固本增骨方含藥血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響

宋敏 鞏彥龍 董萬(wàn)濤 劉小鈺 董平,3 黃凱 王凱

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020 3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010

在全世界老齡化的背景下，老年性骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)的發(fā)病率呈遞增趨勢(shì)，其中絕經(jīng)后OP性骨折的終生風(fēng)險(xiǎn)可能在13%～25%，并且隨著壽命的增長(zhǎng)而增加了骨折的風(fēng)險(xiǎn)[1]。多種因素影響了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)的分化[2]，而OP發(fā)生、發(fā)展與OB及破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)調(diào)控的骨代謝動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)密切相關(guān)。目前，治療OP的西藥在治療的同時(shí)又有某種不理想因素；而中醫(yī)藥通過(guò)中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)，對(duì)人體機(jī)能的全方位調(diào)節(jié)防治OP，療效顯著、副作用小，對(duì)OP的防治有積極作用。本研究通過(guò)定向誘導(dǎo)BMSCs向OB分化模型，運(yùn)用固本增骨方含藥血清對(duì)其定向分化過(guò)程的干預(yù)，以觀察固本增骨方含藥血清對(duì)該過(guò)程的影響并闡明影響該過(guò)程的可能機(jī)理。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物與細(xì)胞：SPF級(jí)3月齡Wistar大鼠30只，體重(200±20) g；Wistar大鼠BMSCs(貨號(hào)：RAWMX-01001，規(guī)格：1×106個(gè)細(xì)胞/管；凍存代次：P1；保存條件：液氮)。

1.1.2主要藥品與試劑：購(gòu)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的固本增骨方，制成藥粉后配成25 g/L混懸液。濃度為0.1%的明膠(貨號(hào)：RAWMX-90011，RAWMX-90021，T170313G001)。SDS-PAGE試劑盒、茜素紅(批號(hào)：20170802，p1200，T170512G001)。購(gòu)于GeneTex公司的BGP兔多克隆抗體(批號(hào)：821703974)，購(gòu)于ImmunoWay公司的Runx2兔多克隆抗體、GAPDH(批號(hào)：B4135，B5601)。

1.1.3主要儀器：凝膠電泳儀、凝膠成像分析儀(美國(guó) Bio-rad公司生產(chǎn)，PowerPoc Basic，ChemiDocTMXRS+)及PCR熒光定量?jī)x(C1000)。

1.2方法

1.2.1固本增骨方含藥血清的制備：上述動(dòng)物按隨機(jī)表法分為空白血清組和含藥血清組(各15只)，后者以10 mL/kg劑量、2次/d灌胃，前者給予等量生理鹽水，干預(yù)一周后心臟取血，離心取上清滅火、除菌后備用。

1.2.2Wistar大鼠BMSCs的培養(yǎng)：BMSCs經(jīng)復(fù)蘇，培養(yǎng)后重懸，臺(tái)盼藍(lán)染色觀察適宜密度為3.0×104個(gè)活細(xì)胞/cm2，將細(xì)胞接種分瓶后在條件適宜的培養(yǎng)箱中傳代，最終培養(yǎng)出符合實(shí)驗(yàn)要求BMSCs。

1.2.3分組與造模：將傳至P3代BMSCs分為空白血清組、傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組、傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)+不同濃度(5%、10%、20%、30%)含藥血清組。將上述細(xì)胞接種于相應(yīng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，并依次按實(shí)驗(yàn)分組分別加入空白血清、傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)液及傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)液+各濃度含藥血清繼續(xù)培養(yǎng)。從24 h后開(kāi)始連續(xù)5 d測(cè)量各組細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.4茜素紅染色：4周后甲醛固經(jīng)茜素紅染色后，光鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)數(shù)。

1.2.5細(xì)胞BGP、Runx2蛋白表達(dá)檢測(cè)：提取各組細(xì)胞總蛋白保存后備用，每組BGP、Runx2蛋白檢測(cè)均按照WB標(biāo)注操作步驟進(jìn)行，并分析各組條帶，所得灰度值與內(nèi)參比較得到BGP、Runx2的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6細(xì)胞BGP、Runx2 mRNA表達(dá)的檢測(cè)：TRIZOL法提取各組總RNA、測(cè)定含量。取總RNA 2μg，逆轉(zhuǎn)錄合成規(guī)范操作第一鏈cDNA。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度150 bp、86 bp、51 bp分別對(duì)應(yīng)GAPDH、BGP、Runx2。按熒光定量試劑盒操作流程行RT-PCR反應(yīng)及PCR擴(kuò)增。將所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1BMSCs培養(yǎng)結(jié)果

細(xì)胞傳至第三代時(shí)可見(jiàn)其呈順向排列生長(zhǎng)，并且生長(zhǎng)良好，見(jiàn)圖1。

圖1 P1、P2、P3代BMSCs鏡下形態(tài) A：P1代BMSCs培養(yǎng)5 d(×10)；B：P2代BMSCs培養(yǎng)5 d(×10)；C：P3代BMSCs培養(yǎng)5 d(×10)。Fig.1 Microscopic morphology of P1, P2 and P3 BMSCs. A: P1 BMSCs were cultured for 5 days (× 10); B: P2 BMSCs were cultured for 5 days (× 10); C: P3 BMSCs were cultured for 5 days (× 10).

2.2各組細(xì)胞茜素紅染色結(jié)果比較

鏡下觀察可見(jiàn)傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組紅色鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯多于空白組；含藥血清組(5%、10%、20%)隨著濃度增加，紅色鈣結(jié)節(jié)數(shù)量也逐漸增加，尤其濃度在20%時(shí)，紅色鈣結(jié)節(jié)數(shù)量最為顯著，且顯著高于空白組與傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組，當(dāng)濃度增加到30%時(shí)，鈣結(jié)節(jié)數(shù)量呈下降趨勢(shì)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞茜素紅染色結(jié)果(×40) A：5%含藥血清組；B：10%含藥血清組；C：20%含藥血清組；D：30%含藥血清組；E：空白血清組；F：傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組。Fig.2 Alizarin red staining results of cells in each group (×40). A: 5% drug-containing serum group; B: 10% drug-containing serum group; C: 20% drug-containing serum group; D: 30% drug-containing serum group; E: Blank serum group; F: Traditional osteogenesis induction group.

2.3各組細(xì)胞BGP、Runx2蛋白表達(dá)比較(圖3，表1)

2.4各組細(xì)胞BGP、BGP mRNA表達(dá)比較(表2)

3 討論

年齡增長(zhǎng)骨量和骨骼強(qiáng)度下降，在老年以后伴隨著量減少和骨骼強(qiáng)度下降后骨細(xì)胞死亡增快而骨細(xì)胞新生相對(duì)減少，這包括OC導(dǎo)致的破骨細(xì)胞作用占主要地位，而OB的成骨作用減低，并且導(dǎo)致骨細(xì)胞死亡是多因素作用的結(jié)果[3]。老年婦女中的OP患者因OP可直接導(dǎo)致髖部骨折及椎體壓縮性骨折，對(duì)于大多數(shù)患有骨質(zhì)疏松癥的婦女來(lái)說(shuō)，早起治療具有積極的意義[4]。BMSCs是有著多向分化潛能的干細(xì)胞，在細(xì)胞因子、基因等因素的作用下其可以分化為OB[5]，而調(diào)上述因素對(duì)BMSCs調(diào)節(jié)異常將導(dǎo)致骨量丟失和OP發(fā)生[6]。研究顯示，BMSCs的異常分化能促進(jìn)或抑制骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[7]。

圖3 各組細(xì)胞BGP、Runx2蛋白表達(dá)注：A、B、C、D分別為5%、10%、20%、30%含藥血清組；E為空白血清組；F為傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組Fig.3 Expression of BGP and Runx2 in cells of each group

組別BGP/GAPDHRunx2/GAPDH5%含藥血清組0.76±0.04Δ0.88±0.08Δ10%含藥血清組0.85±0.07Δ1.00±0.03Δ20%含藥血清組1.04±0.11Δ▲1.10±0.05Δ▲30%含藥血清組0.82±0.02Δ0.85±0.09Δ空白組0.72±0.050.81±0.14傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組0.74±0.04Δ0.83±0.01ΔF值10.0515.770P值0.0010.006

注：與空白組比較，ΔP<0.01；與5%、10%、30%含藥血清組及傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組比較，▲P<0.01。

組別BGPRunx25%含藥血清組1.82±0.24Δ1.24±0.29Δ10%含藥血清組2.05±0.32Δ1.6±0.18Δ20%含藥血清組2.95±0.22Δ▲2.18±0.20Δ▲30%含藥血清組1.68±0.191.06±0.15Δ空白組1.00±0.001.00±0.00傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組1.63±0.30Δ1.02±0.27ΔF值10.51011.898P值0.0000.000

注：與空白組比較，ΔP<0.01；與5%、10%、30%含藥血清組及傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組比較，▲P<0.01。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，大鼠P1代BMSCs復(fù)蘇后鏡下觀察可見(jiàn)呈短梭形貼壁生長(zhǎng)；BMSCs培養(yǎng)符合實(shí)驗(yàn)要求。茜素紅可識(shí)別細(xì)胞內(nèi)的鈣鹽[8]，本實(shí)驗(yàn)中BMSCs經(jīng)28 d成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后行茜素紅染色，鏡下見(jiàn)紅色鈣結(jié)節(jié)數(shù)量隨含藥血清濃度增加(5%、10%、20%)而增加，在濃度為20%時(shí)紅色鈣結(jié)節(jié)數(shù)量最多，并且明顯多于空白組與傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組，但當(dāng)含藥血清濃度為30%時(shí)，紅色鈣結(jié)節(jié)數(shù)量下降，這與最佳藥物濃度有關(guān)。非膠原蛋白BGP可特異性地標(biāo)志骨形成，在骨形成、維持骨量、骨重塑時(shí)，BGP的重要作用是一方面其能抑制異常羥磷灰石結(jié)晶的形成，另一方面其能促進(jìn)軟骨的礦化速率[9]。Komori等[10]首次報(bào)道了由于缺乏Runx2因子而引起成骨細(xì)胞不成熟，進(jìn)而缺乏膜內(nèi)和軟骨內(nèi)骨化。Runx2在骨形成期間調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化，是BMSCs成骨分化的關(guān)鍵因子及骨形成的標(biāo)志基因[11]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，BGP、Runx2基因及蛋白的表達(dá)在20%濃度含藥血清組達(dá)水平呈現(xiàn)峰值。由本研究結(jié)果可見(jiàn)，固本增骨方含藥血清能通過(guò)促進(jìn)BMSCs中BGP、Runx2基因轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，并且當(dāng)含藥血清濃度為20%時(shí)這種誘導(dǎo)作用較明顯。

從20世紀(jì)60年代，更年期和骨質(zhì)疏松之間的聯(lián)系首次被確認(rèn)，此后雌激素治療OP成為預(yù)防骨丟失的重要措施之一[12]。截至目前，基于對(duì)骨生物學(xué)的理解，西醫(yī)對(duì)OP的治療主要包括抑制骨吸收藥及促進(jìn)骨形成藥，對(duì)因治療方法單一并且在一定方面不理想。中藥在“整體觀、辨證論治”指導(dǎo)治療OP時(shí)，著眼于對(duì)機(jī)體整個(gè)機(jī)能的調(diào)節(jié)，標(biāo)本兼顧，取得了良好的療效。固本增骨方是甘肅中醫(yī)藥大學(xué)宋敏教授基于中醫(yī)理論從“脾腎”論治而治療OP多年的經(jīng)驗(yàn)方，由炙黃芪、白條黨參、岷當(dāng)歸、炙淫羊藿、燙狗脊、鹽補(bǔ)骨脂組成，諸藥合用，能益氣健脾、補(bǔ)腎壯骨、活血通絡(luò)之功效，標(biāo)本兼顧[13]，能有效緩解老年脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松癥狀。