褪黑素MT2受體激動(dòng)劑IIK-7對(duì)骨癌大鼠產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用

張龍新　王菁　周敏

【摘要】 目的：研究褪黑素MT2受體激動(dòng)劑IIK-7對(duì)骨癌疼痛（bone cancer pain，BCP）大鼠機(jī)械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）的影響。方法：將30只180～220 g清潔級(jí)雌性SD大鼠隨機(jī)分為5組（n=6）：空白對(duì)照組（CONT組）、假手術(shù)組（Sham組）、骨癌痛組（BCP組）、IIK-7組及DMSO組。CONT組不做任何處理;Sham組大鼠左后肢脛骨骨髓腔內(nèi)注射10 μL PBS液，鞘內(nèi)置管，術(shù)后第3天開(kāi)始鞘內(nèi)連續(xù)輸注DMSO（1 μL/h，10 h）;BCP組大鼠左后肢脛骨骨髓腔內(nèi)注射10 μL Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞PBS混懸液，連續(xù)輸注DMSO（1 μL/h，10 h）;IIK-7組大鼠左后肢脛骨骨髓腔內(nèi)注射10 μL Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞PBS混懸液，術(shù)后第3天開(kāi)始鞘內(nèi)連續(xù)輸注IIK-7（1 μL/h，0.5 μg/μL，10 h）;DMSO組大鼠左側(cè)后肢脛骨骨髓腔內(nèi)注射10 μL Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞PBS混懸液，術(shù)后第3天開(kāi)始鞘內(nèi)連續(xù)輸注DMSO（1 μL/h，10 h）。用Von Frey纖毛測(cè)痛儀測(cè)定術(shù)前及術(shù)后第7、14、21天各組大鼠左后肢MWT;X線拍攝檢測(cè)大鼠左后肢骨癌模型建立情況。結(jié)果：影像學(xué)結(jié)果顯示，骨癌痛大鼠（BCP組）術(shù)側(cè)脛骨骨皮質(zhì)不連續(xù)，骨小梁缺失，周圍組織明顯腫脹。術(shù)前，各組大鼠術(shù)側(cè)后肢MWT比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;術(shù)后第7、14、21天，CONT組與Sham組術(shù)側(cè)后肢MWT較術(shù)前均無(wú)明顯變化（P>0.05），但BCP組大鼠術(shù)側(cè)后肢MWT均較CONT組明顯降低（P<0.05）;術(shù)后第7天，IIK-7組大鼠術(shù)側(cè)后肢MWT與BCP組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），術(shù)后第14、21天，IIK-7組大鼠術(shù)側(cè)后肢MWT較BCP組均明顯升高（P<0.05）。結(jié)論：褪黑素MT2受體激動(dòng)劑IIK-7可以提高骨癌痛大鼠MWT，緩解骨癌大鼠的疼痛。

【關(guān)鍵詞】 骨癌疼痛 褪黑素MT2受體 IIK-7 機(jī)械縮足反射閾值

Analgesic Effect of Melatonin MT2 Receptor Agonist IIK-7 on Bone Cancer Rats/ZHANG Longxin， WANG Jing， ZHOU Min. //Medical Innovation of China， 2020， 17（15）： 00-013

[Abstract] Objective： To study the effects of melatonin MT2 receptor agonist IIK-7 on mechanical withdrawal threshold （MWT） of bone cancer pain （BCP） rats. Method： Thirty 180-220 g clean female SD rats were randomly divided into 5 groups （n=6）： blank control group （CONT group）， sham operation group （Sham group）， bone cancer pain group （BCP group）， IIK-7 group， DMSO group. No treatment was performed in the CONT group; 10 μL PBS solution was injected into the tibia bone marrow cavity of the left hind limb of the rats in the Sham group， and a sheath was placed in the tube， continuous intrathecal infusion of DMSO （1 μL/h， 10 h） was started on the third day after surgery; 10 μL of Walker256 rat breast cancer cell PBS suspension was injected into the bone marrow cavity of the left hind limb of the rats left hind limb， and DMSO （1 μL/h， 10 h） was continuously infused; in the IIK-7 group， 10 μL of Walker256 was injected into the bone marrow cavity of the left hind limb of the rat， PBS suspension of rat breast cancer cells， continuous intrathecal infusion of IIK-7 （1 μL/h， 0.5 μg/μL， 10 h） started on the 3rd day after operation; 10 μL Walker256 was injected into the tibia of the left hind limb of the DMSO group rats PBS suspension of rat breast cancer cells， and continuous intrathecal infusion of DMSO （1 μL/h， 10 h） began on the 3rd day after surgery. MWT of left hind limb was measured by von Freys ciliary pain detector before operation and on the 7th， 14th and 21th day after operation， and the establishment of bone cancer model of left hind limb was detected by X-ray. Result： The imaging results showed that in BCP group， the tibial cortex was discontinuous， the trabecula was absent and the surrounding tissue was swollen. Before operation， there were no significant differences in MWT between the each groups （P>0.05）; on the 7th， 14th and 21st day after operation， MWT of the hind limbs in the CONT group and the Sham group had no significant changes （P>0.05）， but MWT of the hind limbs in the BCP group was significantly lower than that in the CONT group （P<0.05）. On the 7th day after operation， MWT of hindlimb in IIK-7 group was not significantly different from that in BCP group （P>0.05）. On the 14th and 21st day after operation， MWT of hindlimb in IIK-7 group were significantly higher than those in BCP group （P<0.05）. Conclusion： Melatonin MT2 receptor agonist IIK-7 can improve MWT and relieve pain of bone cancer rats.

[Key words] Bone cancer pain Melatonin MT2 receptor IIK-7 Mechanical withdrawal threshold

First-authors address： Fujian Provincial Maternity and Childrens Hospital， Fuzhou 350001， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.15.003

骨癌疼痛（bone cancer pain，BCP）是原發(fā)性骨癌或乳腺癌、前列腺癌、肺癌等轉(zhuǎn)移性骨癌患者最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)睡眠障礙、焦慮、抑郁及自殺傾向，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。雖然有多種治療方法可以減輕骨癌疼痛，包括非甾體抗炎藥、雙膦酸鹽、放療和外科手術(shù)，但是阿片類藥物的使用仍然是主要的鎮(zhèn)痛措施。然而由于阿片類藥物的成癮性及耐受性限制了其在疼痛治療中的使用[2]。此外，現(xiàn)代生活方式和慢性病顯著增加了新病例的數(shù)量。因此探尋骨癌痛發(fā)病機(jī)制、優(yōu)化骨癌痛治療成為亟待解決的問(wèn)題。

已有研究表明，在臨床前模型中，MT及其受體激動(dòng)劑對(duì)傷害性和神經(jīng)病理性疼痛具有鎮(zhèn)痛作用，而一些用于治療睡眠障礙的MT激動(dòng)劑具有良好的安全性和耐受性[3]。近年來(lái)，一些MT受體激動(dòng)劑已被批準(zhǔn)用于治療睡眠和抑郁癥，其他一些藥物也進(jìn)入了臨床試驗(yàn)，包括TIK-301等[4]。但是MT受體激動(dòng)劑尚未被批準(zhǔn)用于疼痛的治療。最近，Gobbi等[5]通過(guò)使用褪黑素MT2受體拮抗劑證明了MT的鎮(zhèn)痛特性是由褪黑素MT2受體特異性介導(dǎo)的。且有研究顯示褪黑素MT2受體激動(dòng)劑IIK-7對(duì)神經(jīng)病理性疼痛有鎮(zhèn)痛作用[6]，但其是否可以通過(guò)相似的機(jī)制治療骨癌痛尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。為此筆者進(jìn)行以下探究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取清潔級(jí)健康清潔級(jí)雌性SD大鼠30只（180～220 g），吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司采購(gòu)，于20～25 ℃溫度、（50±5）%空氣濕度中飼養(yǎng)，可自由飲水?dāng)z食，并設(shè)置明暗生活環(huán)境各12 h。（2）主要儀器及試劑：超凈臺(tái)（美國(guó)Biological）、恒溫水浴箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、無(wú)菌離心管、無(wú)菌凍存管（福州市康諾生物技術(shù)有限公司）、離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）、顯微鏡（Olypus日本）、Von Frey纖毛測(cè)痛儀、鞘內(nèi)藥物輸注泵（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）、無(wú)菌手術(shù)器械、微量進(jìn)樣器（上海醫(yī)療器械廠）、一次性注射器、無(wú)菌紗布、棉球、4-0可吸收線、骨蠟、紅霉素眼膏、青霉素鈉注射液、水合氯醛、碘伏（福建省婦幼保健院）、Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞（上海久志生物科技有限公司）、PE管、胰酶、1640培養(yǎng)基、DMSO、IIK-7（福州市康諾生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 骨癌痛大鼠模型的建立及分組 大鼠稱重后向其腹腔內(nèi)注射0.6 mL/100 g 10%水合氯醛麻醉，后固定在T型臺(tái)上;以大鼠角膜反射消失且其腳趾對(duì)鑷子鉗夾無(wú)反應(yīng)評(píng)判達(dá)到滿意的麻醉深度。使用75%酒精消毒左后肢皮膚;用手術(shù)刀在脛骨平臺(tái)皮膚處切開(kāi)約1 cm切口，用無(wú)齒鑷分離肌肉，小紗球止血，清晰分離脛骨骨膜暴露骨面;用4.5號(hào)無(wú)菌注射針頭在脛骨平臺(tái)上垂直鉆一小孔，拔出針頭，將一5.5號(hào)無(wú)菌注射針頭輕微彎曲，從小孔刺入脛骨骨髓腔，以測(cè)試骨髓腔的通暢情況;骨髓腔通暢后，用25 μL微量進(jìn)樣器抽取10 μL Walker256大鼠癌細(xì)胞PBS混懸液緩慢注入骨髓腔，當(dāng)液體反流時(shí)，緩慢拔出微量進(jìn)樣器，立即用骨蠟封閉穿刺孔，穿刺孔周圍的癌細(xì)胞用無(wú)菌紗布擦除;并用蘸取75%酒精紗布擦拭手術(shù)切口以殺死遺留在骨髓腔外的癌細(xì)胞，之后逐層消毒縫合手術(shù)切口;接著稀釋8萬(wàn)單位青霉素注射入大鼠腹腔內(nèi)，切口處涂適量紅霉素軟膏以預(yù)防手術(shù)部位感染;最后將大鼠放在37 ℃熱板上復(fù)蘇后放入籠中繼續(xù)按原來(lái)的條件飼養(yǎng)。將30只大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只：（1）空白對(duì)照組（CONT組）不做任何處理;（2）假手術(shù)組（Sham組）大鼠左側(cè)后肢脛骨骨髓腔內(nèi)注射10 μL PBS液，鞘內(nèi)置管，術(shù)后第3天開(kāi)始鞘內(nèi)連續(xù)輸注DMSO（1 μL/h，10 h）;（3）骨癌痛組（BCP組）大鼠左側(cè)后肢脛骨骨髓腔內(nèi)注射10 μL Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞PBS混懸液，連續(xù)輸注DMSO（1 μL/h，10 h）;（4）IIK-7組大鼠左側(cè)后肢脛骨骨髓腔內(nèi)注射10 μL Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞PBS混懸液，術(shù)后第3天開(kāi)始鞘內(nèi)連續(xù)輸注IIK-7（1 μL/h，0.5 μg/μL，10 h）;（5）DMSO組大鼠左側(cè)后肢脛骨骨髓腔內(nèi)注射10 μL Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞PBS混懸液，術(shù)后第3天開(kāi)始鞘內(nèi)連續(xù)輸注DMSO（1 μL/h，10 h）。

1.2.2 鞘內(nèi)置管 10%水合氯醛麻醉大鼠，依據(jù)大鼠身體長(zhǎng)度，剪一段PE-10導(dǎo)管（20～23 cm），并用微量進(jìn)樣器將導(dǎo)管內(nèi)注滿生理鹽水，將PE管送入插管的12號(hào)針頭內(nèi)，在針頭后3 cm處做標(biāo)記，再將PE管全部送入針頭;將麻醉的大鼠用剃毛機(jī)剔除大鼠頸部及腰骶部毛發(fā)，切開(kāi)皮膚暴露手術(shù)視野并用碘伏無(wú)菌消毒;摸到骼脊部位，在兩骼脊連線中點(diǎn)處切開(kāi)筋膜、肌肉，將導(dǎo)針緊貼脊柱旁開(kāi)45°～60°角，傾斜向上30°角方向旋轉(zhuǎn)進(jìn)針，有落空感時(shí)停止進(jìn)針，可見(jiàn)大鼠尾部輕微擺動(dòng);用鑷子將PE管向脊髓上方緩慢推送至標(biāo)記的3 cm處，小心旋轉(zhuǎn)拔出導(dǎo)針，留置PE管，打結(jié)并固定于進(jìn)針肌肉處;將灌胃針從頸部經(jīng)皮下送至插管處，將PE管經(jīng)灌胃針?biāo)椭令i部，在頸部打結(jié)并固定;將頸部及腰骶部皮膚縫合。若PE管內(nèi)有血液，注射10 μL人工腦脊液并用打火機(jī)封口;無(wú)血液則可直接封口。術(shù)后將動(dòng)物放回清潔籠內(nèi)，大鼠單籠飼養(yǎng)，連續(xù)3 d，每天腹腔注射青霉素防止感染。

1.2.3 機(jī)械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）的測(cè)定 準(zhǔn)備好Von Frey測(cè)痛纖毛，分別為0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、26.0 g，將待檢測(cè)大鼠放進(jìn)檢測(cè)箱中（26 cm×14 cm×26 cm）適應(yīng)30 min，待小鼠安靜后，依次用標(biāo)準(zhǔn)化的Von Frey測(cè)痛纖毛（0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、26.0 g）垂直刺激大鼠左后肢足底中部，直至纖毛呈90°彎曲，觀察大鼠縮足反應(yīng)。每只大鼠接受5次同一克數(shù)纖毛刺激，每次刺激間隔2 min。若大鼠出現(xiàn)3次或3次以上縮足反應(yīng)，則記該纖毛克數(shù)作為該大鼠的機(jī)械痛閾。

1.2.4 影像學(xué)檢查 麻醉方法同建立骨癌痛模型時(shí)的麻醉方法，將大鼠固定在T型臺(tái)上，用X射線（50KVP）拍攝大鼠左后肢，觀察其脛骨中癌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及脛骨被破壞的情況，拍攝完畢將大鼠放在37 ℃熱板上復(fù)溫，蘇醒后將其送回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察術(shù)前及術(shù)后第7、14、21天大鼠左后肢MWT;拍攝X線片，觀察術(shù)后第21天大鼠左后肢骨被侵襲情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 22.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 X線檢查結(jié)果 正常大鼠（CONT組）骨小梁完整，骨皮質(zhì)連續(xù);骨癌痛大鼠（BCP組）術(shù)側(cè)脛骨骨皮質(zhì)不連續(xù)，骨小梁缺失，周圍組織明顯腫脹。見(jiàn)圖1。

2.2 骨癌對(duì)大鼠MWT的影響 術(shù)前測(cè)定各組大鼠術(shù)側(cè)后肢MWT基礎(chǔ)值均相近，比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;術(shù)后第7、14、21天，CONT組與Sham組術(shù)側(cè)后肢MWT較術(shù)前均無(wú)明顯變化（P>0.05），但BCP組大鼠術(shù)側(cè)后肢MWT均較CONT組明顯降低（P<0.05）。見(jiàn)圖2和表1。

2.3 IIK-7對(duì)骨癌痛大鼠MWT的影響 術(shù)前測(cè)定各組大鼠術(shù)側(cè)后肢MWT基礎(chǔ)值均相近，比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;術(shù)后第7天，IIK-7組大鼠術(shù)側(cè)后肢MWT與BCP組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），術(shù)后第14、21天，IIK-7組大鼠術(shù)側(cè)后肢MWT較BCP組均明顯升高（P<0.05）。見(jiàn)圖3、表2。

3 討論

目前，癌癥發(fā)病率越來(lái)越高，其中肺癌、乳腺癌、前列腺癌等很容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，引起劇烈的骨癌痛。目前阿片類藥物是臨床上治療骨癌痛的常用藥物，但是由于成癮性、耐受性及嚴(yán)重不良反應(yīng)等限制了其在骨癌痛中的應(yīng)用。

褪黑素（N-乙?；?5-甲氧基色胺），在調(diào)節(jié)睡眠覺(jué)醒周期、抑制腫瘤進(jìn)展、改善免疫系統(tǒng)功能、控制機(jī)體各組織的穩(wěn)態(tài)等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。然而，研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素及其受體激動(dòng)劑在控制慢性疼痛方面有很強(qiáng)的潛力[8]。IIK-7是MT的一個(gè)四環(huán)類似物，專門與MT受體結(jié)合，這種激動(dòng)劑對(duì)MT2受體亞型的選擇性是MT1的90倍，對(duì)MT2受體亞型的親和力是MT的6倍[6]。IIK-7和MT一樣可以是促進(jìn)睡眠和保護(hù)細(xì)胞免受電磁壓力[9]。

有研究顯示IIK-7可以提高神經(jīng)病理性疼痛大鼠的MWT，但是其對(duì)骨癌痛的影響尚不清楚[4]。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)注射Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞建立大鼠脛骨癌痛模型，鞘內(nèi)輸注IIK-7，觀察其對(duì)骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾的影響。實(shí)驗(yàn)觀察到骨癌痛組大鼠術(shù)側(cè)脛骨骨皮質(zhì)不連續(xù)，骨小梁疏松，且建模后第7天開(kāi)始，術(shù)側(cè)后肢MWT顯著降低，說(shuō)明骨癌痛模型建立成功。建模后第14、21天，IIK-7組大鼠MWT均較BCP組明顯升高（P<0.05），說(shuō)明IIK-7對(duì)骨癌痛有一定的緩解作用。

此外，褪黑激素具有抗氧化和抑癌作用[10]。一些證據(jù)顯示褪黑激素對(duì)多種類型的腫瘤有抑制作用，包括乳腺、子宮內(nèi)膜、前列腺、卵巢、腸道和肝臟腫瘤等[11]。有研究顯示骨代謝與褪黑激素水平相關(guān)，褪黑激素對(duì)骨連接細(xì)胞增殖有影響[12-13]。

有研究表明，在特定時(shí)間點(diǎn)，褪黑激素水平較低，且與骨肉瘤的高發(fā)有關(guān)，猜測(cè)褪黑激素可能會(huì)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞有抑制作用[11]。多項(xiàng)研究顯示褪黑激素對(duì)MG-63骨肉瘤細(xì)胞的抗增殖作用，并報(bào)道褪黑激素的抑制活性與絲裂原激活激酶和AKT信號(hào)通路有關(guān)。褪黑激素通過(guò)調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路干擾骨肉瘤細(xì)胞的增殖[8]。褪黑激素特異性抑制ERK1/2的磷酸化激活，還表明褪黑激素的抑制功能與細(xì)胞周期蛋白CDK4和D1以及細(xì)胞周期蛋白CDK1和B1的下調(diào)有關(guān)[14]。因此褪黑素受體激動(dòng)劑在緩解骨癌痛的同時(shí)是否有抑制骨癌發(fā)展的作用值得進(jìn)一步研究。

有研究顯示IIK-7是通過(guò)活性氧而抑制神經(jīng)病理性疼痛[16]?；钚匝酰≧OS）是正常代謝過(guò)程中產(chǎn)生的天然副產(chǎn)物，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和體內(nèi)平衡中起重要作用[15]。ROS種類很多，包括羥基自由基、超氧自由基、一氧化氮、過(guò)氧化氫和過(guò)氧亞硝酸鹽[16]。正常情況下，ROS產(chǎn)生受到抗氧化防御系統(tǒng)的嚴(yán)格調(diào)控[17]。ROS參與炎癥性疼痛和神經(jīng)性疼痛的發(fā)病機(jī)制已被多次報(bào)道[18]，此外，ROS清除劑、超氧化物歧化酶（SOD）模擬化合物和抗氧化劑已被證明在嚙齒動(dòng)物疼痛模型中具有顯著的鎮(zhèn)痛作用[19]。有研究顯示ROS清除劑能改善骨癌痛大鼠的機(jī)械痛[20]，但是IIK-7是否是通過(guò)ROS影響骨癌痛大鼠尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，褪黑素MT2受體激動(dòng)劑IIK-7可以提高骨癌大鼠機(jī)械縮足反射閾值，對(duì)骨癌痛大鼠產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，但是其潛在的機(jī)制以及其是否能抑制骨癌發(fā)展尚不清楚，值得進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2020-03-12） （本文編輯：董悅）