施氏鱘促卵泡激素受體基因cDNA的克隆、表達及調(diào)控

高 雪，韓世成，馬 波，呂偉華，王念民，張 穎

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070； 2.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306)

與脊椎動物相似，促性腺激素釋放激素(GnRH)、促性腺激素(GtHs)和性腺類固醇激素作為生殖相關(guān)的關(guān)鍵激素，主要通過下丘腦-垂體-性腺軸來參與魚類的生殖調(diào)控[1]。在調(diào)控過程中，GnRH誘導(dǎo)垂體合成并釋放促卵泡激素(FSH)和促黃體激素(LH)[2]，F(xiàn)SH和LH分泌到血流中，并通過與細(xì)胞表面上的同源受體GtHRs結(jié)合而協(xié)同參與體內(nèi)重要的生理過程，該特定的結(jié)合受體主要存在于硬骨魚的性腺中，參與誘導(dǎo)類固醇的分泌和配子的發(fā)生[3,4]。促卵泡激素受體(follicle-stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)屬于視紫紅質(zhì)類A家族的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族的一員[5]，目前為止，已經(jīng)在大馬哈魚(Oncorhynchusrhodurus)、鯰(Silurusasotus)、斑馬魚(Daniorerio)和日本鰻(Anjuillajaponica)等多種硬骨魚中克隆得到FSHR基因[6-9]，并進行了組織表達的研究，發(fā)現(xiàn)Gthr基因主要在性腺中表達，這種有限的組織分布強調(diào)了這兩種糖蛋白激素在脊椎動物性腺生理調(diào)節(jié)中的重要性[10,11]。在成熟的鮭魚中，發(fā)現(xiàn)FSHR定位于雌性鮭魚的包膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，以及雄性鮭魚精子囊周圍的細(xì)胞[12]，直接參與了生殖細(xì)胞的生長和發(fā)育。此外，在日本鰻鱺[13]和非洲鯰魚[14]的間質(zhì)細(xì)胞中也檢測到FSHR基因的表達，該細(xì)胞定位與兩種促性腺激素在成熟魚類中分泌的類固醇生成物一致。除了在激素生成調(diào)控中的作用，對生殖周期中FSHR基因性腺表達譜的分析表明，它們參與了魚類配子生成的關(guān)鍵時期，在金錢魚、歐洲鱸和黃顙魚等魚類中已得到證實[15]。

施氏鱘(Acipenserschrenckii)主要分布在黑龍江、烏蘇里江和松花江等地，是我國北方重要的淡水魚類，具有很高的經(jīng)濟價值，尤其是魚卵價值更高，有“黑色珍珠”的美譽[16]。目前，我國已是世界上最大的鱘魚養(yǎng)殖國與魚子醬出口國，養(yǎng)殖產(chǎn)量占世界產(chǎn)量的85%以上。施氏鱘性成熟晚，不具有副性征，外表難以區(qū)分雌雄性別，繁殖生物學(xué)研究的空白很多[17]。目前，國內(nèi)外對施氏鱘生長繁育方面的研究比較少，有關(guān)施氏鱘性腺發(fā)育尤其是早期配子形成的分子機制還未闡明，因此開展其分子機理的研究具有重要意義。本研究以施氏鱘為實驗材料，采用RACE技術(shù)克隆得到施氏鱘FSHR基因，分析其序列特征和系統(tǒng)進化關(guān)系，研究其時空表達特征，為進一步闡明FSHR的生理功能和分子機制奠定基礎(chǔ)，同時也為施氏鱘早期生殖調(diào)控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及分組

實驗選用中國水產(chǎn)科學(xué)研究院鱘魚工程繁育中心同一批次90日齡的施氏鱘，共160尾，魚體質(zhì)量為38～55 g，體長201～266 mm。實驗試劑為促黃體激素釋放激素激動劑LHRH-A(GnRH的類似物)，按不同注射劑量組(未注射、1 μg/kg 、3 μg/kg 、5 μg/kg)進行隨機分組，每組40尾，注射后，各組分別于四個時間點(1 d、3 d、5 d和7 d)取性腺和垂體，每個時間點取9尾，每三尾混合作為一個樣，共三個平行，用液氮迅速冷凍樣品，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。另取體重(4.8±2.23)kg的施氏鱘，取其心、腎、脾、腸、鰓、腦及卵巢等組織，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

采用總RNA提取試劑盒(Promega)提取總RNA，按照說明書進行操作。用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，超微量核酸蛋白測定儀(Thermo Scientific美國)測定RNA濃度，暫存于-80 ℃保存。以含量為1.5 μg的總RNA為模板，按照GoScriptTM Reverse Transcription Mix，Oligo DT (Promega)和SMARTTM Race cDNA試劑盒(Clontech)的說明書，分別反轉(zhuǎn)錄合成cDNA和Race cDNA第一鏈，稀釋10倍后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 FSHR全長cDNA序列的獲得

采用同源克隆的方法，根據(jù)小體鱘FSHR基因的cDNA序列，GenBank登錄號為(ANT47399.1)，在保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計核心引物，引物由吉林庫美生物技術(shù)公司合成(表1)。以施氏鱘成熟期性腺cDNA為模板，使用2×Es Taq MasterMix (CWBIO)進行PCR擴增，反應(yīng)體系為20 μL，PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)，終延伸72 ℃ 5 min。1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(CWBIO)對目的片段進行切膠回收，純化片段連接到pMD18-T (TaKaRa)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(DH5α)感受態(tài)細(xì)胞，在含Amp的LB平板上37 ℃培養(yǎng)過夜，經(jīng)菌落PCR鑒定，挑選陽性克隆送吉林省庫美生物科技有限公司測序。根據(jù)已經(jīng)獲得的中間片段分別設(shè)計5′RACE和3′RACE的內(nèi)外側(cè)特異性引物(表1)，以RACE cDNA第一鏈為模板，用引物UPM和FSHR外側(cè)引物進行第一輪擴增，隨后以第一輪PCR產(chǎn)物的稀釋液為模板，用NUP和FSHR內(nèi)側(cè)引物進行第二輪擴增。反應(yīng)程序按照SMARTer?RACE 5′/3′Kit (TaKaRa，clontech)試劑盒的說明書設(shè)定。膠回收、連接、轉(zhuǎn)化及測序如上所述。

1.4 施氏鱘FSHR基因的序列分析

用SeqMan對FSHR基因的中間序列和3′ RACE、5′ RACE末端進行全長拼接；使用DNAMAN 8.0軟件查找開放閱讀框(ORF)并將其推導(dǎo)為氨基酸序列，應(yīng)用NCBI中BLAST程序?qū)π蛄羞M行比對；利用Clustal X和Mega 7.0鄰接法(Neighbour-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；使用專業(yè)蛋白在線分析系統(tǒng)(Expert Protein Analysis System，Ex PASy)分析該蛋白基本物理化學(xué)參數(shù)、信號肽及修飾位點；利用NetNGlyc1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)預(yù)測N端糖基化位點。利用在線工具TMHMMServer 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)對蛋白的跨膜區(qū)域進行預(yù)測。

1.5 熒光定量PCR

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，根據(jù)已獲得的cDNA全長序列設(shè)計熒光定量PCR特異性引物，以β-actin基因設(shè)計內(nèi)參引物(表1)，采用半定量RT-PCR和qRT-PCR法，檢測FSHR 基因mRNA在雌性施氏鱘各組織中表達情況及GnRH激動劑對FSHR基因表達的影響。熒光定量PCR儀使用ABI 7500 (Applied Biosystems，USA)，熒光試劑使用SYBRPremix Ex Taq (Takara，II 中國大連)，按說明書進行實驗。結(jié)果采用2-ΔΔCT方法計算相對表達量，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。為確保實驗的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，每個樣品設(shè)3次重復(fù)。用SPSS進行單因素方差分析和Duncan多重比較，顯著性水平設(shè)為P<0.05。

表1 實驗所用引物及序列Tab.1 Names and sequences of primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 施氏鱘FSHR基因全序列克隆和分析

使用三對核心序列引物和3′端與5′端非翻譯區(qū)特異性RACE引物擴增得到施氏鱘FSHR基因cDNA序列全長2 696 bp，包括5′端非編碼區(qū)(5′ UTR，102 bp)，開放閱讀框(ORF)1 986 bp以及3′端非編碼區(qū)(3′ UTR，608 bp)，共編碼661個氨基酸。預(yù)測施氏鱘FSHR蛋白質(zhì)的分子量為75.02 kD，理論PI值為8.35，亮氨酸Leu的含量最高，為12.9%。疏水性分析結(jié)果顯示， FSHR疏水性平均值為正值0.289，屬于疏水性蛋白質(zhì)。此蛋白具有典型的G蛋白偶聯(lián)受體家族的結(jié)構(gòu)FSVyT LTVITLERWHtI，位于428～444aa。該氨基酸序列包含339aa的胞外區(qū)域(ECD)和58aa的胞內(nèi)區(qū)，其中前17aa為信號肽；長度為264aa的7次跨膜螺旋區(qū)(7 TM helices)，由3個胞內(nèi)環(huán)(in I～in III)和3個胞外環(huán)(out I～out III)連接。推測該氨基酸含有5個潛在的N端糖基化位點，分別為48NTTH、138NLSK、194NNTK、270NLTY、294NMSQ (圖1)。此外，預(yù)測整個編碼區(qū)有31個絲氨酸(Ser)磷酸化位點、21個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點和9個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點。

2.2 施氏鱘FSHR氨基酸同源性分析

利用DNAMAN8軟件對施氏鱘的氨基酸序列進行比對，施氏鱘FSHR氨基酸序列與小體鱘(Acipenserruthenus)FSHR的同源性最高為99%，與斑馬魚同源性為65%，與人類等哺乳動物同源性為59%(表2)，在進化中比較保守。不同物種氨基酸序列對比發(fā)現(xiàn)了多個半胱氨酸保守性區(qū)域和GpHR家族保守信號序列，為CCAF、ERW、FTD、NPFLY(圖2)。利用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，F(xiàn)SHR進化分析發(fā)現(xiàn)，進化樹可分為兩大支，其它各種魚類聚為一支，施氏鱘、哺乳類和鳥類聚為一支且與小體鱘親緣關(guān)系最近(圖3)。

圖1 施氏鱘FSHR基因cDNA全長序列Fig.1 Full sequence of FSHR gene cDNA of A.schrenckii起始密碼子ATG；跨膜螺旋區(qū)(TM Ⅰ-TM Ⅶ)：黑底白字；胞內(nèi)環(huán)(in Ⅰ-in Ⅲ)→；胞外還 (out Ⅰ-out Ⅲ)←；潛在的N-糖基化位點?；終止密碼子：TGA

表2 FSHR氨基酸序列的同源性比對Tab.2 Comparative identity of amino acid sequence of FSHR

圖2 施氏鱘FSHR氨基酸序列與其他物種FSHR氨基酸比對Fig.2 Alignment of A.schrenckii FSHR with FSHRs from several other species相同的氨基酸、高度保守的氨基酸，分別以“黑色”和“灰色”表示；黑色邊框：GpRH家族的特殊保守信號序列；黑色下劃線：富含半胱氨酸殘基的高度保守區(qū)。

圖3 施氏鱘FSHR與其他脊椎動物FSHR構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of A.schrenckii FSHR and other species FSHR

2.3 施氏鱘FSHR基因組織分布表達

采用半定量 RT-PCR 和熒光定量RT-qPCR檢測 FSHR 基因在Ⅱ期雌性施氏鱘不同組織中的表達。從圖4中看出β-actin 基因片段在施氏鱘各組織中的擴增良好，能夠排除RNA 提取失敗導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。結(jié)果顯示，施氏鱘的促卵泡受體基因在心臟、肝、脾、腦、性腺等12種組織中均有表達，在垂體中表達量最高，其次為性腺，而在肌肉、皮膚、腎和鰓中幾乎不表達 (圖5)。

圖4 FSHR基因在雌性施氏鱘各組織中的表達Fig.4 The expression of FSHR gene in female A.schrenckiiM：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；O卵巢；P垂體；B腦；H心臟；L肝臟；SP脾；K腎；ST胃；FG前腸；MG中腸；HG后腸；Mu肌肉；T輸卵管；F脂肪；SK皮膚；G鰓。

圖5 FSHR 基因在雌性施氏鱘各組織中的表達Fig.5 The expression of FSHR gene in female A.schrenckiiO卵巢；P垂體；B腦；H心臟；L肝臟；SP脾；K腎；ST胃；FG前腸；MG中腸；HG后腸；Mu肌肉；T輸卵管；F脂肪；SK皮膚；G鰓。

2.4 LHRH-A對施氏鱘FSHR基因表達的影響

與對照組相比，注射不同濃度LHRH-A 的施氏鱘垂體中 FSHR 基因mRNA的表達量在不同時間點均有上升，其中，3μg/kg組在注射第3天 FSHR 的表達量達到最高峰，差異性顯著，表明GnRHα處理后FSHR大量表達(圖6)；性腺中FSHR的表達量整體呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，但是各濃度組中FSHR達到最高表達量的時間不同(圖7)，其中，1 μg/kg組在第3天達到峰值，5 μg/kg組在第5天達到峰值，均高于對照組，且差異性顯著。

3 討論

FSHR是視紫紅質(zhì)樣受體家族的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)(家族A)，與TSHR一起構(gòu)成了糖蛋白激素受體(GpHR)的亞家族[5]。本實驗克隆得到施氏鱘促卵泡激素受體基因的全長cDNA序列，全長為2 696 bp，編碼661個氨基酸，蛋白質(zhì)相對分子量約為75.02 kD，理論PI值為8.35。在NCBI數(shù)據(jù)庫中，經(jīng)blast對比，其與小體鱘的促性腺激素受體基因氨基酸的相似性高達99%，可以確定其為施氏鱘的促性腺激素受體基因。施氏鱘與其它魚類的促性腺激素受體相似，其一般拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)包括一個大的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、七個跨膜螺旋區(qū)和一個羧基末端的尾部[18]，但與哺乳動物FSHR氨基酸序列相比，魚類FSHR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域存在顯著差異，一個關(guān)鍵特征是它們的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)成蛋白質(zhì)長度的一半以上，有助于激素的識別和特異性結(jié)合[19]。已有報道證明，該受體的跨膜結(jié)構(gòu)域是最保守的部分，它們穿過脂質(zhì)雙層并由三個細(xì)胞內(nèi)和三個細(xì)胞外環(huán)鏈接，具有受體激活和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[20]。此外，在施氏鱘FSHR氨基酸序列的ECD區(qū)，發(fā)現(xiàn)了5個N-糖基化位點，該位點最早在大馬哈魚(Oncorhynchusrhodurus)中發(fā)現(xiàn)[21]，暗示其在脊椎動物糖蛋白激素受體中的保守性。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，魚類和哺乳類位于2個明顯不同的分支，然而在進化樹中我們發(fā)現(xiàn)，施氏鱘、小體鱘與哺乳動物和鳥類聚為一支，推測與該物種的特殊性有關(guān)。

圖6 注射不同濃度GnRH激動劑的施氏鱘在不同時間點垂體中FSHR基因表達量的變化Fig.6 The changes on FSHR expression in pituitary of A.schrenckii injected with different concentrations of GnRHα at different time points小寫字母代表同一實驗組不同時間點有顯著性(P<0.05)，大寫字母代表在同一時間點不同實驗組有顯著性差異(P<0.05)。圖7同。

圖7 注射不同濃度GnRH激動劑的施氏鱘在不同時間點性腺中FSHR基因表達量的變化Fig.7 The changes on FSHR expression in gonad of A.schrenckii injected with different concentrations of GnRHα at different time points

施氏鱘FSHR在各組織中的熒光定量PCR結(jié)果表明，施氏鱘的促卵泡受體基因在大部分組織中均有表達，但表達量存在差異，說明促卵泡受體在施氏鱘中具有廣泛的生理作用。FSHR在施氏鱘垂體和卵巢中的表達量較高，該結(jié)果與黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)和非洲鯰魚(Oncorhynchusrhodurus)相似。而在垂體中的高表達可能與FSH在下丘腦的分泌有關(guān)。除此之外，F(xiàn)SHR在施氏鱘心臟、肝臟、脾、腦和輸卵管等組織中也存在不同程度的表達，這在歐洲鱸魚[9]和斑馬魚[22]的非性腺組織中均有相似的發(fā)現(xiàn)。以上研究推斷，施氏鱘的促卵泡受體基因在雌性的生殖功能中有著重要作用，同時可能具有更廣泛的性腺外生理功能。研究資料顯示，GnRH在離體或在體情況下都可以刺激魚類腦垂體釋放GtH并促進魚類的性腺發(fā)育[23]。LHRH-A是哺乳類GnRH的高活性類似物，能刺激魚類性垂體釋放GtH。本研究結(jié)果表明，腹腔注射LHRH-A可不同程度地升高施氏鱘早期性腺和垂體中促卵泡激素受體基因mRNA表達，進而促進其性腺發(fā)育。注射劑量為3 μg/kg的LHRH-A 2 d施氏鱘垂體FSHR mRNA表達無顯著變化(P>0.05)，3 d的表達量才顯著提高(P<0.05)，之后下降(P<0.05)，而注射1 μg/kg和5 μg/kg LHRH-A垂體mRNA表達水平與對照組差異較小，這表明LHRH-A在注射3 d后可顯著促進施氏鱘垂體FSHR mRNA表達水平。與垂體的表達模式不同，不同劑量LHRH-A的作用下，性腺中FSHR mRNA的表達均為先升高后降低的變化趨勢，其中，1 μg/kg和5 μg/kg分別在第三天和第五天達到極值(P<0.05)，暗示LHRH-A可能以劑量依賴的方式提高施氏鱘垂體和性腺的FSHR mRNA水平和促進FSHR的分泌，但這種促進作用在注射1周后明顯下降，可能由于LHRH-A屬于小肽，在魚體內(nèi)被降解無法長期保留。Kumakura等[24]研究證實，在紅海鯛(Pagrusmajor)中，單獨施用GnRH激動劑可以刺激紅雕性腺早熟。在未成熟的歐洲鰻魚中，GnRHa和DA拮抗劑聯(lián)合治療以誘導(dǎo)LH的釋放和卵巢發(fā)育[25]。綜上所述，LHRH-A可通過調(diào)控FSHR的表達參與施氏鱘的早期性腺發(fā)育，為進一步闡明FSHR的生理功能和分子機制奠定基礎(chǔ)，同時也為施氏鱘早期生殖調(diào)控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。