原頭蚴外泌體對(duì)樹突狀細(xì)胞活化和細(xì)胞因子分泌的影響

李宗吉，梁錦屏

（1. 寧夏醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 臨床病原生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750004；3. 寧夏醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004）

包蟲病是由棘球絳蟲的幼蟲感染并寄生于人、家畜及嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)的一種呈世界性分布的人畜共患寄生蟲病，該病嚴(yán)重危害農(nóng)牧業(yè)地區(qū)人畜健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。就目前而言，研制包蟲病疫苗，進(jìn)行免疫預(yù)防是控制包蟲病傳播的最為理想的方法[1-3]。在寄生蟲病的防治研究中，無(wú)論是篩選具有早期診斷價(jià)值的分子，還是尋找抗包蟲病新型藥物作用的靶點(diǎn)及疫苗分子，均是以對(duì)寄生蟲與宿主免疫反應(yīng)的分子基礎(chǔ)及機(jī)理等各個(gè)過(guò)程的深入研究為基礎(chǔ)。細(xì)粒棘球蚴感染宿主產(chǎn)生的免疫應(yīng)答機(jī)制極為復(fù)雜，成囊及囊泡對(duì)棘球蚴的存活、長(zhǎng)期穩(wěn)定寄生宿主、持續(xù)感染至關(guān)重要。另一方面細(xì)粒棘球蚴能長(zhǎng)期寄生于宿主體內(nèi)，必然產(chǎn)生了有效的逃逸機(jī)制，涉及蟲體與宿主免疫系統(tǒng)的細(xì)胞通訊及其引發(fā)的細(xì)胞免疫。目前，國(guó)內(nèi)外已陸續(xù)開展了相關(guān)研究工作，認(rèn)為包囊內(nèi)的原頭蚴所表達(dá)和分泌的成分在蟲體不同發(fā)育方向、棘球絳蟲侵入宿主、寄生蟲與宿主之間的相互作用，以及蟲體免疫逃避中發(fā)揮著重要作用[4-6]。寄生蟲在宿主體內(nèi)的寄生機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)有研究表明，毛滴蟲、瘧原蟲、弓形蟲、錐蟲和血吸蟲等多種寄生蟲均可分泌外泌體，稱為蟲源外泌體。外泌體是細(xì)胞間信息交流的重要途徑之一，其在抗原提呈、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。蟲源外泌體可以作為寄生蟲與宿主之間聯(lián)系的紐帶，一方面，寄生蟲在多種機(jī)制刺激下產(chǎn)生外泌體，外泌體包裹著大量蟲源性信息進(jìn)入宿主體液及細(xì)胞內(nèi)，調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng)，抑制炎癥反應(yīng)，改善其寄生環(huán)境；另一方面，外泌體可直接攜帶有毒有害物質(zhì)進(jìn)入宿主循環(huán)系統(tǒng)。不同蟲源外泌體成分不同，作用機(jī)制也不盡相同。如弓形蟲感染后釋放的外泌體能刺激樹突狀細(xì)胞（DCs）成熟，進(jìn)而激活Th1 調(diào)節(jié)的弓形蟲特異性免疫反應(yīng)，從而提高抗感染能力[8]；布氏錐蟲分泌外泌體抑制宿主DCs 的成熟和活化從而導(dǎo)致了錐蟲耐受[9]。但由于包蟲生活史較為復(fù)雜，包蟲的相關(guān)研究相對(duì)還較為滯后，包蟲外泌體蛋白質(zhì)及其miRNA 成分對(duì)宿主免疫效應(yīng)尚未明確，尤其是外泌體被DC 吞噬后外泌體成分對(duì)DCs 靶細(xì)胞分化、成熟及細(xì)胞因子分泌的作用尚未見報(bào)道。本研究旨在探討囊型包蟲原頭蚴（Protoscoleces，PSC）分泌的外泌體（Protoscoleces exosome，PE）的生物學(xué)特性及其對(duì)DCs 活化和細(xì)胞因子分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 PE 提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）、IL-10、TNF-α和IL-12 的ELISA 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Sigma 公司；青霉素、鏈霉素購(gòu)自美國(guó)GIBICO 公司；抗小鼠FITC-CD11c、 PE-CD86、 PerCP-CD80、 FITC-CD40、APC-MHCⅡ及其同型對(duì)照，均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；CD11c分離試劑盒，Cytometric bead array kit 購(gòu)自美國(guó)BD 公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天公司。Guava easyCyte?流式儀購(gòu)自美國(guó)Millipore-Sigma 公 司。6 周 齡～8 周 齡 雄 性ICR 小 鼠，體 質(zhì) 量（18±2）g，購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。從寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科包蟲病患者手術(shù)摘除的完整包囊中無(wú)菌條件下抽取囊液，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PE 的提取和鑒定 取囊液上清，12 000 r/min 離心30 min 去除細(xì)胞碎片，按照PE 提取試劑盒的步驟從上清中提取PE，PBS 重懸后取10 μL 的PE 重懸液滴加至銅網(wǎng)上，室溫靜置10 min后用濾紙吸去多余液體，滴加1%的醋酸雙氧鈾，室溫染色5 min，待完全干燥后于掃描電鏡下觀察其形態(tài)和大小。同時(shí)，將提取的PE 沉淀中加入去離子水15 mL，充分搖晃懸浮，轉(zhuǎn)移入100 ku 超濾離心管，4 000 r/min 30 min，離心2 次，提取超濾后的濃縮液即為原頭蚴外泌體超濾裂解物（Protoscoleces exosome lysates，PEL）。

1.3 DCs 分選及抗原刺激培養(yǎng) ICR 小鼠頸椎脫臼迫殺后無(wú)菌取脾臟，加入2 mL PBS 后勻漿，200 目尼龍膜過(guò)濾，濾液加5 倍紅細(xì)胞裂解液溶解紅細(xì)胞，2 000 r/min 離心5 min 后棄上清，用PBS 洗滌2次，制備脾單細(xì)胞懸液。采用CD11c分離試劑盒分選DC，利用流式細(xì)胞儀鑒定其純度＞90%的留存?zhèn)溆?。將分選獲得的CD11c DCs 細(xì)胞懸液（5×106個(gè)/mL），100 μL/孔加至24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板。分為L(zhǎng)PS 刺激組、PE 刺激組、PEL 刺激組和PBS 陰性對(duì)照組，分別加入100 μL 的LPS、PE、PEL 及等體積PBS，使LPS 終濃 度 為1 μg/mL，PE 和PEL 終 濃 度 均 為10 μg/mL。RPMI1640 培養(yǎng)基加至1 mL，每組設(shè)重復(fù)孔，5%CO237 ℃培養(yǎng)24 h，收集上清及培養(yǎng)后的DCs，備用。

1.4 DCs 表型測(cè)定 利用PBS 重懸1.3 中收集的DCs，分別加入10 μL FITC-CD11c、PE-CD86、PerCPCD80、FITC-CD40、APC-MHCⅡ抗體，同時(shí)設(shè)置不加抗體的空白對(duì)照。避光孵育30 min，用流式染色緩沖液洗滌，每管各加入100 μL 流式緩沖液重懸細(xì)胞，用Guava easyCyte?流式儀檢測(cè)不同組抗原刺激培養(yǎng)后DCs 表面表達(dá)的CD40、CD80、CD86、MHCⅡ分子水平。

1.5 ELISA 方法分析IL-6、IL-10、TNF-α和IL-12含量 收集1.3中各DCs抗原刺激細(xì)胞的培養(yǎng)上清，利用相應(yīng)ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞上清中IL-6、IL-10、TNF-α和IL-12含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用（-X±S）表示，計(jì)量資料采用t-test 檢驗(yàn)，p＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 原頭蚴PE形態(tài)觀察 掃描電鏡下觀察可見PE為形狀大小較為均一的圓形或橢圓形單層囊泡結(jié)構(gòu)。直徑約30 nm～200 nm，平均直徑90 nm，有完整脂質(zhì)包膜。符合PE 的標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)結(jié)構(gòu)（圖1）。表明分離得到原頭蚴PE，且數(shù)量較多。

2.2 DCs 細(xì)胞分離 采用CD11c 分離試劑盒分選DCs，流式細(xì)胞儀鑒定其純度為91.63%（圖2）。表明得到較為純凈的DCs，可以用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 DCs 表型測(cè)定結(jié)果 利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組DCs 表型，結(jié)果顯示，PE 組DCs 表面表達(dá)CD40、CD80、CD86、MHCⅡ的比例分別為（42.23±2.74）%、（61.08±3.54）%、（54.62±1.56）%、（59.62±1.04）%，PEL 組DCs 表面表達(dá)CD40、CD80、CD86、MHCⅡ的比例為（56.12±4.32）%、（76.56±3.54）%、（65.32±2.15）%、（68.35±2.65）%，PEL 組結(jié)果明顯高于PE組，兩組較PBS 組的（29.1±4.62）%、（28.81±6.54）%、（27.37±2.65）%、（26.83±2.51）%均顯著升高（p＜0.05），3 組均低于LPS 組（61.33±4.25）%、（81.23±2.42）%、（76.12±1.96）%、（79.15±2.55）（圖3）。PEL組DCs 表達(dá)MHCⅡ和共刺激分子（CD40、CD80、CD86）水平高于PE 組。表明PEL 組比PE 組能更為有效的刺激DCs 活化和成熟。

圖1 原頭蚴PE 的電鏡照片（放大倍數(shù)5×104）Fig.1 Electron microscopic photographs of protoscoleces exosome(Magnification ratio 5×104)

圖2 FACS 檢測(cè)分離DCs 表面CD11c 陽(yáng)性率Fig.2 Percentage of CD11c positive DCs tested by FACS

圖3 DCs 表型CD40、CD80、CD86、MHCⅡ測(cè)定結(jié)果Fig.3 Determination of DCs phenotype CD40,CD80,CD86 and MHCⅡ

2.4 細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果 利用ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組培養(yǎng)細(xì)胞上清中細(xì)胞因子含量，IL-6測(cè)定結(jié)果顯示，PBS、PE、PEL、LPS 組DCs 培養(yǎng)上清中，PE組＞PEL 組＞LPS 組＞PBS 組，PE 組IL-6 的含量顯著高于PBS、PEL、LPS 組（p＜0.05），PEL 和LPS 組均明顯高于PBS 組，但兩組間無(wú)顯著性差異；IL-10 測(cè)定結(jié)果顯示，LPS組＞PE組＞PEL組＞PBS組，PE組和LPS組明顯高于PBS 和PEL 組，PEL 組高于PBS 組，PE 組和LPS 組（p＜0.05）無(wú)顯著性差異；IL-12 測(cè)定結(jié)果顯示，LPS 組＞PEL 組＞PE 組＞PBS 組，4 組間均有顯著性差異（p＜0.05）；TNF-α測(cè)定結(jié)果顯示，LPS 組＞PEL 組＞PE 組＞PBS 組，4 組間均有顯著性差異（p＜0.05）（圖4）。表明PEL 可更有效刺激DCs 生成Th1 類細(xì)胞因子（IL-12、TNF-α），PE 可更有效刺激DCs 生成Th2類細(xì)胞因子（IL-10、IL-6）。

圖4 PBS、PE、PEL、LPS 組IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α細(xì)胞因子水平Fig.4 Expression level of IL-6,IL-10,IL-12,and TNF-α

3 討 論

各種病原體感染所釋放的PE 中包含有病原體特異性蛋白，一方面可作為病原體感染特異性診斷標(biāo)志物，另一方面PE 中的抗原直接暴露于宿主的免疫系統(tǒng)，具有很強(qiáng)的抗原性，能夠調(diào)節(jié)宿主局部及全身產(chǎn)生免疫反應(yīng)，對(duì)于逃避宿主的免疫攻擊，以保障蟲體的生長(zhǎng)分化、營(yíng)養(yǎng)代謝和增殖、以及蟲體的存活十分重要。 例如在瘧原蟲感染中，PE 可攜帶瘧原蟲特異抗原，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗體[10]；在利什曼蟲感染中，發(fā)現(xiàn)PE 含有糖酵解酶有助于寄生蟲在宿主體內(nèi)的存活及播散[11]。與蛋白質(zhì)類似，病原體PE 含有特異性的核酸物質(zhì)，其中最主要的物質(zhì)為miRNA，PE 被認(rèn)為是“miRNA 運(yùn)輸載體”，exosomal miRNA 在細(xì)胞外環(huán)境中比游離miRNA 更加穩(wěn)定，且PE miRNA 可介導(dǎo)細(xì)胞通訊，能特異性抑制靶細(xì)胞中的靶基因表達(dá)[12]。Exosomal miRNA 可被DCs、單核、巨噬細(xì)胞等靶細(xì)胞攝入，釋放其中的microRNA，從而調(diào)控靶細(xì)胞分化及其免疫功能。病原體來(lái)源的exosomal microRNA 可以被抗原遞呈細(xì)胞（APC）內(nèi)攝繼而抑制靶細(xì)胞內(nèi)mRNA 的基因表達(dá)而影響APC 的免疫功能，極有可能是病原體源性PE 誘導(dǎo)免疫逃逸的原因之一[13-14]。DCs 是已知功能最強(qiáng)且惟一能激活幼稚T 淋巴細(xì)胞的專職APC。在寄生蟲感染中，一方面DCs 是機(jī)體產(chǎn)生抵抗寄生蟲免疫反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，另一方面寄生蟲也大都是通過(guò)影響DC的正常功能而完成免疫逃避[15]。不同來(lái)源的寄生蟲致敏DCs 后，成熟DC 誘導(dǎo)T 細(xì)胞活化，使之向效應(yīng)性T 細(xì)胞分化以增強(qiáng)抗感染免疫應(yīng)答，而未成熟DC則誘導(dǎo)T 細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受，其主要機(jī)制之一就是使T 細(xì)胞向CD4+CD25+Treg 細(xì)胞方向分化[16]。目前，病原體分泌的PE 在細(xì)胞免疫功能中的作用，仍然處于研究起步階段，可能既具有激活細(xì)胞免疫功能，又可能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫耐受導(dǎo)致免疫逃逸[17]。

本研究分離獲得原頭蚴蟲體分泌至體外的蟲源PE，采用電鏡技術(shù)觀察了PE 的形態(tài)結(jié)構(gòu)。為了探索PE 中蛋白質(zhì)和miRNA 成分可能在機(jī)體免疫反應(yīng)中的作用，本研究采用去離子水低滲裂解PE，結(jié)合超濾離心技術(shù)，從而去除PE 中的miRNA 成分，保留PE 的囊壁蛋白成分。利用PE 和加工處理的PEL成分分別刺激DCs，觀察其對(duì)DCs 表型和細(xì)胞因子分泌的影響，初步分析PE 主要成分在DCs 活化和免疫調(diào)節(jié)中的作用。研究中發(fā)現(xiàn)：PE和PEL成分都可有效刺激DCs 高表達(dá)CD40、CD80、CD86、MHCⅡ分子，這些分子為DCs 活化成熟的標(biāo)志性分子。PEL 上調(diào)CD40、CD80、CD86、MHCⅡ表達(dá)的作用明顯高于PE，表明通過(guò)去除miRNA成分之后的PE 蛋白質(zhì)成分能更有效刺激DCs 活化和成熟，而成熟的DCs 可將抗原遞呈并活化T 細(xì)胞，同時(shí)成熟DCs 可分泌多種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)Th 細(xì)胞，在機(jī)體抗感染過(guò)程中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，PEL刺激組DCs細(xì)胞分泌IL-12、TNF-α水平顯著高于PE 組，表明PEL除了誘導(dǎo)DCs 活化成熟以外，還能促進(jìn)DCs 高分泌細(xì)胞因子IL-12、TNF-α，這類細(xì)胞因子能誘導(dǎo)Th向Th1 型細(xì)胞分化，激活細(xì)胞免疫應(yīng)答，有利于機(jī)體免疫清除寄生蟲感染。而含有miRNA 成分的PE激活DCs 的能力明顯低于PEL，而且其刺激DCs 分泌的IL-12、TNF-α水平較PEL 相對(duì)較低，而具有免疫抑制功能的IL-6、IL-10 細(xì)胞因子的水平明顯高于PEL 組，提示PE 含有的miRNA 成分很可能通過(guò)對(duì)DCs 分化及基因表達(dá)譜產(chǎn)生負(fù)向調(diào)節(jié)，抑制Th1型免疫反應(yīng)，參與蟲體的免疫逃逸。

本研究初步開展體外DCs 刺激試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PE 可有效激活DCs 并促使其分泌細(xì)胞因子，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答作用，這為包蟲病疫苗設(shè)計(jì)提供了參考依據(jù)。通過(guò)對(duì)PE 進(jìn)一步的加工處理，對(duì)比發(fā)現(xiàn)：去除PE 的miRNA 成分可加強(qiáng)其激活細(xì)胞免疫功能，更有效地發(fā)揮其抗感染免疫應(yīng)答反應(yīng)的特異性；也提示PE miRNA 可能參與蟲體的免疫逃逸過(guò)程。后續(xù)研究還需進(jìn)一步分析、鑒定PE 的成分，并深入探索其在免疫調(diào)節(jié)中的作用。通過(guò)這些研究使PE 這種易于操作、調(diào)控、含有病原體特異性成分的亞細(xì)胞單位，能夠?yàn)槿嬲J(rèn)識(shí)包蟲感染中蟲體與宿主通訊方式及免疫機(jī)理，尤其是免疫逃逸奠定基礎(chǔ)，并為病原體感染中的臨床診斷、免疫治療、藥物和疫苗的開發(fā)提供了新的思路。同時(shí)這些信息也可能豐富慢性感染免疫學(xué)知識(shí)。