中藥苦芪超微粉增強免疫及治療犬細小病毒感染的效果觀察

邢玉娟，莊彩云，王建國，邱樹磊，劉運鎮(zhèn)，陳玉庫*，楊帆，劉益，曹希敏

(1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300；2. 內(nèi)蒙包頭市九原區(qū)動物疫病預防控制中心，內(nèi)蒙古 包頭 014060；3. 山東省威海市環(huán)翠區(qū)動物疫病預防控制中心，山東 威海 264200)

犬細小病毒病是由犬細小病毒(canine parvovirus，CPV)感染引起的一種急性、熱性、傳染性疾病，臨床上以出血性腸炎或非化膿性心肌炎為特征[1]。不同年齡、性別、品種的犬均可感染，病死率高，是危害養(yǎng)犬業(yè)的主要疫病之一。目前對于犬細小病毒感染的治療，對出血性腸炎型病例主要采用緊急注射高免血清或免疫球蛋白、抗病毒、防止繼發(fā)感染、對癥治療和支持療法等綜合措施，而對非化膿性心肌炎型病例采用上述治療措施收效甚微[2-3]。為了研制和開發(fā)治療犬細小病毒感染的中藥處方，并探討其抗病毒作用機理，本試驗以小鼠為模型觀察了中藥苦芪超微粉對環(huán)磷酰胺致免疫功能低下小鼠脾淋巴細胞增殖率和免疫器官指數(shù)變化，在此基礎上在犬體內(nèi)研究了該藥對犬細小病毒感染的保護作用，為進一步擴大臨床試驗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

苦芪超微粉，由黃芪、苦參、梔子、甘草4味中藥按4∶3∶2∶1比例組成，由河南省康星藥業(yè)股份有限公司試制。使用時用雙蒸水配制成500 mg/mL的混懸液。

黃芪多糖口服液，北京生泰爾生物科技有限公司生產(chǎn)，批號1608191。

環(huán)磷酰胺注射液，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，批號H32020857。

1.2 主要試劑

小牛血清，杭州四季青生物制品廠產(chǎn)品；RPMI 1640培養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品；伴刀豆素球蛋白(ConA)，上海浩然生物技術有限公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍(MTT)溶液，Amresco公司產(chǎn)品；淋巴細胞分離液，上海恒信化學試劑有限公司產(chǎn)品；淋巴細胞裂解液，二甲亞砜(DMSO)，分析純，蘇州正興化工研究院產(chǎn)品；犬細小病毒(CPV)檢測板，上海容暉生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗動物

清潔級昆明小鼠60只，體重(18±2)g，購自南京醫(yī)科大學實驗動物中心(許可證號為SCXK(蘇)2013-0005)。

田園犬，60只，42～48 日齡，未接種疫苗，CPV 檢測板檢測呈陰性，委托江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院實驗動物房采購，注射左旋咪唑驅蟲，隔離飼養(yǎng)觀察7 d。

1.4 苦芪超微粉對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞轉化及免疫器官指數(shù)的影響

1.4.1 對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化的影響

取昆明小鼠60只，隨機分為6組，即苦芪超微粉高、中、低劑量組(40，20，10 mL/kg)、藥物對照組(黃芪多糖口服液，10 mL/kg)、模型組和空白對照組，每組10 只。1～4組每天灌胃給藥1次，模型組和空白對照組灌胃給予與藥物對照組等劑量生理鹽水。連續(xù)5 d后，1～5 組腹腔注射環(huán)磷酰胺(40 mg/kg)，空白對照組腹腔注射生理鹽水(40 mg/kg)，連續(xù)2 d，末次注射給藥后，脫頸椎處死小鼠，無菌取脾臟、胸腺，稱重。稱重后將脾用滅菌生理鹽水沖洗3 次，放入含Hank’s液的平皿中剪碎，裝入200 目網(wǎng)孔的尼龍網(wǎng)袋中，用彎針頭擠壓過濾，收集細胞液，加入淋巴細胞分離液，2 000 r/min離心20 min，吸取中間云霧狀白細胞層，用Hank’s液洗2 次，用RPMI 1640營養(yǎng)液稀釋成1×104個/mL細胞懸液。將脾淋巴細胞懸液按照小鼠灌胃給藥的分組加入到96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每組設置8個復孔，4個孔加入ConA(終濃度為0.325 μg/mL)，另外4個孔加同體積的空白培養(yǎng)基。

將96孔細胞培養(yǎng)板置于5% CO2、39.5 ℃培養(yǎng)箱中72 h，每孔加入20 μL MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，每孔吸出上清液，加入100 μL裂解液，在微量震蕩器上混勻使其顏色變澄清，用酶聯(lián)免疫儀檢測570 nm下的A570值，按照以下公式計算A570差值，作為淋巴細胞增殖的指標[4]。ΔA570為ConA 誘導孔A570均值與無 ConA 誘導孔A570均值的差。

1.4.2 對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

末次注射環(huán)磷酰胺給藥后，脫頸椎處死小鼠，稱取小鼠體重；取胸腺和脾臟，稱取濕重，并計算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。 免疫器官指數(shù)=免疫器官重量/體重×100%。

1.5 苦芪超微粉治療犬細小病毒感染的效果觀察

1.5.1 動物分組及處理

利用2只患有犬細小病毒病的犬進行水平感染[5]，將自然發(fā)病且 CPV 檢測板檢測呈陽性的53只病犬隨機分為 5組(取其中50只，另外3只另法治療)，另取3只同日齡飼養(yǎng)的健康犬作為空白對照，隔離飼養(yǎng)。造模后第4 天開始給藥。中藥給藥劑量參考文獻[6]，2 kg田園犬(50日齡)給藥劑量相當于小鼠的2.46倍。

整個試驗過程中，中藥治療組和藥物對照組每天每只病犬補充乳酸鈉林格注射液500 mL、5%葡萄糖生理鹽水250 mL、鹽酸消旋山莨菪堿液(654-2)0.5 g、維生素C注射液5 mL、能量合劑10 mL，作為基礎治療，給予清潔而足夠的冷淡鹽水。見表 1。

表1 動物分組及處理

項目組別空白對照苦芪高劑量苦芪中劑量苦芪低劑量藥物對照模型犬數(shù)量31010101010給藥方案口服生理鹽水,每只2 mL,每天2次,連用5 d口服受試藥物,每只4 mL,每天2次,連用5 d+基礎治療口服受試藥物,每只2 mL,每天2次,連用5 d+基礎治療口服受試藥物,每只1 mL,每天2次,連用5 d+基礎治療口服黃芪多糖口服液,每只2 mL,每天2次,連用5 d+基礎治療不給藥

1.5.2 觀察指標

癥狀觀察：每天觀察記錄犬的發(fā)病情況，包括嘔吐、拉稀、精神狀態(tài)、體溫等。

死亡率：每天記錄各組死亡數(shù)，觀察至用藥停止后7 d，統(tǒng)計各組死亡率。

治愈率：凡在試驗期間，經(jīng)給藥后嘔吐、下痢、便血停止，體溫、精神狀況及食欲恢復正常，治療結束后觀察7 d無異常者，判為治愈，根據(jù)治愈犬占整組試驗犬比例計算治愈率。

有效率：用藥停止后7 d體征大有好轉，即體溫、精神、食欲恢復正常，但糞便尚未成形，或體溫、精神恢復正常，但食欲不振和糞便未成形等，判為有效，根據(jù)有效犬占整組試驗犬比例計算有效率。

無效率：用藥后體征無改善或惡化、死亡者，判為無效?；蝮w溫未降至正常，食欲時好時壞，糞便帶有血絲或黏液者，判為無效[7]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，淋巴細胞A570值、免疫器官指數(shù)以“平均數(shù)±標準差”表示，組間差異比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化的影響

與空白對照組相比，模型組小鼠脾淋巴細胞的A570值顯著降低(P<0.05)，說明環(huán)磷酰胺造模成功；與模型組比較，苦芪超微粉高、中、低劑量組和藥物對照組的A570值顯著升高(P<0.05)。高劑量組A570值顯著高于低劑量組(P<0.05)，中劑量組A570值也高于低劑量組，但差異不顯著(P>0.05)。見表2。

表2 苦芪超微粉對脾淋巴細胞增殖的影響

組別劑量/(mL·kg-1)ΔA570值空白對照-0.166±0.022a苦芪超微粉高劑量400.168±0.011a苦芪超微粉中劑量200.162±0.009ab苦芪超微粉低劑量100.149±0.012b藥物對照-0.161±0.012ab模型組-0.091±0.023c

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.2 對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

模型組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均降低，與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)，表明造模成功。胸腺指數(shù)，與模型組相比，苦芪超微粉高、中、低劑量組和藥物對照組有顯著差異(P<0.05)；脾指數(shù)，與模型組相比，苦芪超微粉高、中劑量組和藥物對照組有顯著差異(P<0.05)，苦芪超微粉低劑量組脾指數(shù)高于模型組，但差異不顯著(P>0.05)。見表3。

表3 苦芪超微粉對免疫抑制小鼠臟器指數(shù)的影響

組別劑量/(mL·kg-1)胸腺指數(shù)脾指數(shù)空白對照-2.16±0.57a3.62±0.40a苦芪超微粉高劑量402.09±0.26a3.38±0.34ab苦芪超微粉中劑量202.06±0.41a3.26±0.61ab苦芪超微粉低劑量101.90±0.24a2.94±0.38bc藥物對照-2.07±0.20a3.40±0.33ab模型-1.40±0.37b2.53±0.29c

2.3 苦芪超微粉治療犬細小病毒感染的效果

2.3.1 造模情況

用細小病毒感染犬進行水平感染后，第 1～2天未出現(xiàn)明顯癥狀，第3天起，病犬食欲減退，第 4天出現(xiàn)嘔吐與拉稀癥狀，嘔吐物呈白色泡沫狀，部分犬伴有腹瀉，糞便帶有黏液或血絲，氣味腥臭，取肛拭子用 CPV 檢測板檢測為陽性?？瞻讓φ战M犬只精神狀態(tài)良好，食欲正常，大小便正常。

2.3.2 各組用藥效果觀察

苦芪超微粉治療組試驗犬用藥3 d后，高劑量組中，嘔吐物為白色黏液，雖有拉稀但沒有血便出現(xiàn)。用藥5 d后，有7只犬嘔吐次數(shù)減少，排便次數(shù)減少，食欲逐漸恢復，用藥停止后第3天，嘔吐和拉稀均得到控制且食欲恢復，精神良好。另3只犬中，1只犬在用藥停止后第7天康復，另2只糞便雖成形、無黏液，但體溫稍高，食欲時好時壞，判為無效；中劑量組在用藥停止后第7天，8只犬痊愈，另2只病犬食欲尚可，但糞便不成形，體溫稍高，判為無效；低劑量組用藥5 d后，仍有1只犬有血便，用藥停止后第4天，衰竭死亡。其余9只病犬在用藥停止后第7天，7只食欲逐漸恢復，另2只糞便較稀軟，體溫未恢復正常，判為無效。

藥物對照組試驗犬用藥3 d后，有3只犬出現(xiàn)血便。用藥5 d后嘔吐次數(shù)減少，血便次數(shù)由3次減少到 2 次。用藥停止后第2天，死亡1只，另2只在結束觀察前糞便仍帶有血絲和黏液，判為無效。見表4。

模型組試驗犬在用藥停止后第1天有6只排深色血便，嘔吐物為白色黏液，被毛粗亂無光澤，精神高度沉郁。用藥停止后第3天10只犬均出現(xiàn)血便，嘔吐次數(shù)由 3～4 次增加到 6～7 次，眼窩凹陷，皮膚彈性減退，精神高度沉郁，臥地不起。用藥停止后第4天晚上死亡2只，第5天上午死亡1只，第6天上午死亡1只，第7天上午死亡3只，死亡之前，病犬四肢冰涼，身體蜷縮顫抖，被毛粗亂，體溫下降。另3只中，2只在結束觀察前仍高度衰竭，瀕臨死亡，另1只精神好轉。見表4。

表4 各組有效率、治愈率和死亡率

組別數(shù)量有效數(shù)有效率/%治愈數(shù)治愈率/%死亡數(shù)死亡率/%空白對照3----00苦芪高劑量1088088000苦芪中劑量1088088000苦芪低劑量10770770110藥物對照10770770110模型10----770

3 討論

3.1 苦芪超微粉對淋巴細胞增殖的影響

淋巴細胞增殖是反映機體細胞免疫水平的一個重要指標。淋巴細胞的增殖數(shù)量，決定了機體免疫應答的強度[8]。本試驗中，苦芪超微粉高、中、低劑量組的A570值顯著高于模型組，說明苦芪超微粉能夠促進免疫抑制小鼠的脾淋巴細胞的增殖，對環(huán)磷酰胺致免疫功能低下小鼠的具有免疫增強作用。高劑量組的效果優(yōu)于中、低劑量組，提示苦芪超微粉對小鼠特異性免疫功能具有較好的調(diào)節(jié)作用，且具有一定的量效關系。陳星星等[9]研究用不同濃度的鐵皮石斛對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制模型小鼠脾臟淋巴細胞體外增殖的影響，也取得了相似的結果，在一定濃度范圍內(nèi)，隨鐵皮石斛濃度的增高，細胞分裂增殖效果有增加趨勢。

3.2 苦芪超微粉對機體免疫器官指數(shù)的影響

胸腺和脾臟是機體重要的淋巴器官，且胸腺是機體的中樞免疫器官，兩者的功能與機體免疫狀況密切相關。免疫器官指數(shù)是衡量機體免疫狀態(tài)的初步指標[10]。在本試驗中，注射環(huán)磷酰胺小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)均顯著低于正常小鼠，灌服苦芪超微粉后提高了免疫抑制小鼠的免疫器官指數(shù)，其中高、中劑量組的效果較好，與模型組相比較差異顯著，但胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均未能恢復到空白對照組小鼠的水平。提示苦芪超微粉能夠在一定程度上逆轉環(huán)磷酰胺所致的小鼠的免疫器官指數(shù)的下降，維持機體非特異性免疫功能。一些研究證明，中藥車前草粗多糖能提高環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠血清中溶血素水平，且對脾臟與胸腺萎縮有緩解作用，與本試驗的研究結果一致[11-13]。

3.3 苦芪超微粉對犬細小病毒感染的治療作用

現(xiàn)代研究證明，黃芪主含黃芪多糖、維生素以及多種微量元素等，具有增強免疫和抗病毒作用，苦參主含苦參堿和氧化苦參堿，具有廣譜抗病毒作用，梔子主含環(huán)烯醚萜類、梔子苷等，具有保肝利膽、抗炎、抗氧化、促進胰腺分泌及胃功能保護等作用[14]。腸炎型犬細小病毒感染，主要表現(xiàn)嘔吐、腹瀉、便血、脫水、電解質紊亂等癥狀，治療時除抗病毒、防止電解質紊亂、補液強心、對癥治療外，仍需防止繼發(fā)細菌感染。方中黃芪增強免疫，并與苦參協(xié)同抗病毒，而梔子等則主要起到抗炎和恢復機體胃腸功能的作用。

根據(jù)明代醫(yī)家吳又可的“雜氣”病因學說，犬細小病毒感染屬于“毒邪血痢”[15]。治宜補氣養(yǎng)血、清熱解毒、燥濕止痢?？嘬纬⒎塾牲S芪、苦參和梔子等組成，其中，黃芪性微溫味甘，入脾、肺經(jīng)，功能補氣固表，托毒生肌，利水退腫，主治脾肺氣虛、表虛汗出、瘡癰難潰、水腫；苦參性寒味苦，入心、肝、胃、大腸、膀胱經(jīng)，功能清熱燥濕，祛風殺蟲，利尿，主治濕熱黃疸、瀉痢、疥癬；梔子性寒味苦，入心、肝、肺、胃經(jīng)，功能清熱瀉火，涼血解毒，主治目赤腫痛、濕熱黃疸、熱淋、尿血、衄血[14]。諸藥相合，共湊補氣養(yǎng)血、清熱解毒、燥濕止痢之功。