姜黃素通過(guò)激活肝細(xì)胞自噬減輕脂多糖/D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷*

謝一瀲， 楊乃彬， 王麗萍， 宣艷艷， 鄔怡怡， 錢國(guó)清， 石潔君， 史光俠， 李國(guó)祥

（寧波市第一醫(yī)院感染科，浙江寧波315000）

由缺血、藥物、外源性毒物及其代謝產(chǎn)物和感染等各種病因引起的急性肝損傷（acute hepatic injury，AHI）臨床上十分常見(jiàn)，其病情發(fā)展迅速、兇險(xiǎn)，如果未得到及時(shí)的控制和治療，將會(huì)發(fā)展為急性肝衰竭，成為危及人類生命的重要疾病之一。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）/D-氨基半乳糖（D-galactosamine，DGalN）聯(lián)合注射更能模仿人類的急性爆發(fā)性肝衰竭的發(fā)生，因此LPS/D-GalN誘導(dǎo)的動(dòng)物模型是研究急性肝損傷最常用的模型［1］。

姜黃素（curcumin，CUR）是從香料姜黃的根莖中提取的一種酚類化合物，其藥理作用廣泛，具有抗氧化、抗炎、抗纖維化、抗腫瘤、抗菌以及調(diào)節(jié)免疫的功能，對(duì)于各類肝損傷有不同的預(yù)防或治療效果［2］。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過(guò)調(diào)節(jié)自噬發(fā)揮作用。Guo等［3］報(bào)道，姜黃素能激活自噬保護(hù)細(xì)胞免受過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的損傷和減緩細(xì)胞凋亡。Yao等［4］認(rèn)為，姜黃素可通過(guò)增強(qiáng)自噬、減輕凋亡，從而改善糖尿病相關(guān)心肌病變。張豪杰等［5］研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素減輕小鼠腎臟再灌注損傷的作用可能與其促進(jìn)再灌注后細(xì)胞自噬相關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于姜黃素對(duì)LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷影響的研究較少，我們既往的研究顯示姜黃素對(duì)LPS/D-GalN誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷有一定治療作用［6］，基于此，本實(shí)驗(yàn)擬從細(xì)胞自噬的角度，探討姜黃素減輕LPS/D-GalN誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷的機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，購(gòu)入時(shí)6周齡，實(shí)驗(yàn)時(shí)體重為180 g左右，購(gòu)自上海斯萊克公司，購(gòu)入后在SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

2 主要試劑

LPS、D-GalN、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）和姜黃素均購(gòu)自Sigma；兔抗小鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）和beclin 1抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自eBioscience。

3 主要方法

3.1 急性肝損傷動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 采用腹腔注射800μL的LPS（8μg/kg）及D-GalN（800 mg/kg）制造急性肝損傷動(dòng)物模型，劑量根據(jù)我們既往的研究得出［6］。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，分別為對(duì)照（control）組、AHI組、CUR組、3-MA組和3-MA+CUR組，每組6只。對(duì)照組給予等體積生理鹽水腹腔注射，其余各組均建立急性肝損傷模型；姜黃素組每天給予姜黃素溶液120 mg/kg（溶于0.5%CMC-Na），5 mL/kg灌飼大鼠1次，連續(xù)5 d后建立急性肝損傷模型，對(duì)照組、AHI組和3-MA組每天給予等體積0.5%CMC-Na灌胃5 d。3-MA組在建立急性肝損傷模型前2 h腹腔注射2.5 mg/kg 3-MA［7］。3-MA+CUR組于肝損前5天給予120 mg/kg姜黃素溶液灌飼，然后在建立急性肝損傷模型前2 h腹腔注射2.5 mg/kg 3-MA。在肝損模型建立12 h后處死大鼠并收取血及肝組織；血清存放于-80℃冰箱，病理組織樣本浸泡于4%甲醛，肝組織經(jīng)液氮瞬時(shí)冷凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱備用。

3.2 血液生化指標(biāo)檢測(cè) 將獲得的血清采用全生化分析儀檢測(cè)大鼠血清谷丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。

3.3 肝組織切片病理變化的觀察 肝組織標(biāo)本于4%甲醛溶液固定后，進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片和HE染色，于正置顯微鏡下觀察肝臟組織的病理學(xué)形態(tài)變化。

3.4 透射電鏡觀察自噬體 肝組織標(biāo)本于2.5%戊二醛磷酸緩沖液中固定后，進(jìn)行沖洗、后固定、染色、沖洗、脫水、包埋、切片，采用4%醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色，最后將染色后的超薄切片放到單孔銅網(wǎng)上，于透射電鏡下觀察。

3.5 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 取0.1 mg肝臟組織，加入裂解液充分勻漿，離心后取上清液。先用雙喹啉-4-羧酸二鈉鹽蛋白分析試劑盒測(cè)定樣本內(nèi)蛋白濃度，再用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)膜。室溫下封閉1 h，搖床上洗滌5 min，移入含有I抗（抗LC3和beclin 1抗體）的孵育盒中，4℃孵育過(guò)夜。再在搖床上洗滌3次，移到含II抗（goat anti-rabbit IgG和goat anti-mouse IgG，1∶5 000稀釋）的抗體孵育盒中，于室溫?fù)u床上孵育2 h。洗滌3次后加入底物并曝光顯影。應(yīng)用生物電泳圖像分析系統(tǒng)測(cè)定條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)水平。

3.6 腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的ELISA檢測(cè) 取保存的血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α的含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，若各組總體方差齊同，則采用SNK-q檢驗(yàn)，若方差不齊，則采用Tamhane檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠血清ALT和AST水平

與對(duì)照組比較，AHI組ALT和AST水平顯著升高（P＜0.05）；與AHI組比較，姜黃素組的ALT和AST水平顯著下降（P＜0.05）；與姜黃素組比較，3-MA組及3-MA+CUR組的ALT和AST水平均顯著升高（P＜0.05），但與肝損傷組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

2 肝組織切片病理學(xué)的變化

正常對(duì)照組肝細(xì)胞輕度水腫，未見(jiàn)明顯病變。肝損傷組可見(jiàn)約50%的肝細(xì)胞壞死，壞死的肝細(xì)胞核碎裂、胞漿深染，壞死區(qū)可見(jiàn)較多炎細(xì)胞浸潤(rùn)。姜黃素組的壞死細(xì)胞較肝損傷組顯著減少，炎細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)較輕。而3-MA組及3-MA+姜黃素組較肝損傷組無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖2。

Figure 1.The serum levels of ALT and AST in various groups.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs AHI group；#P＜0.05 vs CUR group.圖1 大鼠血清ALT和AST水平的變化

Figure 2.Pathological changes of rat liver tissues in various groups（HEstaining，×100）.A：control group；B：AHIgroup；C：CUR group；D：3-MA group；E：3-MA+CURgroup.圖2 各組大鼠肝組織的病理變化

3 電鏡下觀察自噬體的情況

正常對(duì)照組無(wú)明顯自噬體形成，線粒體嵴和膜形態(tài)正常。AHI組可見(jiàn)較多自噬小體形成，線粒體膜、核膜和細(xì)胞膜不完整、線粒體嵴間隙加大、消失。姜黃素組可見(jiàn)大量自噬小體形成。3-MA組及3-MA+CUR組自噬體較姜黃素組明顯減少，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Autophagic bodies of the liver tissue were observed by transmission electron microscopy（×10 000）.A：control group；B：AHIgroup；C：CURgroup；D：3-MA group；E：3-MA+CURgroup.圖3 各組大鼠肝組織的透射電鏡下自噬體的觀察

4 各組大鼠肝組織內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3及beclin 1的表達(dá)情況

與對(duì)照組比較，AHI組大鼠的LC3-Ⅱ及beclin 1蛋白表達(dá)量均上調(diào)（P＜0.01）；與AHI組比較，姜黃素組的LC3-II及beclin 1蛋白表達(dá)量均上調(diào)（P＜0.01）；與姜黃素組比較，3-MA組及3-MA+CUR組的LC3-II及 beclin 1蛋白表達(dá)量均顯著下降（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

Figure 4.The protein levels of LC3 and beclin 1 in the liver tissues in variousgroupsdetected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group；△△P＜0.01 vs AHI group；##P＜0.01 vs CURgroup.圖4 肝組織自噬蛋白LC3和beclin 1蛋白水平的變化

5 各組大鼠血清TNF-α表達(dá)情況

AHI組大鼠血清TNF-α含量較對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）；姜黃素組大鼠血清TNF-α含量較AHI組顯著下降（P＜0.01）；3-MA組及3-MA+姜黃素組大鼠的血清TNF-α含量較姜黃素組明顯增高（P＜0.01），見(jiàn)圖5。

討 論

Figure5.The serum levels of TNF-αin various groups detected by ELISA.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；△△P＜0.01 vs AHIgroup；##P＜0.01 vs CURgroup.圖5 各組大鼠血清TNF-α含量的比較

自噬是真核生物細(xì)胞中一種高度保守的代謝途徑，負(fù)責(zé)處理受損的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白，并在惡劣條件下為機(jī)體提供充分的能量，因此，自噬對(duì)機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下維持細(xì)胞內(nèi)平衡、細(xì)胞生存和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起關(guān)鍵作用。此外，自噬對(duì)炎癥有著重要的調(diào)節(jié)作用，可影響炎癥疾病的病理進(jìn)程，其重要作用與肝臟、肌肉等代謝性器官密切相關(guān)［8］。

近年來(lái)許多研究表明，自噬在LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。LPS/D-GalN作用于肝臟后，可誘導(dǎo)肝臟巨噬細(xì)胞大量釋放促炎因子引起應(yīng)激反應(yīng)，過(guò)度表達(dá)的促炎因子如TNF-α、持續(xù)大量的活性氧簇（reaction oxidation species，ROS）等會(huì)造成線粒體或其它細(xì)胞器的損傷。如果受損的細(xì)胞器沒(méi)有通過(guò)適應(yīng)性反應(yīng)得到處理，就會(huì)發(fā)生細(xì)胞死亡或者凋亡。而自噬就是一種適應(yīng)性反應(yīng)。Amir［9］等發(fā)現(xiàn)，在 LPS/D-GalN 誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中，抑制肝臟特異性自噬會(huì)加重TNF-α誘導(dǎo)的肝損傷；Ilyas等［10］在巨噬細(xì)胞特異性敲除Atg5模型中，用LPS/D-GalN注射，刺激急性肝損傷小鼠中發(fā)現(xiàn)敲除組小鼠肝損傷較對(duì)照組加重，依賴炎性小體產(chǎn)生的血清白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）顯著增加，提示敲除組小鼠炎癥小體活性增加，故加重了急性肝損傷。魏琳琳等［11］也發(fā)現(xiàn)，在LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠急性肝衰竭的早中期，肝細(xì)胞自噬逐漸增強(qiáng)，可能起保護(hù)性作用。以上研究均提示自噬參與LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷的調(diào)控，并在其中發(fā)揮保護(hù)作用。

目前觀察自噬現(xiàn)象最直接、最經(jīng)典的方法是通過(guò)透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)自噬體，這是自噬檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。而LC3和beclin 1是反映自噬水平的最常用的蛋白。LC3是重要細(xì)胞骨架輔助成分，分為L(zhǎng)C3-I和LC3-Ⅱ，自噬發(fā)生時(shí)LC3-I經(jīng)泛素樣加工，與自噬膜表面的脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ被募集并定位于自噬體膜上，直至自噬體和溶酶體相融合［5］。大量研究表明，beclin 1參與自噬體的形成，它能介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于自噬前體，在自噬中起重要作用。beclin還可調(diào)節(jié)液泡分選蛋白34（valuolar protein sorting 34，Vps-34），誘導(dǎo) beclin-Vps34-Vps15核心復(fù)合體形成，從而促進(jìn)自噬［12］。LC3和beclin 1表達(dá)水平的增高常提示自噬活性的增高，因此本研究選擇觀察這兩種蛋白來(lái)評(píng)估自噬水平。

我們的研究結(jié)果顯示，LPS/D-GalN可引起大鼠急性肝損傷，表現(xiàn)為ALT和AST的升高，病理?yè)p傷程度的加重，電鏡顯示自噬體有所增多，Western blot顯示自噬相關(guān)蛋白LC3和beclin 1的表達(dá)增強(qiáng)，自噬的增強(qiáng)可能與肝細(xì)胞的自我保護(hù)反應(yīng)有關(guān)；應(yīng)用姜黃素后，肝臟功能得到明顯改善，組織病理?yè)p傷程度減輕，提示姜黃素對(duì)肝臟起保護(hù)作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)自噬體進(jìn)一步增多，細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，提示肝組織中存在活躍的自噬；3-MA作為I型磷脂酰肌醇3激酶通路抑制劑，可抑制自噬的起始階段以及自噬小體的形成，應(yīng)用自噬抑制劑3-MA后，姜黃素的促進(jìn)自噬作用被其阻滯，其對(duì)肝臟的保護(hù)作用也隨之消失。這些結(jié)果表明，姜黃素可能通過(guò)激活自噬減輕LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷。

Zhao等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷中，自噬可降低促炎因子TNF-α、IL-6和IL-8的表達(dá)；而Liu等［14］發(fā)現(xiàn)，抑制自噬會(huì)使炎癥介質(zhì)IL-1β、TNF-α、IL-6等增加，減弱抗炎效應(yīng)；孫健等［15］的研究也提到，上調(diào)細(xì)胞自噬會(huì)抑制NF-κB蛋白的水平，增加其對(duì)炎癥細(xì)胞因子的抑制作用；而抑制自噬則導(dǎo)致NF-κB蛋白水平增加，并減弱其對(duì)炎癥細(xì)胞因子生成的抑制作用。以上研究均提示，自噬可能參與了對(duì)炎癥因子水平的調(diào)控過(guò)程。本研究中，姜黃素組自噬蛋白較AHE組增加，促炎因子TNF-α的表達(dá)水平顯著低于AHI組，而加入自噬抑制劑3-MA后則逆轉(zhuǎn)了姜黃素的作用，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

綜上所述，姜黃素對(duì)LPS/D-GalN誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷肝臟的保護(hù)作用可能與其促進(jìn)自噬減輕炎癥反應(yīng)相關(guān)，但仍需進(jìn)一步深入的研究。