冷凍電鏡熱起來(lái)

谷第

2017年度的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了瑞士洛桑大學(xué)科學(xué)家雅克·杜邦內(nèi)特、美國(guó)哥倫比亞大學(xué)科學(xué)家約阿希姆·弗蘭克和英國(guó)劍橋大學(xué)科學(xué)家理查德·亨德森，以表彰他們?cè)陂_(kāi)發(fā)可以用于研究生物分子高分辨率結(jié)構(gòu)的“冷凍電鏡”技術(shù)方面的杰出貢獻(xiàn)。

說(shuō)起電子顯微鏡，人們或許都不陌生，它是一種分辨率比光學(xué)顯微鏡更高，可以看到光學(xué)顯微鏡下看不到的微觀世界的儀器。那什么是冷凍電鏡呢？總不會(huì)是把電子顯微鏡冷凍起來(lái)吧？這種冷凍電鏡技術(shù)又為什么能夠用于研究生物分子的結(jié)構(gòu)呢？3位科學(xué)家30多年前的研究為什么直到現(xiàn)在才獲得諾貝爾獎(jiǎng)委員會(huì)的青睞呢？下面就讓我們一一揭開(kāi)這些問(wèn)題的答案。

“結(jié)構(gòu)三劍客”

毫無(wú)疑問(wèn)，電子顯微鏡是科學(xué)家用來(lái)探索微觀世界的利器。但微觀世界也不是一概而論的，在尺度上跨越了多個(gè)數(shù)量級(jí)。

通常說(shuō)到生物學(xué)上的微觀世界，人們想到的大概會(huì)是各種寄生蟲(chóng)和細(xì)菌，大小從幾百微米直至幾微米。相比之下，頭發(fā)絲直徑大概是不到100微米。要想看清楚這樣的微觀結(jié)構(gòu)，就要借助光學(xué)顯微鏡。最好的光學(xué)顯微鏡能夠看到細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)，通過(guò)一些特殊技術(shù)甚至能夠看到單個(gè)的蛋白質(zhì)分子。

說(shuō)到物理學(xué)上的微觀世界，人們想到的大概就是分子和原子了。要想“看”到單個(gè)的原子，只有借助掃描隧道顯微鏡或是原子力顯微鏡才行，但這些設(shè)備對(duì)觀測(cè)樣品的限制非常多，實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域比較狹窄。應(yīng)用得更為廣泛的是電子顯微鏡，雖然它不能直接觀測(cè)到單個(gè)的原子，但是對(duì)于光學(xué)顯微鏡下的微觀世界，電子顯微鏡能夠提供更為清晰、分辨率更高、細(xì)節(jié)更為豐富的照片。

近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，生物學(xué)家也有了觀察分子級(jí)別，甚至是原子級(jí)別微觀世界的需求。再?gòu)?fù)雜的細(xì)胞、細(xì)胞器也都是由各種生物分子，特別是蛋白質(zhì)等生物大分子構(gòu)成的，要研究這些蛋白質(zhì)的功能，最直接的方法就是“看到”它們的三維結(jié)構(gòu)，也就是測(cè)定構(gòu)成一個(gè)蛋白質(zhì)分子的成千上萬(wàn)個(gè)原子的三維坐標(biāo)。研究生物大分子結(jié)構(gòu)的科學(xué)就是結(jié)構(gòu)生物學(xué)。

要想測(cè)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可并不容易。蛋白質(zhì)的大小只有幾納米到幾十納米，比細(xì)胞小了1000倍，甚至小于可見(jiàn)光的波長(zhǎng)，因此超越了光學(xué)顯微鏡的極限。為了描述蛋白質(zhì)中各個(gè)原子的坐標(biāo)，就連納米這樣的單位都顯得太“大”了，所以生物學(xué)家使用了“埃”（angstrom）這個(gè)長(zhǎng)度單位，指10-10米，也就是0.1納米。

為了探索“?！边@個(gè)水平上的微觀世界，科學(xué)家發(fā)展出了三種不同的方法，堪稱(chēng)“結(jié)構(gòu)三劍客”。它們之中的老大是X射線(xiàn)晶體學(xué)，通過(guò)X射線(xiàn)在蛋白質(zhì)晶體上的衍射來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。這種方法發(fā)展得最為成熟，應(yīng)用最為廣泛，觀測(cè)到的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分辨率也最高，能夠達(dá)到1埃的水平，清晰地分辨出每一個(gè)原子的準(zhǔn)確位置。但是X射線(xiàn)晶體學(xué)首先需要把蛋白質(zhì)結(jié)晶，而蛋白質(zhì)并不都能老老實(shí)實(shí)地排列成整齊的晶體，因此限制了這種方法的應(yīng)用。

三劍客中的老二是核磁共振方法。這種方法無(wú)需結(jié)晶，可以直接測(cè)定溶液中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但是卻有蛋白質(zhì)大小方面的限制。太大的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的核磁共振譜圖過(guò)于復(fù)雜，重疊嚴(yán)重，變得無(wú)法解讀。另外，由多個(gè)蛋白質(zhì)組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物也難以用核磁共振的方法直接觀測(cè)結(jié)構(gòu)。

結(jié)構(gòu)三劍客中的最后一位就是電子顯微鏡。雖然電子顯微鏡用電子束代替了光束，所以在理論上能夠超越可見(jiàn)光波長(zhǎng)的限制，但在實(shí)際觀察生物大分子結(jié)構(gòu)時(shí)卻遇到了很多困難。本年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)3位得主所做的工作，正是從不同的角度解決這些困難。

二維的晶體

電子顯微鏡研究生物大分子結(jié)構(gòu)的第一個(gè)困難就是電子束本身的強(qiáng)大破壞力。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，電子束中的電子是帶著速度而來(lái)的，如果它們與樣品發(fā)生了相互作用，也就意味著它們“撞”到了樣品上。這個(gè)撞擊產(chǎn)生的能量要樣品自己來(lái)吸收，從而會(huì)導(dǎo)致樣品的毀壞。很多無(wú)生命的樣品在電子束的轟擊之下都會(huì)發(fā)生明顯可見(jiàn)的破壞，更不要說(shuō)脆弱的蛋白質(zhì)了。

怎么辦呢？要說(shuō)辦法也簡(jiǎn)單，誰(shuí)都能想得到，那就是減弱電子束的強(qiáng)度，減弱到不會(huì)明顯破壞蛋白質(zhì)樣品的程度?？墒?，問(wèn)題又來(lái)了：太弱的電子束成像也弱，如何能夠得到清晰的電子顯微鏡成像呢？理查德·亨德森的貢獻(xiàn)就在于此。他本來(lái)是從事X射線(xiàn)晶體學(xué)方法研究的。從這種經(jīng)典方法中，他得到了啟發(fā)，想到可以將二維晶體應(yīng)用于電鏡研究。我們所說(shuō)的晶體，一般都是指三維晶體，其中的原子或分子在任意一個(gè)方向上都是周期排列的。X射線(xiàn)晶體學(xué)方法之所以能夠得到微觀結(jié)構(gòu)信息的宏觀信號(hào)，就是靠周期排列的晶格產(chǎn)生的X射線(xiàn)衍射作用?？墒牵S的晶體太厚，電子束穿透的損耗太大。亨德森讓特定的蛋白質(zhì)形成了二維的晶體，也就是薄薄的一層在水平方向上有序排列的蛋白質(zhì)，再讓電子束去照射它，通過(guò)晶格的衍射來(lái)增強(qiáng)信號(hào)。

1990年，亨德森應(yīng)用二維晶體方法解析得到了細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的三維結(jié)構(gòu)。這種蛋白是一種膜蛋白，我們的眼睛能夠看到光線(xiàn)，依賴(lài)的也正是視紫紅質(zhì)蛋白。略有遺憾的是，在此兩年前，已經(jīng)有結(jié)構(gòu)生物學(xué)家通過(guò)X射線(xiàn)晶體學(xué)的方法解析得到了該蛋白的結(jié)構(gòu)，從而使亨德森與相關(guān)諾貝爾獎(jiǎng)失之交臂。但是，亨德森得到的結(jié)構(gòu)是最早的應(yīng)用電子顯微鏡技術(shù)測(cè)定得到的生物大分子結(jié)構(gòu)。

全息“逮捕照”

我們?cè)跉W美電影中看到不少這樣的情節(jié)：犯罪嫌疑人被警察抓獲之后，都會(huì)舉著自己的名牌在標(biāo)尺墻前照3張照片——正面、左面、右面各一張。毫無(wú)疑問(wèn)，這3張逮捕照的作用就是用來(lái)建立這名犯罪嫌疑人的樣貌檔案，以后如果在其他罪案有關(guān)的影像資料中拍到這個(gè)人，就可以很容易地進(jìn)行比對(duì)識(shí)別了。我們不妨設(shè)想一下，如果不僅是建立一個(gè)人的平面照片檔案，而是要建立一個(gè)人頭部的三維立體模型呢？其實(shí)也不困難，只要360°無(wú)死角地給他拍一系列的頭像照片就行了。如今的計(jì)算機(jī)建模程序已經(jīng)可以輕松完成這樣的任務(wù)。

那么，對(duì)于生物大分子的結(jié)構(gòu)研究，可不可以照搬這個(gè)思路呢？約阿希姆·弗蘭克給出了肯定的答案。他在20世紀(jì)80年代提出并完善了電子顯微鏡單顆粒重構(gòu)技術(shù)，不再需要讓蛋白質(zhì)形成二維的晶體。說(shuō)起來(lái)，二維晶體只是薄薄一層，似乎比形成三維晶體容易了許多，但其實(shí)二維結(jié)晶的難度與三維結(jié)晶并無(wú)太大分別。而單顆粒重構(gòu)技術(shù)，顧名思義只需要單個(gè)蛋白質(zhì)顆粒即可，無(wú)需任何形式的結(jié)晶。

具體來(lái)說(shuō)，弗蘭克首先要給散落在載網(wǎng)上的同一種蛋白質(zhì)分子拍攝電子顯微鏡“照片”。拍照時(shí)，有的蛋白質(zhì)可能是“正面”朝上，有的可能是“底面”朝上，也有可能是“左面”朝上，或者“右面”朝上。如果拍攝足夠多的樣品，有了足夠多的照片之后，弗蘭克就可以得到這種蛋白質(zhì)在各個(gè)不同方向上的“照片”，就好像是全息的“逮捕照”一樣。最后，通過(guò)數(shù)學(xué)計(jì)算的方法就能夠重構(gòu)這種蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型。

你或許會(huì)想到一個(gè)問(wèn)題：蛋白質(zhì)分子不只是表面有原子，里面也有原子，如果只能拍到表面的照片，如何知道里面的結(jié)構(gòu)信息呢？其實(shí)，這里說(shuō)的“照片”并不是真正的照片，因?yàn)樗窃跇悠返紫陆邮盏降碾娮邮干渲笮纬傻耐队坝跋瘛＿@種投影也跟陽(yáng)光下的純黑影子不同，因?yàn)殡娮邮菑牡鞍踪|(zhì)中穿透而過(guò)的，所以受到了蛋白質(zhì)內(nèi)部原子的影響，帶有了內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息。正因?yàn)槿绱耍罱K重構(gòu)出來(lái)的才是蛋白質(zhì)完整的三維結(jié)構(gòu)。

冰的玻璃

亨德森和弗蘭克的貢獻(xiàn)似乎已經(jīng)足以解決用電子顯微鏡研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的問(wèn)題了，但還少了一項(xiàng)重要技術(shù)，也就是冷凍電鏡技術(shù)中的“冷凍”二字，它來(lái)自于雅克·杜邦內(nèi)特的貢獻(xiàn)。

我們都知道，生命離不開(kāi)水?；罴?xì)胞中每時(shí)每刻都發(fā)生著難以計(jì)數(shù)的生物化學(xué)反應(yīng)，其中很多反應(yīng)都有水分子的參與。而這還不是水對(duì)我們的唯一意義。如果我們能夠縮小到原子水平的微觀世界里直接觀察，就會(huì)發(fā)現(xiàn)水溶液中的蛋白質(zhì)表面牢牢地抓著幾層水分子，甚至還有水分子緊密地結(jié)合到蛋白質(zhì)的內(nèi)部。這些水化層就是蛋白質(zhì)表面的潤(rùn)滑劑，是蛋白質(zhì)能夠溶于水并發(fā)揮功能的關(guān)鍵所在?？梢哉f(shuō)，離開(kāi)了水的蛋白質(zhì)就不是蛋白質(zhì)的真實(shí)模樣了。

科學(xué)家希望看到蛋白質(zhì)的真實(shí)模樣，所以核磁共振是在水溶液中測(cè)量的，X射線(xiàn)晶體學(xué)的晶體是在水溶液中形成的，其內(nèi)部充滿(mǎn)了水。然而電子顯微鏡卻有一個(gè)先天的不利因素：為了減低電子束與空氣分子的撞擊帶來(lái)的種種問(wèn)題，電子顯微鏡內(nèi)部必須是絕對(duì)的真空環(huán)境。而在真空環(huán)境中，液態(tài)的水立刻就會(huì)汽化。好在水還有一種固體狀態(tài)，那就是冰。冰可以在低溫下于真空中穩(wěn)定存在?？墒牵灿斜膯?wèn)題。雖然一塊冰整體上不是一個(gè)有序的晶體，但它其實(shí)是由無(wú)數(shù)微小的有序晶體組成的。所以在電子束的照射下，冰也會(huì)產(chǎn)生衍射，擾亂生物大分子本身的成像。

雅克·杜邦內(nèi)特在20世紀(jì)80年代找到了解決這個(gè)問(wèn)題的辦法，那就是讓水形成玻璃態(tài)的冰，也就是水分子仍然呈無(wú)序狀態(tài)的冰。要做到這一點(diǎn)，就要讓樣品迅速降溫，不給它結(jié)晶的時(shí)間。一般科學(xué)實(shí)驗(yàn)中用到低溫環(huán)境時(shí)都會(huì)選擇液氮，它化學(xué)上穩(wěn)定，成本低，溫度也足夠低。但液氮卻無(wú)法滿(mǎn)足杜邦內(nèi)特的要求，因?yàn)樗臒崛萘刻。唤佑|常溫的樣品就被加熱汽化了，在樣品周?chē)纬梢粋€(gè)氮?dú)獾母魺釋?，阻止了進(jìn)一步的快速降溫。最終，杜邦內(nèi)特選擇了熱容量足夠大的液態(tài)乙烷，能夠讓樣品瞬間降到接近零下200℃的溫度，形成玻璃態(tài)的冰。這種方法一直延用至今，仍是用電子顯微鏡研究生物大分子結(jié)構(gòu)時(shí)的最佳制樣方法。

向“?！笨繑n

許多人或許會(huì)好奇：這3位科學(xué)家的貢獻(xiàn)都已經(jīng)是三四十年前的事情了，為什么諾貝爾獎(jiǎng)委員會(huì)直到現(xiàn)在才頒獎(jiǎng)給他們？事實(shí)上，雖然通過(guò)3位科學(xué)家的努力，冷凍電鏡三維重構(gòu)技術(shù)被用于蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)研究，但是其分辨率一直比較低，徘徊在10埃以下，只有個(gè)別結(jié)構(gòu)能夠接近X射線(xiàn)晶體學(xué)的水平。而X射線(xiàn)晶體學(xué)的結(jié)構(gòu)則能夠輕松達(dá)到3埃以上的近原子分辨率水平。由于冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的分辨率太低，無(wú)法精確定位原子坐標(biāo)，無(wú)法提供結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，其應(yīng)用就被大大限制了。

這種境況一直到近兩三年來(lái)才有明顯的改觀，而其來(lái)源仍是技術(shù)的進(jìn)步。在眾多電鏡技術(shù)的改進(jìn)之中，最為重要的或許就是華人科學(xué)家程亦凡等人開(kāi)發(fā)成功的直接對(duì)電子束成像的元器件。這種成像方式拋棄了原來(lái)通過(guò)接收電子束轟擊來(lái)顯像的熒光屏，改由微電子元件直接感受電子流，就像用CCD感受光線(xiàn)一樣，從而大大提高了成像的清晰度，而且使得即時(shí)成像成為可能。有了即時(shí)成像技術(shù)，科學(xué)家就可以拍攝一段電子顯微成像的視頻，再分解成一幀幀的靜止畫(huà)面，把這些畫(huà)面重新校準(zhǔn)疊合，就能夠有效解決樣品在拍攝過(guò)程中的漂移問(wèn)題，相當(dāng)于相機(jī)用上了數(shù)碼防抖功能，從而進(jìn)一步提高了圖像的清晰度。在這一系列新技術(shù)的推動(dòng)之下，冷凍電鏡方法的分辨率終于開(kāi)始向“?！钡乃娇繑n。

2013年，程亦凡等人應(yīng)用新技術(shù)解析了人體感受溫度的關(guān)鍵蛋白質(zhì)——辣椒素受體的三維結(jié)構(gòu)，向科學(xué)界展示了新型冷凍電鏡技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的美好前景。此后，越來(lái)越多的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家開(kāi)始嘗試使用冷凍電鏡技術(shù)來(lái)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并產(chǎn)出了一批高分辨率的重要結(jié)構(gòu)成果。比如像剪切體這樣的細(xì)胞器，因?yàn)檫^(guò)于巨大，在晶體學(xué)研究中被認(rèn)為是不可能結(jié)晶的，而清華大學(xué)的施一公團(tuán)隊(duì)利用冷凍電鏡技術(shù)已經(jīng)成功解析了它的三維結(jié)構(gòu)。在這種生物大分子組成的巨大“分子機(jī)器”的結(jié)構(gòu)研究方面，冷凍電鏡技術(shù)擁有著X射線(xiàn)晶體學(xué)和核磁共振技術(shù)都難以企及的巨大優(yōu)勢(shì)。

如今，冷凍電鏡三維重構(gòu)是結(jié)構(gòu)生物學(xué)界最為炙手可熱的研究方向。程亦凡、施一公等人的工作雖然沒(méi)有為他們自己帶來(lái)諾貝爾獎(jiǎng)，卻間接促成諾貝爾獎(jiǎng)花落電鏡領(lǐng)域?？梢韵胍?jiàn)，這次頒獎(jiǎng)必然會(huì)進(jìn)一步喚起科學(xué)界對(duì)于冷凍電鏡技術(shù)的重視與熱情?，F(xiàn)在，大多數(shù)冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的分辨率仍然在3埃左右，只有個(gè)別案例能夠達(dá)到2埃左右，但隨著更多新技術(shù)新方法的涌現(xiàn)，它必然會(huì)堅(jiān)定地朝著1埃的原子分辨率水平邁進(jìn)，成為與X射線(xiàn)晶體學(xué)同等重要的結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法。

【責(zé)任編輯】龐 云