基于移液器吸頭的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的制備及其性能

馬恩慧，文 學，戴瑩菲，周 潔，吳長宇

（徐州醫(yī)科大學醫(yī)學影像學院，江蘇徐州 221004）

1 引言

參比電極（RE）是一種具有已知恒定電位的電極，能夠為電化學研究對象提供一個電位標準[1-2]，常用的商業(yè)化參比電極有飽和甘汞電極（SCE）、Ag/AgCl電極等。這些電極通常由導線、電極帽、電極絲、玻璃管、電極液、多孔陶瓷等組成，因而體積也比較大，比如常用的飽和甘汞電極的長度通常大于10cm，末端的直徑也在1cm左右。將其用于構(gòu)成三電極體系進行電化學測量時，需要較多的電解液體積（通常需要數(shù)毫升），因此不適用于血液、腦脊液等小體積生物樣本的分析。同時傳統(tǒng)參比電極需要參比內(nèi)液，這必然會造成漏液等問題，一方面會污染樣品，另一方面在其使用過程中需要定期更換內(nèi)液[3-5]。

為減小參比電極的尺寸，解決傳統(tǒng)參比電極漏液的問題，本研究設計并制備了基于移液器吸頭的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極（ASSmRE），以KCl飽和的瓊脂凝膠代替?zhèn)鹘y(tǒng)的參比內(nèi)液[6-7]，優(yōu)化了AgCl的成膜時間，探索了瓊脂凝膠填充方法。同時通過比較，發(fā)現(xiàn)制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極和飽和甘汞電極具有相近的性能，可以用于電化學測試。

2 材料與方法

2.1 材料與設備

氯化鉀、亞鐵氰化鉀、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等試劑（AR）購自國藥集團化學試劑有限公司，銀絲（99.999%）購自國藥集團化學試劑有限公司，瓊脂粉（BR）購自大連美侖生物技術有限公司。

電化學工作站（CHI 760D，上海辰華儀器有限公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；金盤電極（Φ 2mm，天津艾達恒晟科技發(fā)展有限公司）；鉑對電極（上海辰華儀器有限公司）；飽和甘汞電極（上海辰華儀器有限公司）；移液器吸頭（白色，10μL，范德（北京）生物科技有限責任公司）。

2.2 微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的制備

微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的制備過程如圖1所示，包括銀絲的處理、KCl飽和瓊脂溶膠的配制、KCl飽和瓊脂凝膠的填充、微型全固態(tài)參比電極的封裝等步驟。

圖1 微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的制備過程示意圖

2.2.1 銀絲的處理

取約15cm長銀絲，將其一端沒入裝有84消毒液（次氯酸溶液）的玻璃瓶中浸泡。待銀絲表面變成灰白色后取出，用去離子水沖洗干凈并晾干。將銀絲的灰色部分置入小號的移液器吸頭（10μL）內(nèi)，露出的部分纏繞在白色吸頭上端，并用膠帶固定防止銀絲脫落。

2.2.2 KCl飽和瓊脂溶膠的配制

將10mL去離子水加入到燒杯中，置于電爐上加熱，逐漸加入KCl固體，使用玻璃棒攪拌，使溶質(zhì)逐漸溶解，直至溶液中有些許KCl溶質(zhì)不再溶解后停止加入。用電子天平稱取0.36g瓊脂粉，加入到沸騰的KCl溶液中，用玻璃棒攪拌并繼續(xù)加熱保持沸騰，形成KCl飽和瓊脂溶膠。

2.2.3 KCl飽和瓊脂凝膠的填充

使用注射器（去掉針頭）吸取沸騰的KCl飽和瓊脂溶膠，迅速注入置有銀絲的白色吸頭中，可以多次注入瓊脂溶膠，以壓實白色吸頭內(nèi)的瓊脂，待冷卻后即完成吸頭內(nèi)KCl飽和瓊脂凝膠的填充，用作微型全固態(tài)參比電極的導電介質(zhì)。

2.2.4 微型全固態(tài)參比電極的封裝

另取一個白色吸頭，用刀截去其底部。將截去底部的吸頭倒置，和KCl飽和瓊脂凝膠填充后的白色吸頭以“上端對上端”的形式相對接，并將銀絲從截去底部的吸頭中抽出；將704硅橡膠擠入截去底部的吸頭內(nèi)，等待硅膠硬化；將熱縮管套在兩個白色吸頭的對接處，用熱風槍加熱使其逐漸縮緊，以使得兩個白色吸頭牢靠地連在一起；將抽出的銀絲纏繞在銅線的一端，并用電烙鐵焊接起來；最后取直徑合適的熱縮管套在焊錫處，加熱使其縮緊，基于移液器吸頭的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極制作完成。

2.3 微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的性能測試

2.3.1 參比電極的穩(wěn)定性測試及參考電位的確定

本實驗使用CHI 760D電化學工作站，借助循環(huán)伏安法（CV），通過與商業(yè)化的飽和甘汞電極進行對比，測試了該微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的性能。以金電極為工作電極，鉑電極為對電極，分別以飽和甘汞電極以及制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極為參比電極，測得鐵氰化鉀溶液的循環(huán)伏安譜圖，比較其峰電流、峰電位、表觀電位等參數(shù)，同時來確定微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的參比電位。將循環(huán)伏安譜的掃描圈數(shù)設置成10圈，測試連續(xù)掃描時的峰電位和峰電流的變化趨勢，以驗證該微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的穩(wěn)定性。

以微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極作為工作電極，飽和甘汞電極作為參比電極構(gòu)成回路來測量開路電壓（OCP），即微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極和飽和甘汞電極之間的參考電位差。將制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極放置30d，并測試其開路電壓，確定其長期穩(wěn)定性。

2.3.2 不同掃描速度時鐵氰化鉀溶液的電化學響應

以金電極為工作電極，鉑電極為對電極，分別以飽和甘汞電極以及制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極為參比電極，分別測定掃描速度為10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250mV/s時鐵氰化鉀溶液（1mM）的循環(huán)伏安譜，并比較二者的差異。

2.3.3 不同濃度鐵氰化鉀溶液的電化學響應

以飽和甘汞電極為參比電極，在掃描速度保持不變的條件下，改變鐵氰化鉀溶液濃度（1.000、0.889、0.800、0.727、0.667、0.671、0.533、0.500mM），依次進行掃描獲得循環(huán)伏安譜。將飽和甘汞電極換成制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極，同樣獲得上述不同濃度鐵氰化鉀溶液的循環(huán)伏安譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的制備

在微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的制備過程中，使用84消毒液浸泡銀絲的一端，浸泡一段時間后銀絲表面會呈現(xiàn)灰白色。84消毒液的主要成分為次氯酸鈉（NaClO），水解后生成不穩(wěn)定的次氯酸，進而分解為氯化氫等物質(zhì)。因此銀絲表面可能發(fā)生的化學反應是：

而當銀絲浸泡時間過長時會逐漸變成黑色，可能原因有兩個：銀絲氧化為氧化銀而顯黑色；AgCl見光分解生成的Ag顆粒顯黑色。因此浸泡時間選為5min。

在給置入銀絲后的吸頭中注入熱的KCl飽和瓊脂溶膠時，冷卻為固態(tài)的凝膠，但其內(nèi)部以及和吸頭管壁間容易產(chǎn)生氣泡或者間隙，導致實驗過程中離子交換不能順利進行，從而導致所制作的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極出現(xiàn)參考電位穩(wěn)定性不強的問題。優(yōu)化方法是在注入加熱的KCl飽和的瓊脂溶膠時，將洗頭的尖端堵住，然后用注射器將KCl飽和瓊脂溶膠緩慢地注入并壓實，以保證瓊脂溶膠在槍頭中壓實并無氣泡空隙產(chǎn)生。

制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極如圖2所示。在使用時將吸頭的尖端沒入電解質(zhì)溶液作為參比電極，注意液面不要沒過熱縮管，防止溶液爬升，腐蝕銀絲及銅導線，進而污染電極。此外，和其他參比電極類似，需要將微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極浸泡在飽和KCl溶液中儲存?zhèn)溆?，防止干涸產(chǎn)生氣泡。

圖2 微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極實物圖

3.2 微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的性能測試

參比電極通常需要具有穩(wěn)定的電勢，才能保證電化學測量的準確性。在完成微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的制備后，通過與商業(yè)化的飽和甘汞電極對比，使用循環(huán)伏安法研究了該電極的性能。

3.2.1 微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的參比電位

通過與商業(yè)化的飽和甘汞電極進行比對，確定了微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的參比電位[8]。從圖3和表1中可以看出，兩個電極作為參比電極所測出的循環(huán)伏安譜圖，峰電流大小幾乎沒有變化，但峰電位有明顯的不同。當飽和甘汞電極作為參比電極時，鐵氰化鉀溶液的循環(huán)伏安譜圖具有一定的對稱性，表現(xiàn)出可逆的氧化還原特性，其中峰電位差ΔEp為0.151V，表觀電位Eo為0.162V。當用微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極作為參比電極時，鐵氰化鉀的循環(huán)伏安譜圖同樣具有一定的對稱性，ΔEp為0.126V，Eo為0.210V。相對于飽和甘汞電極，微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極作為參比電極時鐵氰化鉀的氧化還原峰電位向正電位方向移動。微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極（ASSmRE）和飽和甘汞電極（SCE）之間的參比電位差可以通過鐵氰化鉀的表觀電位計算得到：

表1 不同參比電極時，鐵氰化鉀循環(huán)伏安譜圖的峰電位參數(shù)的對比

圖3 不同參比電極時，鐵氰化鉀溶液（0.8mM）的循環(huán)伏安譜圖

參比電極為飽和甘汞電極和微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極，掃描速度為50mV/s。

3.2.2 連續(xù)掃描時的穩(wěn)定性測試

將制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極作為參比電極，在鐵氰化鉀中進行了連續(xù)10圈的循環(huán)伏安譜掃描，采集了每次掃描的峰電位和峰電流。如圖4所示，連續(xù)掃描中每次掃描的氧化還原反應的峰電流和峰電位基本保持不變，其中峰電位的大小波動約2mV（0.92%）。因此，微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極在連續(xù)掃描時具有較好的穩(wěn)定性，可以用作參比電極。

金盤電極為工作電極，鉑電極為對電極，制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極為參比電極，掃描速度為50mV/s。

3.2.3 長期穩(wěn)定性測試

制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極需要放置在飽和KCl溶液中，以保持其穩(wěn)定性。本文還研究了微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的長期穩(wěn)定性。以制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極為工作電極，飽和甘汞電極作為參比電極測定其在飽和KCl溶液中的開路電壓[8]。結(jié)果如圖5所示，微型全固態(tài)Ag/AgCl電極電位在100s左右達到穩(wěn)定，與飽和甘汞電極相差48.09mV，與循環(huán)伏安法的結(jié)果一致。圖5中插圖為30d內(nèi)參比電位的變化趨勢圖，結(jié)果顯示微型全固態(tài)Ag/AgCl電極電位在30d內(nèi)波動為0.28mV（0.33%），表明該參比電極穩(wěn)定性良好，可以用于后續(xù)的實驗。

3.2.4 不同掃描速度時鐵氰化鉀溶液的電化學響應

進一步研究了在不同掃描速度下、以微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極為參比電極時鐵氰化鉀溶液的循環(huán)伏安譜，結(jié)果如圖6A所示。結(jié)果表明，鐵氰化鉀溶液的循環(huán)伏安譜中峰電流均隨著掃描速度的增大而增大。以掃描速度為橫坐標，以峰電流為縱坐標作圖（圖6B），可以看出峰電流和掃描速度滿足著一定的線性關系。同時以掃描速度的平方根為橫坐標，以峰電流為縱坐標作圖（圖6C），結(jié)果顯示峰電流與掃描速度的平方根有著很好的線性關系，其擬合方程是ip，1=0.253+41.732×υ1/2（R2=0.997 7） 和ip，2=-2.545-20.149×υ1/2（R2=0.992 4）。 這 表明鐵氰化鉀在電極上的電化學行為是受擴散控制的[9-10]，這和以飽和甘汞電極為參比電極的結(jié)果是一致的。這些結(jié)果也進一步地證明了微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極具有較好的性能。

圖4 在鐵氰化鉀（1mM）中連續(xù)掃描10圈時的循環(huán)伏安譜（A）以及峰電流（B）和峰電位（C）的變化趨勢圖

圖5 在飽和KCl溶液中的開路電壓-時間曲線圖

圖6 不同掃描速度情況下，鐵氰化鉀（1mM）溶液的循環(huán)伏安譜

金盤電極為工作電極，鉑電極為對電極，制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極為參比電極。

3.2.5 不同濃度鐵氰化鉀溶液的電化學響應

本論文還研究了微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極作為參比電極時不同濃度鐵氰化鉀的電化學響應。如圖7A所示，隨著鐵氰化鉀濃度的增加，循環(huán)伏安譜的峰電流也逐漸增加。如圖7B所示，峰電流和鐵氰化鉀濃度呈現(xiàn)著線性關系，即ip,1=0.959+9.076×c（R2=0.993 3） 和ip,2=-0.696-7.570×c（R2=0.983 9）。這些結(jié)果與以飽和甘汞電極為參比電極的結(jié)果是一致的，也說明微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極的性能較好，可以用于電化學實驗。

圖7 在微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極分別作為參比電極時，不同濃度鐵氰化鉀溶液的循環(huán)伏安譜（A）及峰電流與濃度的關系曲線（B）

金盤電極為工作電極，鉑電極為對電極，制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極，掃描速度為50mV/s。

4 結(jié)論

設計并制備了基于移液器吸頭的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極，具有制作方便、價格低廉等特點，解決了傳統(tǒng)參比電極尺寸較大、存在漏液等問題。通過比較發(fā)現(xiàn)，制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極和飽和甘汞電極具有相近的性能，具有較好的短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性，鐵氰化鉀溶液在該參比電極組成的電化學體系中具有良好的電化學響應。因此制備的微型全固態(tài)Ag/AgCl參比電極可以用于電化學測試。