的現(xiàn)象。

紫外分光法測定濃度和數(shù)字PCR 實際測定濃度的線性相關系數(shù)為0.94，而熒光檢測法的線性相關系數(shù)為0.69，說明紫外分光法檢測濃度與數(shù)字PCR法檢測濃度相關性更好。

圖1 使用不同檢測方法測定DNA 的濃度與數(shù)字PCR 定值的線性關系圖

確定紫外分光法作為初步濃度預估方法后，可以根據(jù)質(zhì)量濃度和拷貝數(shù)濃度的轉(zhuǎn)換公式，計算核酸溶液的拷貝數(shù)濃度，見公式1：

其中C 為體積為1 μL 體積DNA 模板的拷貝數(shù)，m為1 μL 體積DNA 模板的質(zhì)量，M 為大豆的基因組DNA 的分子量（約為6.6×1011），NA 為阿伏伽德羅常數(shù)。

最終，控制模板DNA 濃度，使20 μL 反應體系中模板DNA 拷貝數(shù)總量落在47 000-99 723 個拷貝的范圍內(nèi)。

2.3 反應條件的優(yōu)化

本實驗將實時熒光PCR 檢測標準方法中的引物探針應用到數(shù)字PCR 上，并對數(shù)字PCR 反應條件進行優(yōu)化。標準方法中的引物探針序列見表2。數(shù)字PCR 采用終點法判定PCR 微反應單元為陰性或陽性，陽性信號的熒光值是否足夠高十分關鍵。本文使用Quanstudio 3D 芯片數(shù)字PCR 平臺進行實驗優(yōu)化。轉(zhuǎn)基因大豆MON89788 外源基因用FAM 熒光基團標記，大豆內(nèi)源基因1-lectin 采用FAM 熒光基團標記，2-lectin 采用VIC 熒光基團標記，結(jié)果見圖2。實驗結(jié)果表明，同樣來自GB 19495.5-2018 標準中的大豆內(nèi)源基因lectin 的引物探針，采用適合芯片數(shù)字PCR 的擴增條件，在數(shù)字PCR 上的擴增熒光信號的區(qū)分效果有很大差異。1-lectin 引物探針對的區(qū)分效果很差，陰性和陽性信號有大量的重疊現(xiàn)象。而2-lectin 引物探針對由于陽性孔中PCR 擴增效果好，PCR 擴增孔的熒光信號很高，足以和陰性信號有效區(qū)分。

2.4 方法的重復性

圖2 轉(zhuǎn)基因大豆MON89788 的芯片dPCR 擴增圖

表2 靶基因引物探針序列

隨機抽取10 瓶含量為5%的MON89788 轉(zhuǎn)基因大豆樣品，每組獨立取3 次樣品，并獨立進行內(nèi)源基因和外源基因dPCR 實驗，計算并統(tǒng)計每組的轉(zhuǎn)基因含量，結(jié)果見表3。實驗結(jié)果表明，將本方法應用于樣品檢測中，在考慮了提取效率對轉(zhuǎn)基因定量結(jié)果的影響下，10 組樣品中檢測重復RSD 最大的9.97%，最小的僅1.17%，均滿足轉(zhuǎn)基因成分定量檢測行業(yè)公認的檢測平行數(shù)據(jù)RSD 可接受誤差25%的要求［8］，說明本方法重復性優(yōu)異。該樣品的轉(zhuǎn)基因標準值為5%，檢測結(jié)果的示值誤差僅0.05%。

表3 5%轉(zhuǎn)基因大豆MON89788 檢測的重復性

2.5 方法的定量檢測限

提取轉(zhuǎn)基因含量為5%、1%、0.1%的MON89788 轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA，并進行dPCR 檢測，結(jié)果 （表4）分別為5.20%、0.94%和0.11%，相對偏差分別為0.3%、-0.06%和0.01%，RSD 分別為6.2%、3.6%和15.2%。檢測結(jié)果的相對偏差和RSD 均遠遠小于轉(zhuǎn)基因檢測行業(yè)規(guī)定的偏差小于25%，因此該方法可以用于轉(zhuǎn)基因的定量檢測［9］。

3 討論

本文研究了一種芯片數(shù)字PCR 定量檢測大豆MON89788 的方法，研究內(nèi)容涵蓋基因組DNA 提取方法及濃度檢測方法、引物探針的序列選擇設計、引物探針的最佳濃度、PCR 反應過程的時間、溫度 等。運用該方法進行實際樣品檢測，10 組5%的轉(zhuǎn)基因大豆樣品的檢測重復性RSD 在1.17%-9.97%之間。0.1%的轉(zhuǎn)基因大豆樣品的定量示值誤差為0.01%，定量重復性RSD 為15.2%，定量限滿足歐盟的0.9%轉(zhuǎn)基因定量標識限要求。

在樣品前處理階段，本方法采用試劑盒提取大豆基因組DNA，其效果優(yōu)于CTAB 法，可能的原因是：試劑盒中吸附柱更容易甩脫雜質(zhì)，而CTAB 提取方法中異丙醇與水層顏色區(qū)分不明顯、吸取DNA 不準確，易帶來有機溶劑雜質(zhì)。在基因組DNA 濃度估算中，相比于熒光檢測Qubit 法，紫外分光法定量檢測提取得到的基因組DNA 濃度與數(shù)字PCR 結(jié)果一致性更高。當基因組DNA 純度滿足A260/280在1.8-2.0之間時，用微量紫外分光光度計估算核酸的拷貝數(shù)濃度更可靠。

在PCR 反應階段，實時熒光定量PCR 的反應體系不能照搬到數(shù)字PCR 的反應體系中，而陰性和陽性信號的區(qū)分是數(shù)字PCR 定量結(jié)果準確性和重復性的可靠保證。如果熒光信號閾值的拖動會造成陽性反應單元數(shù)有5%以上的變動，定量結(jié)果重復性會更差，此時需注意優(yōu)化PCR 方法。優(yōu)化數(shù)字PCR方法，優(yōu)先考慮更換引物探針序列；其次是優(yōu)化引物探針濃度，優(yōu)化PCR 反應的延伸時間，退火溫度等反應過程。

在轉(zhuǎn)基因定量檢測中，相比傳統(tǒng)的qPCR，dPCR 不需要制作標準曲線［10］，也避免了昂貴的標準物質(zhì)的使用，以及PCR 擴增效率差異對實驗結(jié)果的影響［11］。將該方法用于轉(zhuǎn)基因大豆的定量檢測，能為規(guī)范我國轉(zhuǎn)基因監(jiān)管工作的實施提供強有力的技術支撐和方法依靠。

表4 轉(zhuǎn)基因大豆MON89788 dPCR 定量檢測限實驗結(jié)果