日本沼蝦養(yǎng)殖過程中氨基脲存在特征研究

舒秀君，程 波，徐娟娟，熊貽偉，宋 蓓，宋 懌，韓 剛，蔣速飛

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100141； 3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫 214081)

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)又名青蝦或河蝦，隸屬十足目(Decapoda)長臂蝦科(Palaemonidae)沼蝦屬(Macrobrachium)。在我國，日本沼蝦廣泛分布于江河、湖泊、池塘、河溝中，是我國淡水經(jīng)濟(jì)蝦中的主要種類之一。隨著日本沼蝦在我國養(yǎng)殖和消費(fèi)數(shù)量的增加，其產(chǎn)品的安全性也受到更多關(guān)注[1]。

氨基脲(Semicarbazide，SEM)是禁用藥物呋喃西林的主要代謝產(chǎn)物之一[2]。目前，國內(nèi)外均以檢測SEM判斷是否在養(yǎng)殖過程中非法使用呋喃西林，其中，歐盟和我國將動(dòng)物源性食品中SEM殘留的限量標(biāo)準(zhǔn)定為1.0 μg/kg[3，4]。研究表明，SEM來源廣泛[2，5-11]，且SEM可能是甲殼類水產(chǎn)品中的內(nèi)源性物質(zhì)[12-16]，以SEM作為判定甲殼類水產(chǎn)品是否非法使用呋喃西林藥物的監(jiān)測指標(biāo)并不合適[1，2，14-15，17-19]。有關(guān)甲殼類水產(chǎn)品中SEM的本底含量已有相關(guān)研究[1-2，4，18]，但大多限于個(gè)別樣品普查，且僅限于甲殼和肌肉2種組織[2，10-11，14-15]，而養(yǎng)殖生長過程中甲殼類動(dòng)物體內(nèi)SEM的存在特征、動(dòng)態(tài)變化過程鮮有報(bào)道，養(yǎng)殖產(chǎn)品中SEM的科學(xué)監(jiān)管依據(jù)不足。因此，本實(shí)驗(yàn)以日本沼蝦作為研究對象，測定池塘養(yǎng)殖日本沼蝦不同生長時(shí)期SEM的存在特征與變化規(guī)律，以期為甲殼類水產(chǎn)品SEM限量標(biāo)準(zhǔn)的修訂和產(chǎn)地水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督抽查的科學(xué)實(shí)施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、養(yǎng)殖條件與管理

實(shí)驗(yàn)于2018年7-9月在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心大浦基地進(jìn)行。隨機(jī)選定其中一個(gè)池塘(面積32 000 m2，水深1.2 m)，2017年底在該池塘投放日本沼蝦“太湖1號”親蝦，2018年5月開始自然繁殖并孵化出蚤狀幼體，隨后在池塘中自然生長。生產(chǎn)管理上，5月份蚤狀幼體階段主要采用潑灑豆?jié){等肥水方法培養(yǎng)輪蟲等天然餌料；6月份大部分蚤狀幼體變態(tài)為幼蝦時(shí)，開始投喂日本沼蝦0號顆粒飼料(南通正大)，每日2次；隨著日本沼蝦的生長，8月份改投喂日本沼蝦1號顆粒飼料(江蘇冠乾)，每日2次，養(yǎng)殖過程持續(xù)到9月底。養(yǎng)殖生產(chǎn)期間，不使用任何含呋喃西林成分藥品。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

考慮日本沼蝦組織取樣的可行性，本研究以日本沼蝦約達(dá)稚蝦規(guī)格階段開始作為起始點(diǎn)，將2018年7月1日采集的第一批日本沼蝦定義為本研究初始，即0 d樣品，陸續(xù)從養(yǎng)殖池塘每隔10 d拖網(wǎng)采集一次日本沼蝦，依次類推定義為10、20、30、40、50、60、70 、80 d樣品，樣品采集過程覆蓋日本沼蝦幼蝦至成蝦的主要養(yǎng)殖生長階段。每次采集約1 kg日本沼蝦，共采集9個(gè)批次。樣品采集后，在冷藏條件下6 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并于當(dāng)天隨機(jī)選擇30尾進(jìn)行體長和體重測量。

所有樣品用純水沖洗干凈后進(jìn)行解剖，分別采集不同組織，其中前4次日本沼蝦樣品(即0～30 d)因個(gè)體較小，僅采集肌肉、甲殼和頭胸部3種組織，后4次日本沼蝦樣品(即40～80 d)分別采集肌肉、甲殼、附肢、肝胰腺、鰓和眼柄6種組織。所采集的肌肉、甲殼、附肢和頭胸部樣品用粉碎機(jī)(九陽 JYL-C010)充分破碎，肝胰腺和鰓樣品置于離心管中用剪刀充分剪碎，眼柄樣品用研缽充分磨碎，分別制成均質(zhì)樣品后，在-20 ℃冷凍條件下保存待測。

1.3 SEM的測定

樣品中SEM的測定采用參照農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006《水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》優(yōu)化后的方法[20]，進(jìn)行總SEM(游離態(tài)SEM和結(jié)合態(tài)SEM之和)和游離態(tài)SEM的含量測定。每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣。池塘水體和養(yǎng)殖飼料經(jīng)檢測，均不含SEM成分。

1.4 方法檢出限與質(zhì)量控制

通過加標(biāo)回收的方式，進(jìn)行質(zhì)量控制。根據(jù)SEM在日本沼蝦各組織中的本底含量，添加水平為1.0～120 μg/kg。各組織中總SEM和游離SEM回收率在74.3%～113.5%之間，方法檢出限為0.25 μg/kg(S/N≥3)，定量限為0.5 μg/kg(S/N≥10)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長時(shí)期日本沼蝦的體重和體長

實(shí)驗(yàn)期間日本沼蝦的平均體重和體長情況如圖1所示。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，日本沼蝦平均體重為(0.41±0.19)g，體長為(3.31±0.59)cm，隨著養(yǎng)殖過程進(jìn)行，體重和體長整體呈現(xiàn)增長趨勢，且在第3～6次采樣期間生長速度最快。實(shí)驗(yàn)后期，生長速度相對放緩。在最后一次采樣時(shí)，日本沼蝦的平均體重為(2.16±0.66)g，體長為(6.00±0.52)cm。

圖1 實(shí)驗(yàn)期間日本沼蝦體重和體長變化情況Fig.1 Variations of mean body weigth and mean body length of M.nipponense during the experiment

2.2 不同生長時(shí)期日本沼蝦各組織中總SEM含量水平及分布特征分析

不同生長時(shí)期日本沼蝦各組織中總SEM含量結(jié)果見表1。由表1可見，日本沼蝦在80 d養(yǎng)殖不同采樣時(shí)期內(nèi)，肌肉中均存在總SEM，含量范圍為(6.88±0.15)～(17.11±0.62)μg/kg。隨著生長過程進(jìn)行，肌肉中總SEM含量逐漸降低，從初始最高值(17.11±0.62)μg/kg降低至70 d時(shí)最低值(6.88±0.15)μg/kg，在第80 d含量略有回升。甲殼中均存在總SEM，含量范圍為(107.30±1.10)～(306.09±8.69)μg/kg。隨著生長過程進(jìn)行，甲殼中總SEM含量呈現(xiàn)總體上升局部下降的變化趨勢，實(shí)驗(yàn)前10 d內(nèi)降低至最低值(107.30±1.10)μg/kg，隨后逐漸升高，在第30 d波動(dòng)較大，40～80 d持續(xù)上升并在80 d達(dá)最大值。實(shí)驗(yàn)期間前30 d內(nèi)頭胸部中均存在總SEM，含量范圍為(100.29±1.21)～(116.15±2.67)μg/kg，波動(dòng)幅度較小。第40～80 d內(nèi)，附肢、眼柄、鰓和肝胰腺中均存在總SEM，其中，附肢中含量范圍為(243.90±8.55)～(532.31±26.27)μg/kg，隨著養(yǎng)殖過程進(jìn)行，含量逐漸增加并在80/表示無樣品。

表1 不同生長時(shí)期日本沼蝦中總SEM的含量水平Tab.1 Concentration of total SEM in M.nipponense of different growth stages

d達(dá)最大值；眼柄中含量范圍為(85.27±3.19)～(122.82±2.60)μg/kg，隨著養(yǎng)殖過程進(jìn)行，含量呈現(xiàn)整體增加局部波動(dòng)的變化趨勢；鰓中含量范圍為(48.43±2.13)～(85.60±1.33)μg/kg，隨著養(yǎng)殖過程的進(jìn)行，含量在第60 d時(shí)小幅增加，70 d時(shí)明顯下降并達(dá)到最小值，80 d時(shí)又明顯上升并達(dá)最大值；肝胰腺中含量范圍為(13.51±1.15)～(25.94 ±1.78)μg/kg，隨著養(yǎng)殖過程進(jìn)行，在40～60 d期間肝胰腺中總SEM含量逐漸增加，在70 d時(shí)下降并達(dá)到最小值，80 d時(shí)又明顯增加。

由表1可知，在0～30 d內(nèi)，甲殼、頭胸部和肌肉中總SEM的平均含量分別為(174.04±57.04)、(109.86±6.68)和(15.56±1.79)μg/kg，日本沼蝦幼蝦各組織中總SEM呈現(xiàn)：甲殼>頭胸部>肌肉的含量分布特征。在40～80 d內(nèi)，附肢、甲殼、眼柄、鰓、肝胰腺和肌肉中總SEM的平均含量分別為(377.16±102.09)、(249.36±42.56)、(97.03±14.18)、(59.86±14.66)、(20.39±4.87)和(9.67±1.58)μg/kg，日本沼蝦成蝦各組織中總SEM呈現(xiàn)：附肢>甲殼>眼柄>鰓>肝胰腺>肌肉的含量分布特征。

2.3 日本沼蝦各組織中SEM的存在形態(tài)

如圖2所示，不同生長時(shí)期日本沼蝦肌肉和肝胰腺中SEM主要以游離態(tài)形式存在，游離態(tài)SEM在肌肉中所占比例為45.84%～83.51%，在肝胰腺中所占比例為56.99%～92.47%。甲殼、眼柄、附肢、頭胸部和鰓等組織中SEM主要以結(jié)合態(tài)形式存在，結(jié)合態(tài)SEM在甲殼中所占比例為85.01%～92.79%；在眼柄中所占比例為85.36%～90.34%；在附肢中所占比 例為83.55%～89.79%；在頭胸部中所占比例為75.46%～88.40%；在鰓中所占比例為68.01%～78.29%。

圖2 不同生長時(shí)期養(yǎng)殖日本沼蝦各組織的SEM形態(tài)組成Fig.2 SEM composition of tissues of cultured M.nipponense from different growth stages

3 討論

3.1 不同生長時(shí)期日本沼蝦中SEM的含量水平及其變化特征

水產(chǎn)品中SEM殘留通常認(rèn)為是在養(yǎng)殖過程中非法使用呋喃西林后代謝產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示，養(yǎng)殖過程不同時(shí)期日本沼蝦中均檢出SEM，且含量均超過我國限量要求(1.0 μg/kg)。養(yǎng)殖過程中無人為使用硝基呋喃類禁用藥物的行為，池塘水體和所用飼料經(jīng)檢測均不含SEM成分，但日本沼蝦中SEM含量超標(biāo)，這與前人研究結(jié)果一致[2,4,14-15,18,20]。

本研究中日本沼蝦肌肉、甲殼和頭胸部總SEM的含量范圍與于慧娟等[2]和Hui等[1]研究結(jié)果一致，但與王鼎南等[4]和宋蓓等[20]結(jié)果有所差異，可能與不同研究所采集樣本處于不同生長時(shí)期有關(guān)。日本沼蝦在養(yǎng)殖過程中具有不斷繁殖的生物學(xué)特性，在不同時(shí)間點(diǎn)采樣，采集到不同批次孵化日本沼蝦的可能性較大，從而對實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定影響。隨著養(yǎng)殖過程的進(jìn)行，日本沼蝦各組織中總SEM含量變化無明顯規(guī)律。其中，肌肉中總SEM含量逐漸降低，且在20～50 d之間降低速度最快，可能與日本沼蝦肌肉生長有關(guān)。在此期間日本沼蝦體重增長最快，而體重增長最主要貢獻(xiàn)來自于肌肉增長，導(dǎo)致SEM含量被“稀釋”而降低。甲殼中總SEM含量逐漸增加，并在40 d時(shí)明顯降低，這可能與日本沼蝦蛻皮過程有關(guān)。在此期間日本沼蝦體重和體長增長最快，而日本沼蝦的生長必然伴隨蛻皮過程，但甲殼中SEM是否會(huì)隨著蛻皮而排出體外，或SEM在蛻皮過程中是否發(fā)揮了某種生物學(xué)作用，值得進(jìn)一步研究。附肢中總SEM含量在實(shí)驗(yàn)40～80 d期間變化規(guī)律與甲殼中變化規(guī)律較為一致，可能與附肢主要由甲殼和肌肉組成，而甲殼中含量遠(yuǎn)高于肌肉，因此，甲殼中SEM含量變化特征主導(dǎo)了附肢中SEM含量變化的結(jié)果。

3.2 不同生長時(shí)期養(yǎng)殖日本沼蝦中SEM的含量分布特征與存在形態(tài)

在實(shí)驗(yàn)0～30 d內(nèi)，養(yǎng)殖日本沼蝦幼蝦各組織中總SEM呈現(xiàn)：甲殼>頭胸部>肌肉的含量分布特征，這與Hui等[1]的研究結(jié)果一致。在實(shí)驗(yàn)40～80 d內(nèi)，養(yǎng)殖日本沼蝦成蝦各組織中總SEM呈現(xiàn)：附肢>甲殼>眼柄>鰓>肝胰腺>肌肉的含量分布特征，附肢中總SEM平均含量最高，這與課題組前期探索研究不一致[20]。按照結(jié)構(gòu)組成，附肢主要由甲殼和肌肉等組成，總SEM在附肢中的含量應(yīng)介于甲殼和肌肉之間，為何附肢中含量最高，有待進(jìn)一步深入研究。彭婕等[21]對中華絨螯蟹不同組織中SEM進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)除蟹殼外，肌肉、肝胰腺、鰓及性腺中均無SEM檢出。于慧娟等[2]對三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)、鋸緣青蟹(Scyllaserrata)、珍寶蟹(DungenessCrab)、中國鱟(Tachypleustridentatus)等甲殼類動(dòng)物的研究中，也僅在甲殼中檢測出不同含量SEM成分?？梢?，SEM在不同甲殼動(dòng)物中分布特征不同，但甲殼均是SEM存在與含量較高的組織。

在形態(tài)組成上，SEM在日本沼蝦肌肉和肝胰腺中主要以游離態(tài)形式存在，游離態(tài)SEM所占平均比例分別為67.35%和72.40%，在甲殼、眼柄、附肢、頭胸部和鰓中主要以結(jié)合態(tài)形式存在，結(jié)合態(tài)SEM所占平均比例分別為89.50%、87.16%、85.68%、80.48%和73.30%。肌肉和甲殼中SEM的存在形態(tài)與王鼎南等[4]和Christof等[14]的研究結(jié)果一致，而眼柄、附肢、頭胸部和鰓等組織，此為第一次報(bào)道，缺乏可比較研究。另外，由于日本沼蝦肌肉中SEM含量相較其他組織含量最低，且主要以游離態(tài)形式存在，本研究選擇了前期研究[20]優(yōu)化的SEM檢測方法，通過測量含量相對較高的游離態(tài)SEM方法，而非直接檢測含量處于檢測限的結(jié)合態(tài)SEM，從而進(jìn)行SEM形態(tài)分析，最大程度避免了因檢測含量低導(dǎo)致檢測誤差或檢不出的問題。