鮮切香菇貯藏過程中質(zhì)構(gòu)變化與自溶自噬分析

趙爽 蘇哲 谷彤彤 高琪 榮成博 宋爽 劉宇

（北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所，北京 100097）

香菇（Lentinula edodes），又名花菇、香蕈、香菌、冬菇，是我國特產(chǎn)及出口量較大的食用菌之一［1］，也是市場上重要的食用菌消費品種。香菇富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多種維生素和具有免疫調(diào)節(jié)作用的香菇多糖，可以提高人體免疫力，具有防癌抗癌、降血壓血脂、抗氧化抗炎癥等藥理作用［2-5］。新鮮香菇組織含水量高，新陳代謝旺盛，容易出現(xiàn)老化、褐變等品質(zhì)下降的現(xiàn)象，目前在保鮮加工領(lǐng)域中，研究多集中于整體鮮菇保鮮技術(shù)的開發(fā)，如低溫貯藏、涂膜處理、輻照除菌等，葉靜君報導低溫氣調(diào)可以減少香菇的失重率、降低多酚氧化酶的活性，減少褐變［6］；李艷杰等［7］報道利用1 μL/L 1-MCP處理香菇可以保持其感官品質(zhì)，防止褐變、提高氧化能力，但對于鮮切香菇加工的研究未見報道。

食用菌鮮切是果蔬鮮切加工領(lǐng)域中的一個分支，相關(guān)的研究較為缺乏，食用菌子實體含水量高，呼吸蒸騰作用強，經(jīng)過鮮切加工后，組織會受到機械損傷，引起一系列生理生化反應，同鮮切果蔬產(chǎn)品類似，發(fā)生組織軟化、氧化褐變、風味下降、腐敗劣變等問題［8-12］，同時真菌細胞在受到損傷后激發(fā)自溶自噬的程序，鮮切食用菌在環(huán)境和老化自溶機制的共同作用下，組織結(jié)構(gòu)如何變化，細胞如何消融，這一過程仍然沒有被闡明揭示。

本研究以香菇作為原材料，根據(jù)鮮切最小加工原則，對其進行處理包裝和貯藏，通過質(zhì)構(gòu)分析結(jié)合鮮切香菇的衰老變化，研究香菇在鮮切加工后品質(zhì)劣變、老化自溶時組織微觀現(xiàn)象以及細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的改變，闡述鮮切香菇貯藏期的自噬過程，旨為鮮切香菇加工技術(shù)的保鮮與應用提供理論分析。

1 材料與方法

1.1 材料

香菇選用市場上常見的“0912”品種，由北京三寶香農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，采摘當天挑選無機械損傷、菇形大小、菌蓋厚度、重量均一的香菇，清洗、瀝干后切根。將香菇切成3 mm 左右薄片，裝入食品密封包裝袋后封口（每袋10±0.2 g），分別置于低溫（4℃）、常溫（25℃）條件下保存，每個處理設(shè)置3 個重復，每隔2 d 取樣一次至樣品完全腐爛，將每一時間點的樣品進行處理，開展品質(zhì)以及抗氧化能力檢測。

1.2 方法

1.2.1 品質(zhì)指標測定

1.2.1.1 硬度 參照Ye 等［13］的研究方法，略有改動。使用探針直徑為3 mm 的硬度計（FR-5120）測定香菇片菌蓋中心部位的硬度，每個處理進行6 次測定，取其平均值。

1.2.1.2 失重 采用稱重法［14］，記錄同一樣品在整個儲藏過程中質(zhì)量變化。

失重率 =（貯藏前的重量-貯藏后的重量）/貯藏前的重量 ×100%

1.2.1.3 褐變 參考王清章等［15］的方法，略有改動。將1 g 樣品加入9 mL 的蒸餾水，破碎勻漿，離心，取上清稀釋液10 倍后，測定410 nm 處的測定吸光度（A），以此用來判斷褐變程度。

1.2.2 抗氧化能力測定 準確稱取5 g 組織樣品，按重量（g）∶體積（mL）=1 ∶9 的比例加入9 倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下，制成10%組織勻漿液，4 000 r/min 離心10 min，取上清備用，作為待檢測樣品。

1.2.2.1 總抗氧化能力（AOC）測定 取低溫貯藏條件下0、2、4、6、8、10、12、14 d 及常溫貯藏條件下0、2、4、6、8 d 的樣品，利用總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（南京建成生物工程研究所）進行檢測。

1.2.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）測定 取低溫貯藏條件下0、2、4、6、8、10、12、14 d 及常溫貯藏條件下0、2、4、6、8 d 的樣品，利用超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所）進行檢測。

1.2.2.3 過氧化氫酶（CAT）測定 取低溫貯藏條件下0、2、4、6、8、10、12、14 d 及常溫貯藏條件下 0、2、4、6、8 d 的樣品，利用過氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成生物工程研究所）進行檢測。

1.2.3 老化自溶結(jié)構(gòu)變化

1.2.3.1 菌絲結(jié)構(gòu)分析 對鮮切香菇和老化樣品進行取樣，選取香菇片中間、非菌褶部位，用消毒刀片切取小塊組織（0.2 cm×0.2 cm×0.1 cm），加入到2.5%的戊二醛磷酸緩沖液（GA）中固定12 h，固定后的樣品用消毒刀片切成單層組織，置于載玻片上，覆上蓋玻片后輕輕捻壓分散組織，光鏡下觀察組織形態(tài)，通過計數(shù)法統(tǒng)計菌絲數(shù)量和菌絲中鎖狀聯(lián)合數(shù)量。

1.2.3.2 細胞膜結(jié)構(gòu)分析 對鮮切香菇和老化樣品進行取樣，子實體組織用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffered saline PBS）洗滌3 次，去除GA 固定液，用10 μmol/L 細胞膜紅色熒光探針（1，1′-dioctadecyl-3，3，3′，3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate DiI）標記液浸沒組織切片，避光浸染20 min，用0.1 mol/L PBS 沖洗切片3 次，將切片置于載玻片上，覆上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察細胞膜的著色情況。

1.2.3.3 細胞核檢測分析 對鮮切香菇和不同處理的樣品進行取樣，切片，組織用0.1 mol/L PBS 洗滌3 次，用乙醇-乙酸固定液處理組織30 min，在樣品上滴加50 μL 8 mg/L 的DAPI 孵育1 h，滴加抗熒光淬滅封片液50 μL，覆上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3.4 細胞內(nèi)部DNA 碎片分析 對鮮切香菇和不同處理的樣品進行取樣，切片，利用2.5%的戊二醛磷酸緩沖液（GA）固定12 h，去除GA 固定液，用0.3% 的Triton X-100 溶液孵育5 min，再用PBS 洗滌2 次，在樣品上滴加新鮮配置的TUNEL（TdT 酶5 μL，熒光標記液45 μL），37℃避光孵育1 h，用PBS 洗滌3次，滴加抗熒光淬滅封片液50 μL，覆上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3.5 細胞超微結(jié)構(gòu)分析 對鮮切香菇和不同處理的樣品進行取樣，利用2.5%的戊二醛磷酸緩沖液（GA）固定12 h，采用乙醇脫水處理后，包埋于電鏡專用樹脂中，將包埋樣品送往清華大學公共檢測平臺利用透射電鏡（TEM）分析細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)變化。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 所得數(shù)據(jù)均由平均值和標準偏差表示，每個處理重復3 次。利用Excel 2016 軟件進行方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 鮮切香菇外觀分析

鮮切香菇片隨著貯藏期的延長，其表觀形態(tài)明顯發(fā)生劣變。從產(chǎn)品表觀分析新鮮香菇經(jīng)過鮮切加工后貯藏初期會出現(xiàn)菇體褐變、失水干縮、菇體變軟的現(xiàn)象，說明菇體已經(jīng)開始發(fā)生明顯的生理改變以及加速老化進程；隨著貯藏期的延長，菇體表面出現(xiàn)黏膩、出水，氣味物質(zhì)發(fā)生改變的現(xiàn)象，說明此時菇體已經(jīng)開始在多種作用下發(fā)生老化消融的現(xiàn)象。通過觀察發(fā)現(xiàn)貯藏在25℃條件下，香菇切片在第8 天嚴重褐變腐爛劣變，設(shè)為實驗終點；貯藏在4℃條件下，第16 天設(shè)為實驗終點。

2.2 不同溫度條件下鮮切香菇品質(zhì)的變化

硬度與香菇片腐敗程度存在直接關(guān)系，是品質(zhì)的屬性之一。鮮切香菇片的硬度隨貯藏期的延長而下降（圖1），各處理組在前2 d 均表現(xiàn)出硬度顯著下降（P＜0.01），其后4℃的貯藏條件相對于25℃的貯藏條件菇片軟化進程減緩，在第6 天的時候，4℃處理組硬度顯著高于25℃處理組（P＜0.05）。

圖1 不同溫度對鮮切香菇硬度的影響

香菇經(jīng)過鮮切加工后增加了表面積，水分蒸發(fā)量增大，失水達到一定程度時，對其品質(zhì)和生理代謝都會產(chǎn)生很大的影響。在4℃和25℃的貯藏條件下，鮮切香菇的失重率隨著貯藏期的延長而增加（圖2）。由于溫度可以影響菇體內(nèi)水分的蒸發(fā)，因此25℃的貯藏條件下的失重率顯著高于4℃的貯藏條件下的失重率，在第4 天時25℃處理組的失重率為8.3%，而4℃處理組的失重率僅為3%，在25℃貯藏條件的實驗終點第8 天，失重率達到了21%，4℃貯藏條件的實驗終點第16 天，失重率為14.7%。因此4℃的貯藏條件更有利減少鮮切香菇的水分流失，保持良好的外觀。

圖2 不同溫度對鮮切香菇失重率的影響

褐變是評價鮮切香菇品質(zhì)的指標之一。圖3 顯示，25℃貯藏組在第4 天之后褐變出現(xiàn)激增，褐變程度顯著高于4℃貯藏組（P＜0.05）。相比較而言， 4℃貯藏組褐變程度平穩(wěn)變化，說明4℃的貯藏條件可以保持香菇片的顏色，減少褐變的發(fā)生。

圖3 不同溫度對鮮切香菇褐變的影響

2.3 不同溫度對鮮切香菇品質(zhì)抗氧化活性的影響

由圖4 可以發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏期的延長，各種溫度條件下，香菇切片的抗氧化能力都是呈現(xiàn)下降的趨勢，其中在25℃的貯藏條件下，抗氧化能力的損失更為顯著。AOC 活性檢測結(jié)果顯示在第2、4 天時，25℃處理組的總抗氧化活性已經(jīng)顯著低于4℃處理組（P＜0.05）。在第2、4 天時，CAT 活性在不同處理組間差異最大（P＜0.05），4℃處理組的CAT活性分別是25℃處理組的1.4 倍和2.6 倍。SOD 活性檢測結(jié)果同樣顯示出25℃處理組的酶活性下降為迅速，在第8 天時，其活性僅為4℃處理組SOD 活性的28.5%。

從生理生化指標分析結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，低溫貯藏條件有利于鮮切香菇的品質(zhì)保持，低溫環(huán)境可以減少蒸騰作用，減少微生物的繁殖，減緩組織氧化的進程，從而降低了菇體的軟化、褐變和腐敗，是延長鮮切香菇貨架期的重要儲存條件。

2.4 組織微觀結(jié)構(gòu)變化及自噬現(xiàn)象

香菇在采收后仍然處于生命旺盛期，切片鏡下可觀測到細胞間的鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)，通過計算相同菌絲數(shù)中鎖狀聯(lián)合的比例發(fā)現(xiàn)，鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)在所有細胞中占比約為25%（圖5-A）。而在老化切片中，菌絲邊緣壁膜結(jié)構(gòu)模糊不清，推測開始發(fā)生自溶自噬現(xiàn)象，未見到菌絲細胞間存在鎖狀聯(lián)合的結(jié)構(gòu)，說明此時切片組織已經(jīng)老化（圖5-B）。

圖4 不同溫度對鮮切香菇抗氧化活性的影響

圖5 菌絲體鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)消失（400×）

利用DiI 探針對貯藏末期的香菇片進行染色，對比光鏡下的細胞結(jié)構(gòu)，可以發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)斷裂，細胞膜發(fā)生消融，已經(jīng)呈現(xiàn)出不完整的狀態(tài)（圖6），推測細胞膜的缺失與香菇片的軟化具有一定的關(guān)聯(lián)。

圖6 DiI 標記細胞膜的缺失現(xiàn)象（400×）

細胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA 內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA?；蚪MDNA 斷裂時，暴露的3′-OH 可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）的催化下加上綠色熒光探針熒光素進行標記，TUNEL 染色法也是基于此，從而標記了細胞內(nèi)斷裂的DNA 片段，通過激發(fā)后，可在515-565 nm 處檢測到綠色熒光，利用熒光顯微鏡可以觀察到細胞內(nèi)DNA 斷裂的情況。DAPI 是一種能夠與雙鏈DNA 結(jié)合的藍色熒光染料，它標記的是細胞核內(nèi)完整的DNA，此染料需要在紫外光下激活，在460 nm處檢測藍色熒光，用以表示細胞核的狀態(tài)。

如圖7 所示，對比光鏡菌絲形態(tài)，經(jīng)過TUNEL染色后，菌絲內(nèi)出現(xiàn)很多綠色的熒光亮點，說明此時菌絲體中存在大量的DNA 碎片，而DAPI 染色后，未在菌絲體中發(fā)現(xiàn)明顯的核狀著色體，說明此時的細胞中不存在細胞核。結(jié)果暗示細胞內(nèi)伴隨著DNA的斷裂，細胞核已經(jīng)消融，細胞進入到自溶自噬進程。

圖7 熒光標記細胞核和DNA 的斷裂現(xiàn)象（400×）

通過透射電鏡的檢測，可以直觀的觀察到細胞宏觀以及內(nèi)部的結(jié)構(gòu)形態(tài)變化，從圖8-A 中可以觀察到新鮮香菇切片細胞外層具有厚實的細胞壁，細胞內(nèi)部細胞器清晰，胞質(zhì)均勻。對比圖8-B 顯示的老化細胞，可明顯發(fā)現(xiàn)衰老細胞內(nèi)胞質(zhì)消融，胞內(nèi)液泡增大，胞壁變薄，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。

圖8 透射電鏡下新鮮香菇和老化香菇細胞比較

進一步從微觀角度分析細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)變化，圖9 顯示的是細胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)。新鮮香菇切片細胞中可觀測到細胞壁厚實，胞質(zhì)均勻，內(nèi)部細胞器結(jié)構(gòu)清晰，液泡大小正常。而老化細胞形態(tài)差異較大，可見胞壁消融、缺失的現(xiàn)象，細胞發(fā)生破損，同時胞內(nèi)可見褐色沉淀，細胞顏色加深（圖9-B），部分細胞中出現(xiàn)吞噬泡，發(fā)生自體自噬現(xiàn)象（圖9-C），最終胞內(nèi)只存有大量的空泡體，細胞器消失，胞壁裂解的現(xiàn)象（圖9-D）。

圖9 透射電鏡下超微觀結(jié)構(gòu)觀察

3 討論

鮮切加工技術(shù)的發(fā)展為市場提供了新鮮、營養(yǎng)、方便的食品，目前鮮切對象分為鮮切蔬菜、鮮切水果及鮮切中藥材3 大類，涉及的品種主要有生菜、馬鈴薯、西蘭花、黃瓜、菠蘿、蘋果、三七、延胡索等［16-20］。對于鮮切食用菌的研究報道為數(shù)不多，陳學玲［21］研究了次氯酸鈉、二氧化氯、過氧化氫、乙醇4 種殺菌劑對鮮切香菇品質(zhì)的影響發(fā)現(xiàn)，150 mg/L NaClO 抑菌效果最佳；趙春霞［22-23］研究發(fā)現(xiàn)90%高體積分數(shù)氬氣能維持香菇的可溶性固形物含量，保持硬度和白度，同時0.5%殼聚糖+1.5%海藻酸鈉涂膜處理能夠提高氬氣的效果。目前鮮切果蔬加工技術(shù)的研究側(cè)重于清洗除菌、物理保鮮、化學涂膜保護、氣調(diào)包裝等方面的研究。針對食用菌組織脆嫩、含水量高、代謝旺盛易老化的特點，相關(guān)的基礎(chǔ)和技術(shù)研究未見報道。

本研究通過加工破壞了香菇子實體的整體結(jié)構(gòu)，增加了菌肉和菌絲與外界環(huán)境的接觸。外界的不利因素，如微生物的浸染、氧氣的氧化等，伴隨著菌體的應激自噬機制，加速了一系列的生理生化反應，使裸露組織加速劣變。品質(zhì)及抗氧化能力檢測發(fā)現(xiàn)低溫貯藏環(huán)境可以保持鮮切香菇的品質(zhì)，減緩褐變的速度，降低菇體抗氧化能力的損失，延長貨架期，這一研究結(jié)果與寇莉萍等的研究一致［6］。研究發(fā)現(xiàn)在儲藏前期菇體會發(fā)生明顯的軟化，這與組織的應激損傷機制有一定的關(guān)系，激活了體內(nèi)的自噬水解酶，組織啟動了進入自噬凋亡程序，利用顯微技術(shù)也印證了自噬的特征現(xiàn)象，觀察發(fā)現(xiàn)組織細胞內(nèi)的正常生理結(jié)構(gòu)發(fā)生劣變，出現(xiàn)胞壁斷裂、胞膜消融、自噬體吞噬細胞器、大量DNA 斷裂、細胞核消失以及細胞解體等現(xiàn)象，進一步結(jié)合細胞凋亡的相關(guān)分析可以對鮮切香菇自溶自噬的現(xiàn)象進行機理層面的揭示。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示香菇切片在貯藏期出現(xiàn)的最主要問題是切片軟化、褐變和抗氧化活性降低，從而降低了貨架期的產(chǎn)品品質(zhì)。微觀結(jié)構(gòu)研究顯示鮮切香菇經(jīng)過機械損傷后激發(fā)了自溶自噬機制，細胞內(nèi)出現(xiàn)胞壁斷裂、胞膜消融、自噬體吞噬細胞器、大量DNA 斷裂、細胞核消失以及細胞解體等現(xiàn)象，是引發(fā)香菇片軟化重要原因之一。本研究結(jié)果展示了鮮切香菇在不同貯藏溫度下的生理生化的改變，揭示了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)需要面臨的技術(shù)問題，鮮切香菇工廠化生產(chǎn)需要在減少微生物污染、抗氧化、失水等問題上加大攻關(guān)，從而提高鮮切產(chǎn)品的品質(zhì)，延長產(chǎn)品的貨架期。