SUMO特異性蛋白酶3通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)磷酸鈣誘導(dǎo)的小鼠腹主動(dòng)脈瘤形成*

陳 陽， 張永興， 倪煥爾， 李偉峰， 汪 芳

（上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，上海200080）

腹主動(dòng)脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）是腹主動(dòng)脈的永久性局部擴(kuò)張至正常腹主動(dòng)脈直徑的150%［1］。臨床AAA多發(fā)生在腎下動(dòng)脈處［2］；破裂性AAA及其導(dǎo)致的相關(guān)病理生理損害的死亡率超過80%［3］。目前除了手術(shù)修復(fù)，尚無藥物可以治療。因此，探究AAA的病理生理學(xué)調(diào)控機(jī)制，對(duì)于臨床腹主動(dòng)脈瘤的藥物防治靶點(diǎn)研發(fā)具有重要意義。

在AAA中，病理改變可見血管平滑肌細(xì)胞的凋亡和缺失、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)以及基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表達(dá)上調(diào)等引發(fā)彈性蛋白斷裂和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的降解［4］。單核-巨噬細(xì)胞是參與AAA免疫應(yīng)答重要的炎癥細(xì)胞，在特定的免疫微環(huán)境下，骨髓單核細(xì)胞（M0）可以分化為促炎的巨噬細(xì)胞（M1型）或抗炎的巨噬細(xì)胞（M2型）［5］。而MMPs和許多促炎癥反應(yīng)因子，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNFα）等，由M1型巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生，而M2型巨噬細(xì)胞則分泌抗炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）等。巨噬細(xì)胞M1/M2的失衡被認(rèn)為是AAA發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)［6］，同時(shí)也有研究報(bào)道巨噬細(xì)胞極化可以調(diào)控新生血管形成［7］。巨噬細(xì)胞在AAA免疫應(yīng)答中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［8］，因此調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的信號(hào)通路對(duì)于研究AAA發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

SUMO（small ubiquitin-related modifier）是一系列重要的類泛素蛋白，能對(duì)底物進(jìn)行翻譯后SUMO修飾（SUMOylation）［9］。SUMO 修飾是一個(gè)可逆過程，SUMO特異性蛋白酶家族（sentrin/SUMO-specific proteases，SENPs）能夠去除底物蛋白的SUMO修飾，或影響底物與其它蛋白質(zhì)的相互作用，從而影響底物的生物學(xué)效應(yīng)。有研究表明，SENP3敲除減少了脂多糖（lipolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR4）炎癥信號(hào)的激活和促炎因子的產(chǎn)生，提高小鼠存活率［10］。目前已有證據(jù)顯示TLR4炎癥信號(hào)的激活能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的極化，加重炎癥損傷［11-12］。此外，TLR4激活促進(jìn)AAA的調(diào)控關(guān)系也已被證明［13］。但SENP3在AAA病程中對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響尚不清楚。

本課題組構(gòu)建SENP3單核細(xì)胞特異性敲除的小鼠，并通過磷酸鈣（calciumphosphate，CaPO4）誘導(dǎo)的AAA動(dòng)物模型，探討SENP3通過影響巨噬細(xì)胞的功能在AAA發(fā)生發(fā)展中的作用，以期進(jìn)一步闡釋調(diào)控AAA發(fā)生和進(jìn)展的潛在機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

C57BL/6野生型（wild type，WT）小鼠購于上海斯萊克動(dòng)物公司。C57BL/6背景的Senp3flox/flox（以下簡(jiǎn)稱WT）小鼠由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究中心產(chǎn)生，與C57BL/6背景的Lyz2-Cre小鼠雜交產(chǎn)生Senp3flox/flox；Lyz2-Cre（SENP3單核細(xì)胞特異性敲除，即條件性敲除，conditioned knockout，cKO）小鼠。嚴(yán)格按照中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》中的規(guī)定進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，該方案已獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)［使用許可證號(hào)為SYXK（滬）2018-0027］，所有手術(shù)均在戊巴比妥鈉麻醉下進(jìn)行，并盡一切努力使動(dòng)物痛苦最小化。本研究選用SPF級(jí)cKO小鼠以及同窩出生的WT小鼠，雄性，8～12周齡，體重20～22 g。小鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料，溫度為（23±2）℃，濕度為50%±10%。

2 主要試劑

小鼠SENP3、β-actin、IL-1β和IL-6抗體購自Cell Signaling Technology；小鼠 CD206、CD86和 TNFα 抗體購自Abcam；小鼠MMP-9抗體購自Affinity；熒光素標(biāo)記的II抗（Alexa Fluor?488標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、Alexa Fluor?555標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、Alexa Fluor?488標(biāo)記的山羊抗兔IgG和Alexa Fluor?555標(biāo)記的山羊抗兔IgG）購自Invitrogen；生物素化羊抗小鼠IgG（1∶500）和生物素化羊抗兔IgG（1∶500）購自Jackson；免疫組化顯色試劑盒購自Vector Laboratories；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Gibco；鼠源巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）購自PeproTech；多聚甲醛購自Sigma；Western blot化學(xué)發(fā)光顯色劑購自中國(guó)上海圣爾生物科技有限公司；二水氯化鈣（calcium chloride dihydrate，CaCl2·2H2O）、磷 酸 鹽 緩 沖 液（phosphatebuffered saline，PBS）和Tween-20購自中國(guó)生工生物工程（上海）股份有限公司；TBS緩沖液購自上海索萊寶生物科技有限公司；二氫乙啶（dihydroethidium，DHE）染色液購自中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)有限公司；戊巴比妥購自Sigma。

3 主要方法

3.1 改良磷酸鈣誘導(dǎo)的小鼠腎下AAA模型 參照現(xiàn)有研究，相對(duì)于傳統(tǒng)CaCl2模型，改良方法依次使用CaCl2和PBS誘導(dǎo)產(chǎn)生動(dòng)脈瘤所需時(shí)間較短［14］。我們選用同窩出生、C57BL/6背景的8～12周齡雄性小鼠，按基因型分成2組：WT組（n=20）和cKO組（n=18）。小鼠在戊巴比妥（100 mg/kg）麻醉下，無菌環(huán)境里先用0.5 mol/L CaCl2浸泡的棉球包裹游離的腹主動(dòng)脈孵育10 min，隨后改用PBS浸泡的棉球孵育5 min。消毒紗布小心吸干殘余液體，用無菌生理鹽水沖洗腹腔，減少其余組織損傷，結(jié)扎出血點(diǎn)，關(guān)腹部縫合。造模時(shí)間為14 d。手術(shù)操作交由未知小鼠基因型與具體分組的人來完成。

3.2 實(shí)驗(yàn)小鼠標(biāo)本的收集、處理和保存 在術(shù)后第2周，戊巴比妥麻醉小鼠后剖腹，體式顯微鏡下小心暴露腹主動(dòng)脈，剝離腹主動(dòng)脈動(dòng)脈周圍筋膜和脂肪組織，游離升主動(dòng)脈至腹主動(dòng)脈髂總動(dòng)脈分叉處，游標(biāo)卡尺測(cè)此處動(dòng)脈直徑。部分標(biāo)本放入凍存管中存放于液氮罐中，用于提取組織RNA進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，以及提取組織蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。另一部分標(biāo)本在操作過程中小心保持形態(tài)完整，在4%多聚甲醛溶液中固定48 h，再分成兩部分：（1）其中一些標(biāo)本經(jīng)過常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋制成蠟塊，將蠟塊制成4～5μm厚的連續(xù)切片，供HE染色、Verhoeff-van Gieson（VVG）特殊染色及免疫組織化學(xué)染色；（2）另一些標(biāo)本用最優(yōu)切片溫度（optimum cutting temperature，OCT）包埋劑包埋，制成動(dòng)脈橫截面7 μm厚的連續(xù)冰凍切片，用于免疫熒光和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的DHE染色。

3.3 免疫組織化學(xué)染色法 石蠟切片置于60℃烘箱1 h，置于二甲苯I和二甲苯II中各15 min，再依次浸泡100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、75%乙醇和雙蒸水各5 min完成脫蠟。脫蠟后，石蠟切片置于抗原修復(fù)液（檸檬酸三鈉緩沖液，pH 6.0）中，95℃水浴修復(fù)6 min。PBS漂洗后封閉，經(jīng)I抗（兔抗小鼠SENP3多克隆抗體）4℃孵育過夜，生物素標(biāo)記的II抗（生物素化的羊抗兔IgG）室溫孵育2 h后在顯色液 A+B（1∶1）下孵育 1 h，DAB 顯色 5～10 min。適時(shí)終止后，經(jīng)梯度濃度乙醇脫水和二甲苯處理，用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察和拍照。

3.4 小鼠骨髓原代單核細(xì)胞（bone marrow-derived monocytes，BMDMs）的提取和誘導(dǎo) 小鼠麻醉后，脫頸處死，無菌條件下取小鼠下肢骨，DMEM培養(yǎng)基沖出骨髓，過40μm濾網(wǎng)，室溫下500×g離心5 min，去除上清液后用含10%FBS和30μg/L M-CSF的DMEM培養(yǎng)基重懸，接種到10 cm培養(yǎng)皿，7 d后細(xì)胞分化為M0，之后分別用來進(jìn)行M1極化誘導(dǎo)［100 μg/L LPS+50μg/L干擾素γ（interferonγ，IFNγ）處理24 h］和 M2 極化誘導(dǎo)（20 μg/L IL-4 處理 24 h）［6，15］。BMDMs置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱，隔天換液。

3.5 組織和細(xì)胞免疫熒光法 （1）組織免疫熒光：脫蠟步驟同3.4中所述，其余步驟與細(xì)胞免疫熒光步驟相似。（2）細(xì)胞免疫熒光：細(xì)胞用PBS清洗之后，迅速加含4%多聚甲醛的固定液，于4°C固定過夜；0.2%Triton X-100處理10 min，并用封閉液封閉1 h；CD86抗體（1.0 mg/L）4°C孵育過夜，次日用PBS洗3次后，熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶500）在室溫下進(jìn)行染色標(biāo)記，然后觀察。細(xì)胞圖像通過DM2500型熒光顯微鏡（Leica）拍照。

3.6 ROS的DHE染色法 DHE在ROS作用下脫氫后，可與RNA或DNA結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光。冰凍切片用PBS清洗3次，每次5 min后，按1∶100工作濃度用PBS稀釋配制DHE染色液，每個(gè)樣品滴加50μL工作液，室溫下避光孵育60 min。然后同樣用PBS清洗3次，每次5 min。熒光顯微鏡觀察（最大激發(fā)波長(zhǎng)為300 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為610 nm）。

3.7 組織RNA抽提和RT-qPCR檢測(cè) TRIzol一步法提取小鼠腹主動(dòng)脈瘤體組織中的RNA后，利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)樣品RNA濃度，并注意A260/A280是否在1.8～2.0范圍，以判斷RNA提取過程中是否有污染。之后按照TaKaRa的PrimeScript?RT reagent Kit使用說明書，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。qPCR按照TaKaRa SYBR?Premix Ex Taq?（Perfect Real Time）Kit說明書，在冰上將擴(kuò)增體系中的各組分充分混勻后，使用LightCycler?480型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)。采用兩步法熒光定量PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后檢查實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線是否正常，融解曲線是否為單峰。計(jì)算公式：ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參照（GAPDH）；ΔΔCt=ΔCt待測(cè)樣品-ΔCt對(duì)照樣品；相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。引物由中國(guó)生工生物有限公司負(fù)責(zé)合成，主要引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

3.8 蛋白提取和Western blot RIPA緩沖液提取來自主動(dòng)脈或細(xì)胞的蛋白。將主動(dòng)脈組織速凍在液氮中，在RIPA緩沖液中通過組織研磨破碎儀粉碎，冰上靜置40～60 min，12 000×g、4℃離心15 min。然后將上清液轉(zhuǎn)移到新EP管用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。BCA protein assay kit測(cè)定其蛋白濃度，再根據(jù)樣品蛋白濃度，按蛋白總量30～50μg范圍內(nèi)計(jì)算出上樣體積。Western blot檢測(cè)：組織蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，TBST緩沖液洗3次，每次5 min，然后加入I抗（SENP3、TNFα、IL-1β和MMP9抗體均為1∶1 000稀釋，β-actin抗體為1∶5 000稀釋）于4℃孵育過夜；次日，加入II抗（1∶10 000）于37℃孵育1 h；用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑顯影，顯影儀采用ImageQuant LAS4000（GEHealthcare）。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，采用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。兩組間符合正態(tài)分布的計(jì)量資料比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)，兩組間等級(jí)資料比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。兩個(gè)率或兩個(gè)構(gòu)成比的比較采用Fisher確切概率法，生存分析比較采用Mantel-Cox檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SENP3調(diào)控巨噬細(xì)胞極化

RT-qPCR結(jié)果顯示，SENP3 mRNA在M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)過程中表達(dá)升高（P＜0.01），但是M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)顯著降低（P＜0.01），見圖1A、B。細(xì)胞免疫熒光圖片中可見M1分化時(shí)細(xì)胞核內(nèi)SENP3蛋白表達(dá)升高，見圖1C。此外，在巨噬細(xì)胞受刺激由M1向M2型轉(zhuǎn)換時(shí)，SENP3的mRNA表達(dá)降低（P＜0.01），而在M2向M1型轉(zhuǎn)換時(shí)，SENP3的mRNA表達(dá)升高（P＜0.01），見圖1D、E。進(jìn)一步，細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，cKO小鼠和其同窩出生的WT小鼠的原代BMDMs在誘導(dǎo)M1分化過程中，cKO組M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物CD86表達(dá)低于WT組，與之對(duì)應(yīng)的是，誘導(dǎo)M2分化時(shí)cKO組M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物CD206表達(dá)則高于WT組，見圖1F。

Figure 1.SENP3 expression was up-regulated during M1 polarization and M1/M2 transformation.A and B：the BMDMs from wildtype（WT）mice were isolated，cultured and treated with M1 stimulation（100 μg/L LPS+50 μg/L IFNγ）（A）or M2 stimulation（20μg/L IL-4）（B）for 24 h，and the mRNA expression of SENP3 was detected by RT-qPCR；C：the BMDMs from WTmice were treated with M1 stimulation（100μg/L LPS+50μg/L IFNγ）or M2 stimulation（20μg/L IL-4）for 24 h，and immunofluorescence was conducted to analyze SENP3 protein expression（red：SENP3；blue：DAPI）；D：the BMDMs from WT mice were cultured in DMEM containing 100μg/L LPS+50μg/L IFNγfor 24 h，and then in DMEM containing 100μg/L LPS+50μg/L IFNγor 20μg/L IL-4 for another 24 h，and the mRNA expression of SENP3 was detected by RT-qPCR；E：the BMDMs from WT mice were cultured in DMEM containing 20μg/L IL-4 for 24 h，and then in DMEM containing 20μg/L IL-4 or 100μg/L LPS+50μg/L IFNγfor another 24 h，and the mRNA expression of SENP3 was detected by RT-qPCR；F：BMDMs isolated from WT and cKO mice were cultured and treated with M1 stimulation（100μg/L LPS+50μg/L IFNγ）or M2 stimulation（20μg/L IL-4）for 24 h，and the M1 marker or M2 marker was measured by immunofluorescence（red：CD206；green：CD86；blue：DAPI）.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs PBSgroup；##P＜0.01 vs LPS+IFNγ/LPS+IFNγ group；△△P＜0.01 vs IL-4/IL-4 group.圖1 巨噬細(xì)胞M1極化和M1/M 2轉(zhuǎn)化過程中SENP3表達(dá)上調(diào)

2 SENP3在改良磷酸鈣誘導(dǎo)的模型小鼠AAA組織中高表達(dá)

RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，SENP3在小鼠AAA組織中表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見圖2A、B。石蠟切片免疫組織化學(xué)染色顯示，AAA病灶組織內(nèi)膜、中膜層有缺失；SENP3陽性染色主要分布在中膜層細(xì)胞核及核周的部分胞質(zhì)內(nèi)，與對(duì)照組相比，陽性染色面積顯著增大（P＜0.05），見圖2C。

3 單核細(xì)胞SENP3特異性敲除抑制磷酸鈣誘導(dǎo)的小鼠A A A形成

Figure 2.SENP3 was up-regulated in the aorta tissue of mice with CaPO4-induced abdominal aortic aneurysm（AAA）.The AAA model was establshed in 8～12-week-old C57BL/6Jmice by administration with CaCl2 and PBSfor 14 d.A：SENP3 mRNA expression was measured by RT-PCR；B：SENP3 protein expression was measured by Western blot；C：representative immunohistochemical staining images for SENP3 in paraffin-embedded sections from aorta tissues were shown，and the SENP3 positive area was determined.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Con group.圖2 SENP3在CaPO 4誘導(dǎo)的小鼠腹主動(dòng)脈瘤中高表達(dá)

RT-qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，cKO小鼠BMDMs中，SENP3表達(dá)顯著降低（P＜0.01），見圖3A。cKO雄鼠和同窩出生的WT雄鼠AAA造模結(jié)果顯示，cKO小鼠腹主動(dòng)脈成瘤較小或無法形成AAA，見圖3B，相應(yīng)地，cKO組AAA造模小鼠生存率顯著高于WT組（P＜0.05），見圖3C。改良磷酸鈣法誘導(dǎo)的AAA中cKO小鼠AAA發(fā)生率顯著低于WT組（P＜0.05），見圖3D；WT小鼠中，磷酸鈣誘導(dǎo)的AAA主動(dòng)脈瘤體外部直徑和動(dòng)脈重/總體重比值均高于cKO組（P＜0.05），見圖3E、F。HE染色可見正常動(dòng)脈具備清晰、完整的彈力板層將內(nèi)、中、外膜分開，動(dòng)脈無異常擴(kuò)張，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞排列整齊；而造模后，WT組發(fā)生AAA的動(dòng)脈擴(kuò)張和增厚程度比cKO組嚴(yán)重，見圖3G。此外，VVG染色可見cKO組僅有少量或無內(nèi)彈性膜崩解及彈性纖維斷裂（黑色著色為彈性纖維），而WT組的彈性纖維斷裂更為嚴(yán)重，纖維斷裂等級(jí)數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05），見圖3G、H。

4 SENP3敲除抑制AAA的炎癥和氧化應(yīng)激

通過對(duì)AAA瘤體組織進(jìn)行RT-qPCR和Western blot檢測(cè)顯示，在磷酸鈣誘導(dǎo)下，WT組的主動(dòng)脈組織炎癥因子IL-1β、IL-6和TNFα的表達(dá)顯著高于cKO組，見圖4A～C。DHE染色檢測(cè)動(dòng)脈組織中的ROS水平，結(jié)果顯示：cKO組的主動(dòng)脈組織中氧化應(yīng)激水平低于WT組，見圖4D。

5 SENP3敲除抑制MMP-9表達(dá)上調(diào)所導(dǎo)致的ECM重構(gòu)

RT-qPCR、Western blot和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在cKO組瘤體內(nèi)MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)比WT組顯著下調(diào)，見圖5A～C。MMP-9陽性著色在細(xì)胞質(zhì)中，瘤體的病灶中伴隨著大量浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞和破損的血管平滑肌細(xì)胞，而cKO組的中膜層相對(duì)完整，在MMP-9高表達(dá)的相應(yīng)部位，對(duì)應(yīng)WT組瘤體動(dòng)脈中膜的彈力板層破壞更為嚴(yán)重，見圖5C。

6 SENP3介導(dǎo)MKK7 de-SUMO修飾調(diào)控JNK通路和MMP-9表達(dá)

Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞MKK7的SUMO2/3修飾在誘導(dǎo)M1分化的過程中減少（圖6A），而MKK7與SENP3的相互作用增強(qiáng)（圖6B）；在轉(zhuǎn)染Flag-MKK7野生型（Flag-MKK7 WT）和SUMO修飾位點(diǎn)K18突變體（Flag-MKK7 K18Rmutant）后誘導(dǎo)BMDMs進(jìn)行M1極化，結(jié)果顯示，后者p-JNK和MMP-9水平均高于前者，見圖6C、D。

討 論

1 SENP3介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M 1極化促進(jìn)AAA發(fā)生和進(jìn)展

哺乳動(dòng)物體內(nèi)目前共發(fā)現(xiàn)有7種SENPs，其中SENP3對(duì)氧化應(yīng)激最為敏感［16-17］，主要介導(dǎo)底物蛋白的去除SUMO2/3修飾（de-SUMO2/3修飾），在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和炎癥細(xì)胞的激活中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，在免疫應(yīng)答條件下巨噬細(xì)胞極化成M1型，線粒體中大量生成ROS，在氧化應(yīng)激環(huán)境下分泌釋放大量的炎癥因子，放大炎癥損傷［5］。本研究表明SENP3在巨噬細(xì)胞M1/M2極化時(shí)存在表達(dá)差異，并且敲除SENP3能改變M1/M2巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)分布，這提示SENP3也參與調(diào)控巨噬細(xì)胞M1和M2表型轉(zhuǎn)換。人類外周血單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，AAA與非AAA外周動(dòng)脈疾病的患者之間，巨噬細(xì)胞的蛋白和基因表達(dá)譜存在顯著差異，其中差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì)富集在與AAA相關(guān)的ECM重塑和炎癥等方面，表明單核-巨噬細(xì)胞譜系在AAA的ECM重塑或炎癥過程具有重要作用［18］。在體外，cKO小鼠的M0受刺激后發(fā)生M1極化的比例降低，而在磷酸鈣誘導(dǎo)的腹主動(dòng)脈瘤小鼠模型中，SENP3敲除能夠有效降低AAA的氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)和ECM重塑，從而導(dǎo)致AAA發(fā)病減少和小鼠存活率的升高。以上結(jié)果表明，SENP3介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1極化可促進(jìn)AAA發(fā)生和進(jìn)展。

Figure3.Monocyte-specific SENP3 knockout protectsed mice from CaPO4-induced AAA.A：SENP3 expression in abdominal aorta tissue was measured by RT-qPCR and Western blot；B：representative images of mouse abdominal aorta tissue in 8～12-week-old cKO male mice（n=6）and WT littermates（n=6）administered with CaCl2 and PBSfor 14 d（the arrowhead indicates typical aneurysm）；C：Kaplan-Meier survival curves（WT：n=20；cKO：n=15）；D：incidences of AAA in animal model；E：quantification analysis for maximal external diameters of abdominal aortas in animal model；F：total wet weight of abdominal aorta per body weight in animal model；G：HE and VVG staining for paraffin-embedded section of AAA tissue in animal model；H：grade of elastic degradation.Unpaired two-tailed t-test was used for statistical analysis in A，Eand F，and Mann-Whitney U test was used in H.Two-sided Fisher's exact test was used to compare variables in D.Statistical significance on Kaplan-Meier curves（C）was assessed with Mantel-Cox test.Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs WTgroup.圖3 單核細(xì)胞SENP3特異性敲除減少CaPO4誘導(dǎo)的小鼠腹主動(dòng)脈瘤形成

2 SENP3促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)并調(diào)控ECM的機(jī)制

Figure 4.Monocyte-specific SENP3 knockout inhibited the flammation and oxidative stress in AAA.A，Band C：the mRNA and protein levels of inflammatory cytokines（IL-1β，IL-6 and TNFα）in the aorta tissues of WT and cKO mice were detected by RT-qPCR and Western blot；D：in situ dihydroethidium（DHE）staining for ROSproduction in the frozen sections of the aorta tissues from WT and cKOmice.Unpaired two-tailed t-test was used for statistical analysis in A，B and C.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs WTgroup.圖4 單核細(xì)胞SENP3特異性敲除抑制AAA的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)

Figure 5.Monocyte-specific SENP3 knockout inhibited MMP-9-induced ECM remodeling.A：the mRNA level of MMP-9 was measured by RT-qPCR；B：the protein level of MMP-9 was measured by Western blot；C：immunohistochemical staining for MMP-9 in paraffin-embedded sections fromaorta tissues.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs WTgroup.圖5 單核細(xì)胞SENP3特異性敲除抑制MMP-9介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)

SENP3及其介導(dǎo)的de-SUMO修飾在單核-巨噬細(xì)胞分化和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。SUMO蛋白酶SENP3在小鼠炎癥性休克模型中可以激活TLR4下游MAPK/AP-1通路，正向調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，而SENP3敲除則顯著抑制了這一過程，提高了小鼠炎癥損傷后的存活率［10］。我們的研究結(jié)果表明相，磷酸鈣誘導(dǎo)的AAA病灶中有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，SENP3介導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1極化發(fā)揮促炎作用從而加重AAA。研究表明，鈣離子可誘導(dǎo)主動(dòng)脈中層平滑肌細(xì)胞凋亡和彈性蛋白降解，刺激單核-巨噬細(xì)胞遷移趨化，并促進(jìn)炎癥因子表達(dá)分泌［19-20］。M1型巨噬細(xì)胞的MMPs（MMP-9最具代表性）表達(dá)上調(diào)，能夠降解和破壞中層彈性纖維板以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原，反映病情進(jìn)展。病灶處炎癥損傷-修復(fù)過程ECM的主動(dòng)病理性重構(gòu)依賴于MMPs的分泌和活化，大量降解動(dòng)脈中層的主要應(yīng)力結(jié)構(gòu)——彈力蛋白。同時(shí)，炎癥細(xì)胞對(duì)組織的浸潤(rùn)和相關(guān)炎癥因子表達(dá)上調(diào)會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的MMPs進(jìn)一步表達(dá)，加重彈力蛋白的降解，從而引發(fā)破壞-重塑惡性循環(huán)，促進(jìn)AAA的形成和動(dòng)脈瘤體破裂。我們構(gòu)建的小鼠模型表明，單核細(xì)胞SENP3敲除顯著減輕了這種炎癥級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，延緩AAA的疾病進(jìn)展。

Figure 6.SENP3 mediated MKK7 de-SUMO modification to regulate JNK pathway and MMP-9 expression.A：BMDMs treated with or without LPS（100 μg/L）and IFNγ（50μg/L）for 48 h were collected，and endogenous MKK7 conjugated with SUMO2/3 was detected by co-immunoprecipitation（Co-IP）；B：BMDMs were treated with LPS（100 μg/L）and IFNγ（50 μg/L）for 30 min，and the interaction of endogenous SENP3 and MKK7 was determined by Co-IP；C and D：BMDMs were transfected with Flag-tagged MKK7 WT or SUMOless mutant K18R and incubated with or without LPS（100 μg/L）and IFNγ（50μg/L）for the indicated time，and then p-JNK，JNK and MMP-9 were determined by immunoblotting（IB）.*：non-specific bands.圖6 SENP3通過介導(dǎo)MKK 7的de-SUMO修飾調(diào)控JNK通路和MMP-9表達(dá)

這些研究也揭示了不同炎癥環(huán)境下的單核-巨噬細(xì)胞系中SUMO修飾底物和多種調(diào)控機(jī)制，為我們深入了解單核-巨噬細(xì)胞譜系中轉(zhuǎn)錄因子的翻譯后調(diào)控機(jī)制提供了充分的證據(jù)。目前尚無研究表明MMP-9能被SUMO化修飾，SUMO修飾功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)（http：//www.jassa.fr/）也同樣表明，MMP-9沒有可能的SUMO修飾位點(diǎn)。因此，巨噬細(xì)胞MMP-9合成增多可能是SENP3調(diào)控的效應(yīng)分子和終末環(huán)節(jié)。SENP3作為一種de-SUMO蛋白酶，主要功能是對(duì)底物蛋白進(jìn)行翻譯后de-SUMO修飾，降低底物蛋白的SUMO2/3水平，從而影響底物蛋白的功能及活性。我們課題組前期研究表明，SENP3通過介導(dǎo)MKK7 de-SUMO修飾調(diào)控JNK/c-Jun通路，從而參與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)［10］。我們現(xiàn)有的研究證據(jù)也表明SENP3作用于AAA疾病的機(jī)制在于de-SUMO調(diào)控MKK7及MAPK/JNK通路，進(jìn)而促進(jìn)MMP-9合成和分泌，最終導(dǎo)致ECM重構(gòu)的病理學(xué)改變。未來我們將進(jìn)一步通過Co-IP實(shí)驗(yàn)鑒定SENP3及其介導(dǎo)的de-SUMO2/3在氧化應(yīng)激以及CaPO4誘導(dǎo)的AAA中的其他作用底物。此外，其他類型細(xì)胞如平滑肌細(xì)胞的凋亡和增殖異常，以及內(nèi)皮細(xì)胞參與的新生血管形成［7］等，在AAA形成中也發(fā)揮了重要作用，我們將在接下來的工作中繼續(xù)開展相關(guān)研究。